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En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Dos técnicas para aislar las gotas de lípidos celulares de 1) las células de levadura y 2) se presentan placentas humanas. La pieza central de ambos procedimientos es la centrifugación en gradiente de densidad, donde la capa flotante resultante que contiene las gotas puede ser visualizado fácilmente por el ojo, se extrae, y se cuantifica por análisis de Western Blot para la pureza.

Resumen

Gotitas de lípidos son orgánulos dinámicos que se pueden encontrar en la mayoría de las células procariotas eucariotas y ciertos. Estructuralmente, las gotitas consisten en un núcleo de lípidos neutros rodeadas por una monocapa de fosfolípidos. Una de las técnicas más útiles en la determinación de las funciones celulares de las gotitas ha sido la identificación proteómico de las proteínas unidas, que pueden aislarse junto con las gotitas. Aquí, dos métodos se describen para aislar las gotas de lípidos y sus proteínas unidas a partir de dos amplias eucariotas: la levadura de fisión y células vellosidades placentarias humanas. Aunque ambas técnicas presentan diferencias, el método principal - la densidad gradiente de centrifugación - es compartido por ambas preparaciones. Esto demuestra la amplia aplicabilidad de las técnicas de aislamiento de gotitas presentados.

En el primer protocolo, las células de levadura se convierten en esferoplastos por digestión enzimática de sus paredes celulares. Los esferoplastos resultantes se gently lisaron en un homogeneizador holgada. De Ficoll se añade al lisado para proporcionar un gradiente de densidad, y la mezcla se centrifugó tres veces. Después de la primera vuelta, las gotitas de lípidos se localizan en la capa flotante de color blanco de los tubos de centrífuga junto con el retículo endoplásmico (ER), la membrana plasmática, y vacuolas. Dos giros posteriores se utilizan para eliminar estos otros tres orgánulos. El resultado es una capa que tiene sólo gotitas y las proteínas unidas.

En el segundo protocolo, las células de las vellosidades placentarias están aisladas de placentas plazo humano por digestión enzimática con tripsina y DNasa I. Las células se homogeneizaron en un homogeneizador holgada. Pasos de baja velocidad de centrifugación y de velocidad media se utilizan para eliminar las células sin lisar, los desechos celulares, núcleos, mitocondrias y. La sacarosa se añade a la homogeneizado para proporcionar un gradiente de densidad y la mezcla se centrifuga para separar las gotitas de lípidos de la otra cellulafracciones r.

La pureza de las gotas de lípidos en ambos protocolos se confirma mediante análisis Western Blot. Las fracciones de gotas de ambas preparaciones son adecuadas para el análisis proteómico y lipidomic posterior.

Introducción

Las gotas de lípidos celulares son orgánulos dinámicos que sirven múltiples funciones en las células. Ellos son centros de almacenamiento de lípidos neutros, que se pueden transformar en energía o utilizados para la síntesis de fosfolípidos. Las gotitas juegan un papel central en condiciones fisiológicas y patológicas incluyendo la aterosclerosis, la obesidad, y enfermedades metabólicas relacionadas, y también enfermedades infecciosas 1,2. Además, son fuentes interesantes para los combustibles de biodiesel.

Mucha información sobre las funciones celulares de las gotas de lípidos se ha obtenido a partir del análisis proteómico y lipidomic de gotas purificadas de microorganismos de amplio alcance 3. Estos organismos han incluido las bacterias, levadura 4,5 6-11, plantas 12,13, nematodos 14, y vuela 15,16. Dado el interés en el papel de gotitas de lípidos en enfermedades metabólicas humanos, las gotitas también se han aislado a partir de células animales cultivadas y untejidos Nimal. Líneas de células cultivadas han incluido adipocitos 3T3-L1 17, de ovario de hámster chino (CHO), las células K2 18, hepatocitos humanos 19,20, y líneas de células epiteliales 21. Tejidos animales de la que se han aislado las gotas han incluido ratón músculo esquelético 22, 23 de hígado y las glándulas mamarias 23. Como se mencionó anteriormente, el objetivo de la mayoría de los estudios de aislamiento gotita es para llevar a cabo el análisis proteómico de los factores unidos y análisis lipidomic en el neutro y fosfolípidos.

Desde lípidos neutros - el componente más numeroso de gotitas de lípidos - son menos densos que la mayoría de otros materiales celulares, el aislamiento de las gotas que tradicionalmente se ha realizado utilizando la densidad gradiente de centrifugación. Esa técnica es la pieza central de las dos preparaciones que se presentan aquí. Las técnicas anteriores se combinan 6,24 y modificar en una presentación visual de la aislamiento de gotitas a partir de células de levadura de fisión cultivadasy células humanas culturalizado obtuvieron a partir de tejido placentario. El objetivo es mostrar la amplia aplicabilidad de esta técnica por la elección de dos tipos de células muy diferentes como puntos de partida para el aislamiento de las gotitas. Esta técnica debe ser útil para aquellos que deseen para aislar las gotitas de la mayoría de los organismos.

Protocolo 1 describe el aislamiento de gotitas de lípidos de la levadura de fisión, Schizosaccharomyces pombe, que ha sido utilizado como un modelo para la observación de la formación de gotas durante la división celular eucariota 25. La levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae se ha usado ampliamente como un organismo modelo para el estudio de la biología de los lípidos de las gotitas. Protocolo 1 es aplicable tanto a los organismos y las diferencias en los preparativos se destacan.

Protocolo 2 describe el aislamiento de gotas de lípidos de las células de las vellosidades placentarias, que son a su vez obtenida de placenta humana a término. Lacolección de placentas plazo proporciona una oportunidad única de obtener seguridad y ética de 200-250 g de tejido humano disponible el 26, que contiene una cantidad significativa de las gotas de lípidos. Esto está en contraste con la mayoría del trabajo de aislamiento gotas de lípidos en eucariotas superiores, donde las gotitas se originan a partir de células cultivadas. En esos estudios, los ácidos grasos se añaden a menudo a la cultura para promover la síntesis de lípidos neutros y por lo tanto el crecimiento de las gotitas. Esto es en contraste con el trabajo aquí donde las gotas de lípidos se forman bajo condiciones nativas en el tejido de la placenta.

Las purezas de las fracciones de gotas de lípidos se determinaron por análisis de Western Blot utilizando anticuerpos marcadores de orgánulos. Estas dos fracciones protocolos producirán gotitas de lípidos que son adecuados para el análisis proteómico y lipidomic posterior.

Protocolo

1. Aislar gotas de lípidos a partir de (fisión) Las células de levadura

Aislamiento de gotitas desde el organismo modelo popular en ciernes levadura Saccharomyces cerevisiae es casi idéntica a la siguiente protocolo 6. Se observan diferencias en los preparativos.

1. Cultivo de células de levadura

  1. Preparar los medios de comunicación. Combinar 36 g de YE5S polvo por litro de H2O destilada en botellas de vidrio o frascos de cultivo. Se necesitará alrededor de 2 l de medio. Autoclave los medios de comunicación a 121 ° C durante 20 min. Permita que el medio se enfríen a temperatura ambiente. Para S. cerevisiae reemplazar YE5S con YPD.
  2. Coloque 10-20 ml de los medios de comunicación YE5S enfriadas en un matraz de cultivo de 250 ml utilizando técnicas estériles. Inocular los medios de comunicación con una pequeña cantidad de células de levadura de una placa de agar utilizando un palo de madera estéril o equivalente. Permita que las células crecen a la densidad óptica deseada a 30 ° C. Medir la densidad óptica a unalongitud de onda de 595 nm utilizando un espectrofotómetro.
  3. Colocar los residuos de medios en los matraces 2.8 L. No utilice más de 1 l de medio por 2,8 L matraz para asegurar una mezcla adecuada durante el crecimiento de las células en el incubador con agitación. El rendimiento final de células húmedas debe ser de unos 10 g para poder adquirir suficientes gotas de lípidos para el análisis proteómico y lipidomic.
  4. Introducir las células de la etapa 1.2 en los matraces L 2.8 cada uno con 1 l de medio que se prepararon en el paso 1.1.
  5. Cultivar las células a la densidad deseada a 30 ° C.
  6. Asegúrese de que las células tienen las gotas de lípidos. Reserva 1 ml de las células. Medir la densidad óptica (DO) de la muestra. Añadir 0,1 ml de un stock de BODIPY 493/503 100 mM en etanol por la DO de las células a la muestra. Coloque 3 l de la muestra entre un portaobjetos de vidrio y una cubierta de vidrio antideslizante. Visualizar bajo un microscopio de fluorescencia con un filtro de GFP (Figura 1A).
  7. Sedimenten las células desde el paso 1.5 a las 4 y #176; C a 3800 xg durante 10 min. Trabajar en grupos en función de la capacidad de los tubos de centrífuga.
  8. Vierta los medios YE5S y lavar las células con un tampón de EMM + 600 mM de sorbitol. Sorbitol brinda apoyo osmótica.
  9. Transferir las células a un tubo de centrífuga de 50 ml estéril y sedimentar las células a 4 ° C a 2000 xg durante 10 min. Eliminar el sobrenadante. Pesar las células húmedas. Resuspender las células en 2 ml de (MME + 600 mM de sorbitol) tampón por gramo de células.

2. La conversión de células de levadura de fisión en esferoplastos y la posterior lisis

  1. Añadir 5 mg cada una de 1) la enzima lítica de levadura y 2) las levaduras lisis de las enzimas de Trichoderma harzianum por gramo de células húmedas que fueron pesados ​​en el paso 1.9. Para S. cerevisiae aumentar estas enzimas con la misma cantidad de Zymolyase.
  2. Se incuban las células a 30 º C bajo agitación suave a 100 rpm durante 60 min.
  3. Asegúrese de que los esferoplastos tienen dr lípidosoplets. Por el paso 1.6 (Figura 1B) repetir.

3. Densidad gradiente de centrifugación

  1. Se precipitan los esferoplastos por centrifugación a 4 ° C a 2000 xg durante 5 min.
  2. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta de transferencia de plástico.
  3. Resuspender los esferoplastos sedimentados con hielo frío 10 mM Tris-HCl, 600 mM de sorbitol y 200 mM EDTA. Tenga en cuenta que los esferoplastos son muy frágiles.
  4. Se precipitan los esferoplastos de nuevo con la misma configuración que en el paso 3.1. Retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspender los esferoplastos usando una pipeta de plástico de transferencia en 12% de Ficoll, mM de Tris-HCl 10, y 200 mM de EDTA a una concentración de 2 ml / g células.
  5. Transfiera los esferoplastos resuspendidas a un homogeneizador de vidrio y homogeneizar suavemente sobre hielo, 20-30 golpes, con la mano del mortero suelta del homogeneizador de vidrio.
  6. Transfiera los esferoplastos lisadas a tubos de centrífuga y las cubrirás con el mismo voLume de 12% de Ficoll, mM de Tris-HCl 10, y tampón de EDTA 200 mM. Elija el número de tubos de centrífuga de usar por lo que cada tubo es de unos dos tercios de su capacidad.
  7. Centrifugar a 4 ° C a 100.000 xg durante 1,5 horas en un rotor SW28 o equivalente. Permitir rotor de inercia hasta detenerse (desaceleración del rotor = 0).
  8. Transferir suavemente la capa superior flotante blanco (Figura 2A), que contiene las gotitas, a un nuevo tubo (s) de centrifugación utilizando una pipeta o una pipeta Pasteur doblada. Añadir suficiente volumen de 12% de Ficoll, mM de Tris-HCl 10, y tampón de EDTA 200 mM a la muestra de modo que llene aproximadamente un tercio del tubo de centrífuga.
  9. Añadir el volumen equivalente de 8% de Ficoll, mM de Tris-HCl 10, y tampón de EDTA 200 mM a la parte superior de la muestra (s) en el nuevo tubo (s) de centrifugación. Después de la adición de este búfer los tubos deben ser de unos dos tercios de su capacidad.
  10. Centrifugar a 4 ° C a 100.000 xg durante 1 hora en un rotor SW28 o equivalente. Permitir rotor de inercia hasta detenerse (rOTOR de deceleración = 0).
  11. Transferir suavemente la capa blanca que flota superior (Figura 2B), que contendrá las gotas, a un nuevo tubo (s) de centrifugación utilizando una pipeta o una pipeta Pasteur doblada. Añadir 600 mM de sorbitol, 8% de Ficoll, mM de Tris-HCl 10, y tampón de EDTA 200 mM a la muestra de modo que llene aproximadamente un tercio del tubo de centrífuga.
  12. Añadir el volumen equivalente de 250 mM de sorbitol, mM de Tris-HCl 10, y tampón de EDTA 200 mM a la parte superior de la muestra (s) en el nuevo tubo (s) de centrifugación. Después de la adición de este búfer los tubos deben ser de unos dos tercios de su capacidad.
  13. Centrifugar a 4 ° C a 100.000 xg durante 1 hora en un rotor SW28 o equivalente. Permitir rotor de inercia hasta detenerse (desaceleración del rotor = 0).
  14. Transferir la capa superior de color blanco (Figura 2 C), lo que debería contener sólo las gotas de lípidos y proteínas unidas, a un tubo de diálisis y diálisis O / N en 10 mM Tris-HCl y 200 mM tampón EDTA para eliminar el Ficoll.
2. Aislar gotas de lípidos a partir de células de la placenta humana vellosos

Las placentas fueron recogidos de las mujeres sanas con embarazos únicos sometidos electiva sección cesárea antes del inicio del trabajo de parto espontáneo a término. Los sujetos dieron por escrito, el consentimiento informado para la recogida de su placenta. La colección y uso posterior, de placentas se realizó con la aprobación de la Universidad de Tennessee y la Universidad de Tennessee Graduate School of Medicine en Knoxville Junta de Revisión Institucional (# 8757B y # 3338, respectivamente).

1. Aislar las células de las vellosidades placentarias humanas

Parte 1 del protocolo es una modificación de un protocolo publicado anteriormente por Petroff et al. 26

Preparar las siguientes soluciones:

  • De NaCl (1 L): disolver 9 g de NaCl (M 58,4 g / mol) en dH2O para producir una solución 1 L. Filtro de esterilizar (0,2; Micras membrana).
  • Solución salina equilibrada de 10x de Hank (10x HBSS) (1 L): 4 g de KCl (M 74,5 g / mol); 0,6 g de KH 2 PO 4 (M 136.086 g / mol); de 80 g de NaCl (M 58,44 g / mol); Na 2 HPO 4 (M 141,96 g / mol); 10 g de D-glucosa (M 180,16 g / mol). Disolver cada uno de los constituyentes en dH 2 O para producir una solución de 1 litro. Se esteriliza con filtro (0,2 membrana micras).
  • Tampón de digestión de enzima (0,6 ml): combinar 70 ml de HBSS 10x con 3,3 ml de 7,5% de Na biscarbonato, 17,5 ml de HEPES 1 M, y 266,1 ml de dH2O y esterilizar el filtro (0.2 micras de membrana). Almacenar a 4 ° C.
  • DNasa I: justo antes del uso, añadir 5 ml estéril al 0,9% de NaCl a un vial de DNasa. Mantener en hielo hasta su uso o almacenar a -20 ° C.
  1. Preparación de placenta para la disección
    1. Obtener una placenta humana y el proceso lo más cerca del momento de la entrega de lo posible. Utilice un recipiente sellado tal como un refrigerador para el transporte de la placenta. Sea siempre cuidadoso al ladomateriales biológicos humanos Ling.
    2. En la campana de seguridad biológica, la transferencia de la placenta a un recipiente estéril autoclavable, y lavar cuidadosamente la sangre de la placenta y las membranas utilizando solución estéril al 0,9% de NaCl (solución salina). Deseche la solución salina con sangre en el vaso de precipitados de 1 litro como residuo biológico líquido.
    3. Coloque la placenta en un campo estéril, con la superficie lisa que lleva el cordón umbilical hacia arriba. Con, tijeras y pinzas de punta fina afilados eliminar las membranas fetales y el cordón umbilical.
    4. Voltear la placenta de manera que la superficie materna (superficie rugosa) hacia arriba. Retire el tejido que recubre la placa basal, a unos 3 mm de la superficie.
  2. Disección de que la placenta
    1. Diseccionar un cotiledón a la vez evitando la placa coriónica. Recoger el tejido de las vellosidades en un vaso de precipitados de 250 ml con solución salina.
    2. Enjuague tejido varias veces en un vaso de precipitados separado con 0,9% de NaCl por agitación con fórceps, usando el vaso de precipitados de 1 L para residuos líquidos.
    3. Transferir un cotiledón a la vez a un plato de 150 mm de Petri. Sujete con fórceps y raspar el tejido con una hoja de afeitar de los vasos en un plato de Petri. Coloque el tejido raspado en el vaso separado que contiene 0,9% de NaCl. Repita el procedimiento para todas las piezas de tejido.
    4. Transferencia pequeña porción del tejido al tamiz de disociación celular y enjuague con 0,9% de NaCl ampliamente hasta que el efluente se convierte en claro. Repita el procedimiento para todos los tejidos.
    5. Después de enjuagar el tejido raspado en el tamiz de disociación celular, escurrir el exceso de líquido y peso.
      En este punto el tejido se puede almacenar O / N en un matraz Erlenmeyer estéril a 4 ° C en DMEM.
  3. La digestión enzimática del tejido de la placenta
    1. Preparar la mezcla de digestión de tejido: 100 ml de tampón de dilución de enzima precalentado, 1 ml de DNasa I y 20 ml de 2,5% de tripsina 10x.
    2. Divida el tejido, la transferencia de 60 g de tejido recogido total de (por lo general alrededor de 250-300 g) a un matraz de Erlenmeyer estéril de 500 ml.
    3. Agregue la mezcla de digestión de los tejidos en el matraz Erlenmeyer que contiene el tejido, y se incuba a 37 ° C en un agitador durante 45 min a 150 rpm.
  4. Recoger las células disociadas
    1. Después de los primeros 45 min de disociación, establezca el matraz de digestión con una inclinación hasta que el tejido se asienta.
    2. Recoger el sobrenadante, teniendo cuidado de no recoger el tejido no disociado. Añadir una cantidad igual de HBSS para el sobrenadante recogido y transferir a tubos de centrífuga de 15 ml estériles. Para porciones adicionales de tejido no disociado, repita el procedimiento desde el paso 3.2 con el tejido no disociado.
    3. Centrifugar el homogeneizado a 4 ° C a 1000 xg durante 15 min.
    4. Para cada lote, después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento. Las células de las vellosidades placentarias son predominantemente en la porción blanca de la pastilla, que recubre las células rojas de la sangre.
    5. Transfiera células vellosos (porción blanca del pellet) un sterile 50 ml tubo de centrífuga cónico y mantener en hielo.
    6. Después de recoger las células de las tres etapas de digestión, se filtra la suspensión utilizando un filtro de células de 100 micras de nylon insertada en la parte superior de un tubo de centrífuga cónico de 50 ml estéril. Si la filtración de la suspensión celular se ralentiza, levantar hacia arriba sobre el filtro para extraer un vacío dentro del tubo.
    7. Centrifugar a 4 ° C a 1000 xg durante 10 min. Retire con cuidado el sobrenadante sin perturbar el sedimento.

2. Homogeneizar las células vellosas placentarios

  1. Antes de comenzar con el proceso de aislamiento, preparar 50 ml de lisis hipotónica Medio (HLM) que contienen 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4 y EDTA 1 mM. Añadir inhibidores de la proteasa a HLM justo antes de su uso y mantener el medio en el hielo.
  2. En la campana de seguridad biológica, añadir 4 veces el volumen del sedimento celular HLM helada a las células. Suavemente y por completo volver a suspender las células pipeteando las células up-unad-hacia abajo con una pipeta de 10 ml.
  3. Se incuban las células en suspensión en hielo durante 10 min.
  4. Transferir las células a la homogeneizador Dounce, que debe ser en hielo. Lentamente homogeneizar las células mediante la aplicación de 20 a 25 movimientos suaves con la mano del mortero y holgada del homogeneizador.
  5. Centrifugar el lisado de células a 4 º C a 3000 xg durante 10 min para eliminar las células sin lisar, los núcleos y restos celulares.
  6. Se recoge el sobrenadante y transferir a un tubo SW28 (o una alternativa que puede ser centrifugada a 25.000 xg). Centrifugar a 4 ° C a 25.000 xg durante 20 min para eliminar las mitocondrias.

3. Aislar las gotas de lípidos por ultracentrifugación

  1. Preparar 50 ml de carbonato de sodio 100 mM (M 106 g / mol) tampón (pH 11,5) y 50 ml de 60% de sacarosa solución (W / W). Añadir inhibidores de la proteasa para el tampón de carbonato de sodio antes de su uso y mantener en hielo.
  2. Recoger el sobrenadante de la etapa 2.6 en un tubo de centrífuga de 50 ml, ajustara 20% de sacarosa y la transferencia en la parte inferior de un tubo de ultracentrífuga para un rotor SW28, o equivalente. Sobrenadante densidad de superposición ajustado con ~ 10 ml de tampón de carbonato de sodio 100 mM enfriado con hielo (pH 11,5) y 0,5-1 ml de helado HLM para llenar el tubo.
  3. Centrifugar a 4 ° C a 130.000 xg durante 45 min utilizando SW28 rotor basculante. Permitir rotor de inercia hasta detenerse (desaceleración del rotor = 0).
  4. Recoger la capa flotante, ajuste a 10% de sacarosa y transferir en la parte inferior de un tubo de ultracentrífuga 13.2 ml para un rotor SW41Ti, o equivalente. Densidad de superposición sobrenadante se ajustó con aproximadamente 5 ml de tampón de carbonato de sodio 100 mM enfriado con hielo (pH 11,5) y 0,5 ml de HLM enfriado con hielo.
  5. Centrifugar a 4 ° C a 274.000 xg durante 60 min utilizando SW41Ti rotor basculante. Permitir rotor de inercia hasta detenerse (desaceleración del rotor = 0) para minimizar la interrupción de la capa de gotas de lípidos.
  6. Recoger cuidadosamente la capa flotante superior (Figura 2D), que contienelas gotas de lípidos con una pipeta de 1 ml y repita el paso 3.4.
  7. Centrifugar a 4 ° C a 274.000 xg durante 30 min utilizando SW41Ti rotor basculante. Permitir rotor de inercia hasta detenerse (desaceleración del rotor = 0).
  8. Recoger cuidadosamente la capa flotante de color blanco superior que contiene gotas de lípidos con una pipeta Pasteur doblada en tres tubos de 1,5 ml que contienen 100 l HLM.

Fracción de gotas de lípidos Caracterización (Protocolos 1 y 2)

La recuperación y la pureza de la fracción de gotas de lípidos se pueden verificar por Western Blot combinada con la luz o microscopía electrónica. Además, alícuotas después de diferentes etapas de centrifugación pueden ser recogidos y retenidos para determinar la eficiencia de purificación. En Western Blotting, es más apropiado para comparar un volumen de la fracción de gotas de lípidos que representa un equivalente de todo el lisado celular de la comparación de las gotas de lípidos a otras fracciones de membrana en Tél base del contenido total de proteínas 24.

Resultados

Si la centrifugación en gradiente de densidad trabajó como se esperaba, la capa flotante debe contener gotitas de lípidos y que se haya agotado de otros orgánulos largo de la progresión de los giros de alta velocidad.

Para Protocolo 1, Western blots se realizaron con anticuerpos marcadores a gotitas de lípidos (Erg6p), y orgánulos que se han encontrado para interactuar con gotitas de lípidos en la levadura, ER (Dpm1p), mitocondrias (Por1p), membrana plasmática (Pma1p), y vacuolas (V...

Discusión

Los pasos críticos dentro de este protocolo

Asegúrese de que para ser consistente con los medios de comunicación y las densidades de células durante el crecimiento de las células cultivadas. Gotitas de lípidos celulares son únicos en que sus proteínas asociadas son depende en gran medida el medio ambiente en el que se cultivan las células 17. Por lo tanto, los medios de comunicación en el que se cultivan las células y la densidad ...

Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el premio de la Asociación Americana del Corazón 13SDG14500046 a PD, una Escuela de Energía Sostenible y Premio de Investigación Centro (Universidad de Tennessee) a PD, y para la Educación Médica de los Médicos y la Fundación para la Investigación (Universidad de Tennessee) premio a JM La autores agradecen a Caroline Leplante (Yale Univ.) para el protocolo para la conversión de la levadura de fisión para esferoplastos; Eric T. Boder (Universidad de Tennessee) para el uso de sus incubadoras temblores, centrífuga de mesa y Western Blot equipos de análisis, y el Centro de Biotecnología Ambiental (Universidad de Tennessee) para el uso de su ultra-centrífuga; Günther Daum para anticuerpos levadura (Graz University of Technology, Austria.); al personal del Departamento de Obstetricia y Ginecología (Univ. Tennessee Medical Center) para la asistencia técnica .

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Protocol 1
1. Growing yeast cells and converting to spheroplasts
Edinburgh Minimal Media (EMM)Sunrise Science Products2005
Yeast extract with 5 supplements (YE5S)Sunrise Science Products2011YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD.
YPD powderSunrise Science Products1875For S. cerevisiae
SorbitolFisher ScientificBP439
Yeast Lytic EnzymeMP Biomedicals215352610
Lysing Enzymes from Trichoderma harzianumSigma-AldrichL1412
Zymolayse-20TSunrise Science ProductsN0766391For S. cerevisiae
BODIPY 493/503InvitrogenD-3922
Microscope SlidesFisher Scientific12-544-7
Microscope Cover GlassFisher Scientific12-542-B
Plastic transfer pipetteFisher Scientific137115AM
1 L glass bottle
250 ml flask
2.8 L flasks
2. Yeast lipid droplet isolation
Tris-HClFisher ScientificBP153
EDTAFisher ScientificBP120
Ficoll 400Fisher ScientificBP525
12-14k Spectra/Por Dialysis MembraneSpectrumLabs132680
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail TabletsRoche Diagnostics11873580001irritant
Dounce Homogenizer Sigma-AldrichD9938
Ultracentrifuge Tubes 25 mm x 89 mm (for SW28)Beckman-Coulter355642
12-14k Spectra/Por Dialysis MembraneSpectrumLabs132680
Temperature-controlled shakerNew Brunswick ScientificC25KC
Thermo Sorvall Legend XTR centrifugeThermo-Scientific75004521
Swinging Bucket Centrifuge RotorThermo-Scientific75003607
Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle RotorThermo-Scientific75003698
Ultracentrifuge LB-MBeckman-Coulter
SW28 Ultracentrifuge RotorBeckman-Coulter342204
Protocol 2
1. Placental villous cells isolation
Disposable underpadsFisher Scientific23666062
Autoclavable pan (container), 3 LFisher Scientific1336110
Fine scissors, sharp-sharp, straightFine Science Tools1406011
London ForcepsFine Science Tools1108002
Dumont #7b ForcepsFine Science Tools1127020
Razor bladesFisher ScientificS65921
Screen cup for CD-1Fisher ScientificS1145
40 mesh screen Fisher ScientificS0770
Fisherbrand cell stainers 100 μmFisher Scientific22363549
150 mm Petri DishesFisher ScientificNC9054771
NaClFisher ScientificS642
KClFisher ScientificP333
KH2PO4Fisher ScientificP386
Na2HPO4Fisher ScientificS374
D-GlucoseFisher ScientificD16
HEPESFisher ScientificBP310
2.5% Trypsin 10xInvitrogen15090046
DNase I grade II, from bovine pancreasRoche Applied Science10104159001
Sodium bicarbonate solutionSigma-AldrichS8761
500 ml Erlenmeyer flasks
250 ml Beakers
15 ml Centrifuge tubes
10 ml Serological pipettes
50 ml Centrifuge tubes
DMEMInvitrogen11965084
2. Lipid droplets isolation from villous placental cells
Tris-HClFisher ScientificBP153
EDTAFisher ScientificBP120
D-SucroseFisher ScientificBP220
Sodium Carbonate Fisher ScientificBP357
EDTA-free protease inhibitor cocktail tabletsRoche Diagnostics11873580001irritant
Dounce homogenizer Sigma-AldrichD9938
Ultracentrifuge tubes 25 mm x 89 mm (for SW28)Beckman-Coulter355642
Ultra-Clear centrifuge tubes 14 mm x 89 mm (for SW41)Beckman-Coulter344059
Disposable borosilicate glass Pasteur pipetsFisher Scientific1367820C
Biological safety hood Thermo-Scientific
WaterbathFisher Scientific
Temperature-controlled shakerNew Brunswick ScientificC25KC
Thermo Sorvall Legend XTR centrifugeThermo-Scientific75004521
Swinging Bucket Centrifuge RotorThermo-Scientific75003607
Ultracentrifuge LB-MBeckman-Coulter
SW28 Ultracentrifuge RotorBeckman-Coulter342204
SW41 Ti Ultracentrifuge RotorBeckman-Coulter331336
Western blot
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgGLI-COR926-68071dilution 1:15,000
IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgGLI-COR926-32210dilution 1:5,000
NuPAGE Novex 12% Bis-Tris gelsInvitrogenNP0341
Primary antibodies for Protocol 1
Erg6pgift from Dr. G. DaumGraz University of Technology, Austriadilution 1:5,000
Dpm1pAbcamab1136864 μg/ml
Por1pgift from Dr. G. DaumGraz University of Technology, Austriadilution 1:5,000
Pma1pgift from Dr. G. DaumGraz University of Technology, Austriadilution 1:10,000
Vma1p (anti-ATP6V1A)Abcamab1137450.5 μg/ml
Primary antibodies for Protocol 2
Perilipin 2 (anti-ADFP)Abcamab523552 μg/ml
CalnexinCell Signaling Technology2679dilution 1:1,000
GM130Biorbytorb40533dilution 1:25
COX IVCell Signaling Technology4850dilution 1:1,000
MEK1Biorbytorb38775dilution 1:50

Referencias

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