Identifizierung einer Subpopulation Murine Erythroblast Enriched in Enucleating Veranstaltungen durch multispektrale Imaging Durchflusszytometrie

Diamantis G. Konstantinidis; Suvarnamala Pushkaran; Katie Giger; Stefanos Manganaris; Yi Zheng; Theodosia A. Kalfa

doi:10.3791/50990

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Method Article

Identifizierung einer Subpopulation Murine Erythroblast Enriched in Enucleating Veranstaltungen durch multispektrale Imaging Durchflusszytometrie

DOI:

10.3791/50990

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June 6th, 2014

Diamantis G. Konstantinidis¹, Suvarnamala Pushkaran¹, Katie Giger¹, Stefanos Manganaris², Yi Zheng¹, Theodosia A. Kalfa¹

¹Cancer and Blood Diseases Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, University of Cincinnati College of Medicine, ²IBM

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Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein neuartiges Verfahren zur Identifizierung einer Bevölkerung von orthochromatischen Erythroblasten enucleating durch multispektrale Bildgebung Durchflusszytometrie, die eine Visualisierung der Erythroblasten Enukleation Prozess.

Zusammenfassung

Erythropoese bei Säugetieren schließt mit der dramatischen Prozess der Entkernung, die in Retikulozyten-Bildung führt. Der Mechanismus der Enukleation ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Ein gemeinsames Problem, das bei der Untersuchung der Lokalisation von Schlüsselproteinen und Strukturen innerhalb enucleating Erythroblasten durch Mikroskopie ist die Schwierigkeit, eine ausreichende Anzahl von Zellen, die eine Enukleation beobachten. Wir haben eine neue Analyse-Protokoll mit Multi High-Speed-Cell-Imaging in Strom (Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie), eine Methode, die Immunfluoreszenz-Mikroskopie kombiniert mit Durchflusszytometrie, um effizient eine erhebliche Anzahl von enucleating Ereignisse zu identifizieren entwickelt, die erlaubt zu erhalten, Messungen und statistische Analysen.

Wir beschreiben hier zunächst zwei in-vitro-Kultur, um die Erythropoese verwendet, um Maus Erythroblasten synchronisieren und erhöhen die Wahrscheinlichkeit der Erfassung Enukleation bei th Methodene Zeit der Auswertung. Dann beschreiben wir im Detail die Färbung von Erythroblasten nach Fixierung und Permeabilisierung, um die intrazelluläre Lokalisation von Proteinen oder Lipidflößen in Enukleation durch multispektrale Abbildungs Durchflusszytometrie studieren. Neben Größe und DNA/Ter119 Färbung, die verwendet werden, um die orthochromatischen Erythroblasten zu identifizieren, nutzen wir die Parameter "Seitenverhältnis" einer Zelle, in der Hellfeld-Kanal, der in der Anerkennung des langgestreckten Zellen und "delta Schwerpunkt XY Ter119/Draq5 hilft "ermöglicht, daß die Identifizierung der zellulären Ereignisse, bei denen das Zentrum der TER119-Färbung (naszierenden Retikulozyten) weit von der Mitte der DRAQ5 Färbung (Kern zogen Extrusion), was auf eine Zelle, die enucleate. Die Teilmenge der orthochromatischen Erythroblasten Bevölkerung mit qualitativ Delta Schwerpunkt und niedrigem Aspektverhältnis ist sehr in enucleating Zellen angereichert.

Einleitung

Terminalen Differenzierung innerhalb der erythroiden Abstammungslinie in Säugern schließt mit der drastisch Prozess der Enukleation, durch die der orthochromatischen Erythroblasten treibt seine Membran umhüllten Kern (pyrenocyte) ^1, Erzeugen eines ^{Retikulozyten-2.} Der genaue Mechanismus dieses Prozesses, der auch der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für eine erfolgreiche, große Produktion von roten Blutzellen in vitro, ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Die Lokalisierung von Schlüsselproteinen und Strukturen innerhalb enucleating Erythroblasten beruht auf der Verwendung von Fluoreszenz-und Elektronenmikroskopie ^3-5. Di....