التعرف على الفئران أرومة الحمراء حيوانية المخصب في Enucleating الأحداث بواسطة متعدد الأطياف التصوير التدفق الخلوي

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة لتحديد عدد سكانها enucleating الأرومة الحمراء سوي اللون عن طريق التدفق التصوير متعددة الأطياف الخلوي، وتوفير التصور لعملية استئصال أرومة الحمراء.

Abstract

الكريات الحمر في الثدييات يختتم عملية دراماتيكية من قلع التي تؤدي الى تكوين الخلايا الشبكية. آلية قلع لم يتم حتى الآن توضيح بالكامل. وهناك مشكلة مشتركة واجهت عند دراسة توطين البروتينات والهياكل الرئيسية في الأرومة الحمراء enucleating بواسطة المجهر هو صعوبة مراقبة عدد كاف من الخلايا التي تمر قلع. قمنا بتطوير بروتوكول تحليل رواية باستخدام multiparameter التصوير الخلية عالية السرعة في تدفق (متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي)، وهو الأسلوب الذي يجمع بين مناعي المجهري مع التدفق الخلوي، من أجل تحديد كفاءة عدد كبير من enucleating الأحداث، التي تسمح ل الحصول على القياسات وإجراء التحليل الإحصائي.

علينا أولا وصف هنا اثنين في المختبر الكريات الحمر أساليب الثقافة استخدامها من أجل مزامنة الأرومة الحمراء الفئران وزيادة احتمال التقاط قلع في الالوقت (ه) من التقييم. ثم، نحن تصف بالتفصيل تلطيخ الأرومة الحمراء بعد تثبيت وpermeabilization من أجل دراسة توطين البروتينات داخل الخلايا أو الطوافات الدهنية خلال قلع بواسطة التدفق الخلوي التصوير متعددة الأطياف. جنبا إلى جنب مع حجم وDNA/Ter119 تلطيخ التي تستخدم لتحديد الأرومة الحمراء سوي اللون، ونحن الاستفادة من المعلمات "نسبة الارتفاع" خلية في القناة مشرق الميدان أن يساعد في التعرف على الخلايا ممدود و "دلتا النقطه الوسطى XY Ter119/Draq5 "الذي يسمح بتحديد الأحداث الخلوية التي وسط Ter119 تلطيخ (الخلايا الشبكية الوليدة) هو متباعدة من وسط Draq5 تلطيخ (نواة تمر قذف)، مما يدل على أن الخلية على وشك أن استأصل. يتم التخصيب مجموعة فرعية من السكان أرومة الحمراء السوية التلون مع ارتفاع النقطه الوسطى الدلتا ونسبة الارتفاع المنخفض في enucleating الخلايا.

Introduction

التمايز النهائي ضمن النسب محمر في الثدييات يختتم عملية مثيرة للقلع، التي من خلالها أرومة الحمراء السوية التلون يطرد نواة المغطى الغشاء (pyrenocyte) ^1، وتوليد الخلايا الشبكية ^2. الآلية الدقيقة لهذه العملية، والذي هو أيضا خطوة تحد من معدل النجاح، وعلى نطاق واسع، وإنتاج خلايا الدم الحمراء في المختبر، لم يتم حتى الآن توضيح بالكامل. توطين البروتينات والهياكل الرئيسية في الأرومة الحمراء enucleating تعتمد على استخدام الفلورسنت والإلكترون المجهري ^3-5. النتائج هذه عملية شاقة عادة في التعرف على عدد محدود من الأحداث وقلع لا تسمح دائما التحليل الإحصائي ذات مغزى. التوسع في طريقة لتحديد أرومة الحمراء وصفت من قبل ماكغراث وآخرون. ^6، وقد وضعنا نهجا جديدا لتحديد ودراسة الأحداث من قبل قلع متعددة الأطياف إيماجينج التدفق الخلوي (multiparameter عالية السرعة التصوير الخلية في التدفق، والأسلوب الذي يجمع بين المجهر الفلورسنت مع التدفق الخلوي) ^7، والتي يمكن أن توفر عدد كاف من الملاحظات للحصول على قياسات وتحليل احصائى.

هنا، نحن تصف الأولين في المختبر الكريات الحمر الأساليب المستخدمة في ثقافة أجل مزامنة الأرومة الحمراء وزيادة احتمال التقاط قلع في وقت التقييم. ثم نحن تصف بالتفصيل تلطيخ الأرومة الحمراء بعد تثبيت وpermeabilization من أجل دراسة توطين البروتينات داخل الخلايا أو الطوافات الدهنية خلال قلع بواسطة التدفق الخلوي التصوير متعددة الأطياف.

يتم تشغيل العينات على تدفق عداد الكريات والتصوير هي بوابات الخلايا التي تم جمعها بشكل مناسب لتحديد الأرومة الحمراء سوي اللون ^6. ثم يتم تحليل الأرومة الحمراء سوي اللون على أساس نسبة الارتفاع، والتي تقاس في brightfield معهد العالم العربيجينج، مقابل قيمتها لدلتا المعلمة النقطه الوسطى XY Ter119 الحمض النووي، الذي يعرف بأنه المسافة بين مراكز المناطق الملون لTer119 والحمض النووي، على التوالي. يتم التخصيب السكان من الخلايا مع نسبة الارتفاع المنخفضة والعالية دلتا النقطه الوسطى XY Ter119/DNA في enucleating الخلايا. باستخدام البرية من نوع (WT) الأرومة الحمراء مقابل الأرومة الحمراء مع MX-لجنة المساواة العرقية بوساطة الشرطي حذف RAC1 على Rac2 ^{- / -} أو مجتمعة Rac2 ^{- / -؛} Rac3 ^{- / -} الخلفية الوراثية وهذا البروتوكول تحليل رواية من تدفق التصوير متعددة الأطياف الخلوي، ونحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن استئصال يشبه الانقسام السيتوبلازمي غير المتماثلة وأن تشكيل عصابة أكتوميوزين ينظم في جزء من راك GTPases مهم لتطور قلع ^7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. طويل الأجل في المختبر الكريات الحمر الثقافة (خارج الحي محمر بروتوكول ثقافة التمايز التي كتبها Giarratana وآخرون. ^8، التعديل وتكييفها لخلايا الفأر)

هذا هو 3 خطوات طويلة الأجل في بروتوكول الكريات الحمر المختبر. في الخطوة الأولى (0-4 أيام) توضع 2 × 10 ⁵ خلية / مل في متوسطة النمو أرومة الحمراء تستكمل مع عامل الخلايا الجذعية (SCF)، انترلوكين 3 (IL-3)، والإريثروبويتين (EPO). في الخطوة الثانية (5-6 أيام)، ومعلق الخلايا في 2 × 10 ⁵ خلية / مل وشارك في تربيتها على الخلايا الملتصقة سدى (MS5) في الطازجة المتوسطة النمو أرومة الحمراء تستكمل فقط مع إبو. في الخطوة الثالثة (7-9 أيام)، والخلايا المستزرعة على طبقة من MS-5 خلايا جديدة في متوسطة النمو أرومة الحمراء دون السيتوكينات تصل إلى قلع (الشكل 1A).

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوان من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) منمستشفى المركز الطبي سينسيناتي للأطفال.

1. حصاد العظام وعزل منخفض الكثافة خلايا نخاع العظام
   1. إضافة 2 مل IMDM العقيمة التي تحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني (FBS) في أنبوب مخروطي 15 مل والحفاظ على الجليد.
   2. الموت ببطء 2-6 أشهر من العمر النوع البري C57/BL6 الماوس (جنبا إلى جنب مع أو بدون الماوس المستهدفة وراثيا من الفائدة) التالية التي وافقت عليها مؤسسة بروتوكول (مثل CO ₂ الاستنشاق، تليها خلع عنق الرحم).
   3. عزل عظام الحوض، عظام الفخذ، وظنبوب من ساقيه باستخدام ملقط ومشرط، وإضافتها إلى أنبوب يحتوي IMDM +2٪ FBS والحفاظ على الجليد.
   4. إضافة 1 مل IMDM +2٪ FBS في أنبوب معقم التدفق الخلوي والعظام دافق باستخدام ملقط وحقنة السلين مع 25-G × 5/8 "الإبرة. IMDM فلوش +2٪ FBS من خلال العظام عدة مرات بلطف ( بواسطة الشفط ~ 500 ميكرولتر من تعليق خلية والتنظيف مرة أخرى من خلال العظام)، وجمع خلايا نخاع العظام في تدفق cytometrذ الأنبوب. فلاشينغ اكتمال عندما تظهر عظام بيضاء.
   5. تصفية خلية تعليق من خلال 40 ميكرون مجموعة مصفاة الخلية على رأس أنبوب مخروطي 50 مل. غسل مصفاة الخلية مع IMDM +2٪ FBS وباستخدام نفس ضبط المتوسطة الحجم النهائي من تعليق الخلية إلى 5 مل.
   6. إعداد منخفض الكثافة خلايا نخاع العظام (LDBM) من خلال التدرج الكثافة الطرد المركزي: طبقة بعناية 5 مل من تعليق خلية في 5 مل من فصل الخلية التدرج الكثافة المتوسطة 1.083 جم / مل في أنبوب 15 مل وتدور في 750 x ج لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) مع عدم وجود فرامل / منخفضة التسارع.
   7. نقل طاف (كل شيء حتى عن علامة 2 مل من الأنبوب 15 مل من أجل الحصول على معطف الشهباء) إلى أنبوب 15 مل جديدة وأداء أكثر واحد يغسل مع IMDM +2٪ FBS في 525 x ج لمدة 5 دقائق في RT.
   8. طاف نضح وليز أي المتبقية خلايا الدم الحمراء (RBC) من خلال تعليق بيليه في 3 مل العازلة تحلل RBC لمدة 5 دقائق على RT. إذا كان النقاء أكبر من الأرومة الحمراء هوالمطلوبة في الخطوة النهائية (على سبيل المثال للدراسات كيميائية حيوية)، وتنقية الخلايا LDBM أخرى في هذه الخطوة لخلايا ^NEG لين بواسطة مغناطيس.
2. فيفو السابقين محمر تمايز بروتوكول الثقافة بدءا من LDBM أو خلايا ^NEG لين (الشكل 1A)
   1. إضافة 7 مل IMDM +2٪ FBS، وتدور في 525 x ج لمدة 5 دقائق على RT وresuspend الخلايا مكعبات في 2 مل النمو أرومة الحمراء المتوسطة (غير العادية)، ويتألف من:
      أ. StemPro-34 المتوسطة، التي تحتوي على
      ب. 2.6٪ StemPro-34 متوسطة الملحق،
      ج. 20٪ BIT-9500،
      د. 900 نانوغرام / مل كبريتات الحديدوز،
      ه. 90 نانوغرام / مل نترات الحديديك،
      و. 100 وحدة / مل البنسلين / الستربتوميسين، 2 مم L-الجلوتامين
      ز. 10 ^-6 M الهيدروكورتيزون
      ح. وأضاف طازجة السيتوكينات:
      ط) 100 نانوغرام / مل SCF،
      ب) 5 نانوغرام / مل IL-3، و
      ج) 3 وحدة دولية / مل إبو.
   2. عد الخلايا باستخدام عداد الخلية الآلي أو يدويا في المجهر باستخدام تنحنحocytometer.
   3. في لوحة 6 جيدا لوحة خلية ثقافة بتركيز 5 × ⁵ 10 خلايا / جيد إلى الحجم النهائي من 2.5 مل في الجمعية العامة غير العادية (2 × 10 ⁵ LDBM خلية / مل)، واحتضان عند 37 درجة مئوية (يعتبر هذا كيوم # 0 للثقافة).
   4. تغيير المتوسط ​​عن طريق الشفط 1.5 مل من طاف، والغزل في 525 x ج لمدة 5 دقائق على RT، إعادة التعليق في 1.5 مل من المتوسط ​​الطازجة التي تحتوي على جميع السيتوكينات 3 وإضافة إلى الآبار كل يوم في أيام # 2، 3، 4، لتحسين المرحلة التكاثري. في يوم 3، وإزالة جميع الخلايا، عد وتنقسم إلى العدد المناسب من الآبار من أجل الحفاظ على تركيزات الخلية جيدا ~ 2 × 10 ⁵ خلية / مل. الحفاظ على الثقافة في 37 درجة مئوية / 5٪ CO _2.
   5. في يوم 4، وخلايا لوحة MS5 (الفئران خط الخلية اللحمية) لآبار خلية ثقافة وحة 6 جيدا جديدة. وMS5 خلية مستنبت وα-MEM تحتوي على 20٪ FBS، 100 وحدة / مل البنسلين / الستربتوميسين، و 2 مم L-الجلوتامين.
   6. في يوم 5، عد عدد منالخلايا (الآن المخصب بدرجة كبيرة في الأرومة الحمراء) في كل بئر من لوحة الثقافة الأصلية باستخدام عداد الخلية الآلي أو يدويا في المجهر باستخدام عدادة الكريات.
   7. رفع جميع الخلايا من كل بئر ونقل إلى أنابيب مخروطية 15 مل، وتدور باستمرار في 525 x ج لمدة 5 دقائق على RT، نضح طاف وحل الكريات مع الجمعية العامة غير العادية الطازجة التي تحتوي على إبو فقط (3 وحدة دولية / مل) إلى تركيز 2 × 10 ⁵ خلية / مل.
   8. نضح طاف من الآبار حيث كانت مطلية MS-5 خلايا في اليوم السابق (تستهدف 70-80٪ confluency في وقت شارك في الثقافة) وإضافة خلايا محمر في هذه الآبار في الجمعية العمومية غير العادية التي تحتوي فقط إبو (وإن لم يكن لهم سيلة لل الاختيار، MS-5 خلايا البقاء على قيد الحياة بشكل جيد في الجمعية العمومية غير العادية لعدة أيام).
   9. تغيير المتوسطة مضيفا EPO الطازجة في يوم # 6.
   10. تغيير المتوسطة في يوم # 7، وذلك باستخدام غير العادية مع عدم وجود السيتوكينات المضافة. في أيام من 7 إلى 9، وعينات اختبار لقلع مع التدفق الخلوي بعد تلطيخ مع المضادة للTer119 وSyto-16 يوميا وعroceed لتلطيخ عينات للمتعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي (كما هو مفصل في القسم 3).
       ملاحظة: قبل الطلاء وفي يوم 2، 4، 6، و 7 من الثقافة، ورصد الخلايا المستزرعة لتخصيب أرومة الحمراء وتمايز مع التدفق الخلوي عن طريق تقييم علامات سطح CD44 وTer119 مقابل حجم (FSC) ⁹ بدلا من ذلك CD71، Ter119، وFSC ويمكن أيضا أن تستخدم ^{10، 11.}

2. سريعة سمل الفحص، وفقا للبروتوكول وصفها يوشيدا وآخرون ¹² مع تعديلات (الشكل 1B)

1. الإجهاد الكريات الحمر والحث سدى إعداد الخلايا في المختبر للثقافة الكريات الحمر
   1. تخدير 2-6 أشهر من العمر النوع البري C57/BL6 الماوس في المبادئ التوجيهية IACUC (على سبيل المثال مع حل isoflurane و). تأكد من أن الماوس تم تخدير كاف عن طريق التحقق من عدم وجود استجابات انعكاسية لطيف الخلفيتين، ومخلب قرصة لالتنفس العادية أثناء العملية. استخدام البيطري مرهم للعين على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
   2. لحث على الإجهاد الكريات الحمر عبر الذيل النزيف إلى الحجم النهائي من 500 ميكرولتر. باستخدام حقنة الأنسولين، وضخ حجم مساو من محلول ملحي الغشاء البريتونى لضمان إنعاش السوائل من الحيوان (عقد الحيوان في موقف تراند قبل الحقن وحقن في أسفل البطن حتى لا تلحق الضرر الأعضاء الداخلية).
   3. لا تترك الماوس غير المراقب حتى استعاد ذلك التحكم في المحركات كما يتبين من الحيوان بدأت تتحرك حول القفص والقدرة على الوقوف والمشي من دون الوقوع. يتم وضع الماوس مفصود في قفص الفئران دون غيرها.
   4. 2 بعد أيام، لوحة MS-5 خلايا في آبار من 24 لوحة جيدا خلية ثقافة. احتضان MS-5 الخلايا عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO ₂ في MS5 المتوسطة الخلية (أ-MEM تحتوي على 20٪ FBS، 100 وحدة / مل البنسلين / الستربتوميسين، و 2 مم L-الجلوتامين) وذلك بهدف أن تكون 70-80 ٪ متموجة طن الآبار لوحة بعد 48 ساعة.
2. حصاد الطحال وتجهيز splenocytes
   1. أربعة أيام (96 ساعة) بعد الإجهاد الكريات الحمر الاستقراء، والموت ببطء الماوس نزف سابقا من خلال بروتوكول افق IACUC (مثل CO ₂ الاستنشاق تليها خلع عنق الرحم).
   2. الحصاد الطحال ووضعها في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على IMDM 2٪ FBS والحفاظ على الجليد.
   3. مرة أخرى في المختبر، في الثقافة هود الأنسجة تحت ظروف معقمة، عكس أنبوب يحتوي الطحال على مصفاة الخلية 40 ميكرومتر تعيين على رأس أنبوب 50 مل. سحق الطحال باستخدام المكبس من حقنة بلاستيكية 5 مل.
   4. غسل مصفاة الخلية مع IMDM +2٪ FBS وباستخدام نفس المتوسطة، وضبط الحجم النهائي من تعليق الخلية إلى 5 مل.
   5. طبقة بعناية خلية طحالية تعليق على 5 مل 5 مل كثافة الفصل المتدرج خلية متوسطة 1.083 جم / مل في أنبوب 15 مل وتدور في 750 x ج لمدة 25 دقيقة في RT مع عدم وجود فرامل / منخفضة التسارع.
   6. نقلطاف (وصولا الى حل حول علامة 2 مل من الأنبوب 15 مل من أجل الحصول على معطف الشهباء) إلى أنبوب 15 مل جديدة وأداء أكثر واحد يغسل مع IMDM +2٪ FBS في 525 x ج لمدة 5 دقائق على RT .
   7. طاف نضح وخلايا الدم الحمراء ليز من خلال تعليق بيليه في 3 مل العازلة تحلل RBC لمدة 5 دقائق على RT.
   8. إضافة 7 مل IMDM +2٪ FBS لغسل الخلايا وإلى تمييع وتحييد العازلة تحلل RBC وتدور في 525 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
   9. طاف نضح وتعليق الخلايا في مكعبات 2 مل من أرومة الحمراء المتوسطة النمو (غير العادية).
3. ثقافة معزولة splenocytes منخفض الكثافة، مما أثرى في الأرومة الحمراء، على البلاستيك (المرحلة الأولى من الصيام في المختبر الثقافة الكريات الحمر)
   1. عد الخلايا على مكافحة الخلايا الآلي أو يدويا عن طريق عدادة الكريات. العدد المعتاد من الخلايا المعزولة في الطحال في هذه المرحلة هو ~ 15 × 10 ^6.
   2. تعليق خلايا أخرى في الجمعية العامة غير العادية التي تحتوي على السيتوكينات (في وتركيزات إينال): SCF 50 نانوغرام / مل، IL-3 5 نانوغرام / مل، وإبو 2 U / مل.
   3. لوحة 1-5 × 10 ⁶ خلايا في الحجم النهائي من 1 مل / جيد (نفس عدد الخلايا لكل بئر اعتمادا على العدد الكلي للخلايا) من 24 لوحة جيدا خلية ثقافة واحتضان O / N عند 37 ° C / 5٪ CO _2.
4. ثقافة الأرومة الحمراء على الخلايا MS5 (المرحلة الثانية من سرعة في المختبر الثقافة الكريات الحمر
   1. نضح طاف من البلاستيك جيدا ورفع الخلايا (عالي التخصيب في الأرومة الحمراء) وذلك بإضافة 2 مل من EDTA 10 ملي الباردة في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، على الجليد إلى كل بئر.
   2. وضع الخلايا في أنابيب جديدة، ويغسل مرة واحدة في الجمعية العامة غير العادية (بدون السيتوكينات) و resuspend في نفس.
   3. لوحة 5 × 10 ⁵ -1 × 10 ⁶ خلايا في حجم 1-2 مل لكل MS5 بئر من لوحة 24 جيدا المغلفة الخلية. إذا كان يتم استخدام مثبطات الدوائية في التجربة، وإضافتها بتركيزات مناسبة الآن.
   4. احتضان لمدة 6-8 ساعة (الوقت تسترشدالملاحظة المجهرية من حوالي 30٪ -40٪ في استئصال عينة WT غير المعالجة). الربط من الأرومة الحمراء إلى MS-5 خلايا يسرع قلع بهم.
   5. رفع الخلايا من كل بئر وذلك بإضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني الباردة + 10 ملي EDTA، لمدة 5 دقائق، على الجليد. جنبا إلى جنب مع الأرومة الحمراء، كما سيتم جمعها MS-5 ولكن هذه الخلايا يمكن فيما بعد استبعاد بسهولة أثناء تحليل تدفق cytometric كما FSC ^مرحبا Ter119 ^- الخلايا.
   6. في هذه المرحلة، والخلايا يمكن ان تكون ثابتة وملطخة لتحليلها من قبل متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي.

3. تلون الأرومة الحمراء لتوطين البروتينات داخل الخلايا أو الدهون الطوافات خلال قلع بواسطة متعدد الأطياف التصوير التدفق الخلوي

1. غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني، وتدور 525 x ج لمدة 5 دقائق على RT ونضح طاف.
2. إصلاح الخلايا عن طريق إعادة التعليق الكريات الخلية في 500 ميكرولتر من 3.7٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة (قد تختلف وقت التثبيت اعتمادا على المضادةجنرال يجري بحثها) وpipetting بلطف.
3. نقل إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي البلاستيك واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
4. تدور على مقعد ميكروسنتريفوج 2،000 x ج لمدة 20 ثانية، ونضح طاف وأداء واحد يغسل بإضافة 500 ميكرولتر PBS إلى كل أنبوب وpipetting بلطف.
5. تدور على مقعد ميكروسنتريفوج 2،000 x ج لمدة 20 ثانية، ونضح طاف والحفاظ على أنابيب على الجليد لمدة 15 دقيقة على الأقل. Permeablization الخطوات 3،6-3،9 وينبغي أن يتم بسرعة وكفاءة، وبعد الغزل / تطلع على RT، يجب على الفور أن توضع الكريات الخلية مرة أخرى على الجليد، وذلك للخلايا للاحتفاظ أفضل سلامتها.
6. اتخاذ حلول الأسيتون الخروج من الثلاجة -20 درجة مئوية وضعت على الجليد. Permeabilize الخلايا عن طريق إعادة التعليق الكريات الخلية الأولى في 500 ميكرولتر 50٪ الجليد الباردة الأسيتون (01:01 مع DH ₂ O) وpipetting بلطف.
7. تدور على مقاعد البدلاء ميكروسنتريفوج 2،000 x ج لمدة 20 ثانية، وطاف نضح والخلايا في resuspend الكريات في 500 ميكرولتر60، 100٪ الأسيتون الجليد الباردة من قبل pipetting بلطف.
8. تدور على مقاعد البدلاء ميكروسنتريفوج 2،000 x ج لمدة 20 ثانية، وطاف نضح والخلايا في resuspend الكريات مرة أخرى في 500 الجليد الباردة ميكرولتر 50٪ الأسيتون بواسطة pipetting بلطف.
9. تدور على مقاعد البدلاء ميكروسنتريفوج 2،000 x ج لمدة 20 ثانية، ونضح طاف وغسل خلايا مرة واحدة في البرد FACS العازلة (PBS + 0.5٪ BSA) من قبل pipetting بلطف.
10. تحضير الكوكتيل وضع العلامات مع الأجسام المضادة أو علامات لجزيئات من الفائدة: 0.1 ميكرولتر U/100 AF488-phalloidin لتلطيخ F-الأكتين و 1 ميكرولتر μl/100 Ter119-PECy7 لتلطيخ الخلايا محمر. يمكن أيضا أن يتم تلطيخ بديلة أو إضافية باستخدام AF-488 المضادة لل-β تويولين الأضداد (1:50)، AF-594-مترافق الكوليرا السم الوحيدات B لتسمية الطوافات الدهنية (1:200)، ومكافحة pMRLC (Ser19) الأجسام المضادة الأولية للميوسين فسفرته سلسلة ضوء التنظيمية (1:50)، تليها المضادة للأرنب AF-488-مترافق الضد الثانوية (1:400)، ومكافحة γ-الأنبوبةلين أرنب الضد الابتدائي (1:100)، يليه المضادة للأرنب الضد الثانوية AF-555-مترافق (1:300).
11. التالية تطلع طاف، في resuspend الكريات الخلايا في 100 ميكرولتر من علامة الكوكتيل، ماصة بلطف واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
12. إعداد نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة التي تحتوي على 2.5 ميكرومتر من وصمة عار Draq5 النووية.
13. غسل الخلايا في عازلة نظام مراقبة الأصول الميدانية، وتدور باستمرار على مقاعد البدلاء ميكروسنتريفوج 2،000 x ج لمدة 20 ثانية، ونضح وطاف resuspend في 60 ميكرولتر FACS العازلة التي تحتوي على Draq5.
14. عينات تعمل على تدفق عداد الكريات التصوير لجمع ما لا يقل عن 10،000 الأحداث في التجربة، وتعويض ملفات البيانات الخام كما نشرت سابقا ^13، وتحليل النتائج كما هو مبين في الشكل 2، وذلك باستخدام تحليل برامج معينة لتدفق عداد الكريات التصوير.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

أولا، يتم تحليل الخلايا استنادا على Brightfield نسبة الارتفاع (نسبة طول الطفيفة بهم مقابل محور رئيسي بهم) وBrightfield منطقتهم (يدل على حجمها). الأحداث مع انخفاض قيمة Brightfield المنطقة من 20 وأعلى من 200 معظمهم من الحطام والركام الخلية، على التوالي، ويتم استبعادها من التحليل (الش?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في السنوات الأخيرة اكتسبت دراسة قلع أرومة الحمراء الزخم المتزايد لأنها هي خطوة في المختبر في الثقافات الكريات الحمر وهذا هو الأكثر صعوبة في إعادة إنتاج بكفاءة من أجل تحقيق النجاح والإنتاج على نطاق واسع من خلايا الدم الحمراء خارج الحي. حتى وقت قريب، ودراسة ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
αMEM medium	CellGro	15-012-CV
IMDM medium	Hyclone (Thermo Scientific)	SH30228.01
Stempro-34 SFM	GIBCO (Life Tech)	10640
Stempro-34 nutrient supplement	GIBCO (Life Tech)	10641-025
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	512450
BIT9500	Stemcell Technologies	09500
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP-1600-100
Phosphate buffered saline (PBS)	Hyclone (Thermo Scientific)	SH30028.02
Penicillin/Streptomycin	Hyclone (Thermo Scientific)	SV30010
L-glutamine	Hyclone (Thermo Scientific)	SH30590.01
Isothesia (Isoflurane)	Butler-Schein	029405
Histopaque 1.083 mg/ml	Sigma	10831
BD Pharmlyse (RBC lysis buffer)	BD Biosciences	555899
Acetone	Sigma-Aldrich	534064
Formaldehyde	Fisher Scientific	BP 531-500
Hydrocortisone	Sigma	H4001
Stem Cell Factor (SCF)	Peprotech	250-03
Interleukin-3 (IL-3)	Peprotech	213-13
EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO)	AMGEN	available by pharmacy
CD44-FITC antibody	BD Pharmingen	553133
CD71-FITC antibody	BD Pharmingen	553266
Ter119-PECy7 antibody	BD Pharmingen	557853
Phalloidin-AF488	Invitrogen (Life Technologies)	A12379
β-tubulin-AF488 antibody	Cell Signaling	#3623
anti-rabbit AF488-secondary antibody	Invitrogen (Life Technologies)	A11008
anti-rabbit AF555-secondary antibody	Invitrogen (Life Technologies)	A21428
AF594-cholera toxin B subunit	Invitrogen (Life Technologies)	C34777
pMRLC (Ser19) antibody	Cell Signaling	#3671
γ-tubulin antibody	Sigma	T-3559
Syto16	Invitrogen (Life Technologies)	S7578
Draq5	Biostatus	DR50200
Ferrous sulfate	Sigma	F7002
Ferric nitrate	Sigma	F3002
EDTA	Fisher Scientific	BP120500
15-ml tubes	BD Falcon	352099
50-ml tubes	BD Falcon	352098
6-well plates	BD Falcon	353046
24-well plates	BD Falcon	351147
Flow tubes	BD Falcon	352008
Tuberculin syringe	BD	309602
Insulin syringe	BD	329461
Syringe needle 25-G 5/8	BD	305122
Capped flow tubes	BD	352058
40-μm cell strainer	BD Falcon	352340
Scalpel (disposable)	Feather	2975#21
FACS Canto Flow Cytometer	BD
ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer	AMNIS (EMD Millipore)
Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up.	AMNIS (EMD Millipore)
Hemavet 950 Cell Counter	Drew Scientific	CDC-9950-002
NAPCO series 8000WJ Incubator	Thermo scientific
Allegra X-15R Centrifuge	Beckman Coulter	392932
Mini Mouse Bench centrifuge	Denville	C0801