JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

この議定書は、赤芽球摘出プロセスの可視化を提供し、フローサイトメトリーマルチスペクトルイメージングフローによりオルソ赤芽球を除核の集団を同定する新規な方法を説明します。

要約

哺乳動物の赤血球生成は、赤血球の形成をもたらす摘出の劇的プロセスを終了します。摘出のメカニズムはまだ完全には解明されていない。顕微鏡による除核の赤芽球内の主要なタンパク質や構造物の局在を研究する際に遭遇する一般的な問題は、摘出を受けている細胞の十分な数を観察することが困難なことである。我々は、フロー内のマルチパラメータの高速セルイメージング（マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー）を効率的に除核事象のかなりの数を識別するために、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法を組み合わせた方法を用いて新規な分析プロトコルを開発し、それはを可能にする測定値を取得し、統計解析を行う。

まず、ここでは、マウス赤芽球を同期し、目に摘出を捕捉する確率を増加させるために使用される2つのin vitro赤血球新生培養法を記載評価のE時間。次に、我々は、マルチスペクトル画像フローサイトメトリーによる除核の間の細胞内タンパク質または脂質ラフトの局在化を研究するために詳細に固定および透過処理後の赤芽球の染色を記載する。サイズおよびオルソ赤芽球を識別するために使用されDNA/Ter119染色と共に、我々は、細長い細胞の認識および「デルタ重心XY Ter119/Draq5に役立つ明視野チャンネル内のセルのパラメータ「アスペクト比」を利用"それはTER119染色（新生網赤血球）の中心は、このように脱核するのに約セルを示す、遠く離れDRAQ5染色（押出を受けて核）の中心からである細胞事象の同定を可能にする。高いデルタ重心と低アスペクト比を有するオルソ赤芽球集団のサブセットは高度に細胞を除核内に濃縮される。

概要

哺乳動物の赤血球系統内の端末分化はオルソ赤芽球は赤血球2を生成し 、その膜包ま核（pyrenocyte）1を排出を通して摘出の劇的過程でまとめられる。また、インビトロで赤血球の成功した、大規模生産の律速段階であるこのプロセスの正確なメカニズムは、まだ完全には解明されていない。除核の赤芽球内の主要なタンパク質や構造物の局在は、蛍光および電子顕微鏡3-5の使用に依存している。この面倒なプロセスは、一般的に摘出イベントの限られた数の識別をもたらし、常に意味のある統計的な分析を可能にしていません。マクグラスら 6により、前述の赤芽球の識別方法に拡大し、我々は、マルチスペクトルいまで摘出イベントを特定し、研究する新しいアプローチを開発した測定値を取得し、統計分析を実行するために十分な数の観測値を提供することができるエージングフローサイトメトリー（フローにおける多パラメータの高速セルイメージング、フローサイトメトリーと蛍光顕微鏡を組み合わせた方法）7。

ここでは、赤芽球を同期し、評価時に摘出を捕捉する確率を増加させるために使用される最初の2つのin vitroでの赤血球形成培養法を記載している。その後、我々は、マルチスペクトル画像フローサイトメトリーによる除核の間の細胞内タンパク質または脂質ラフトの局在化を研究するために詳細に固定および透過処理後の赤芽球の染色を記載する。

サンプルは、フローサイトメーターイメージングフロー上で実行され、回収した細胞をオルソ赤芽球6を識別するために、適切にゲートされています。明いまで測定されるオルソ赤芽球は、次​​いで、それらのアスペクト比に基づいて分析されそれぞれTER119及びDNAのために染色された領域の中心間の距離として定義されるパラメータデルタ重心XY TER119-DNA、のためのそれらの値に対するエージング。低アスペクト比及び高いデルタ重心XY Ter119/DNAを有する細胞の集団は、高度に細胞を除核内に濃縮される。 - / -たRac2上のRac1のMX-Creを媒介条件の削除と赤芽球に対する野生型（WT）赤芽球を使用して、または組み合わせたRac2 - / - ; RAC3 - / -遺伝的背景およびマルチスペクトル画像のこの新規な分析プロトコルは、フローサイトメトリー、我々は最近、脱核が非対称分裂に似ているし、RACのGTPaseによって部分的に調節アクトミオシン環の形成が摘出進行7のために重要であるとことを明らかにした。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

体外赤血球文化の中で 1。長期（ex vivoで赤血球分化培養プロトコルGiarratanaによるら 8、修正およびマウス細胞に適応）

これは、in vitro赤血球生成プロトコルで 3段階の長期的である。最初のステップ（0〜4日目）は、2×10 5細胞/ mlを、幹細胞因子（SCF）、インターロイキン-3（IL-3）、エリスロポエチン（EPO）を補充した赤芽球増殖培地中に置かれる。第二工程（5-6日間）において、細胞は、Epoを用いてのみ補充した新鮮赤芽球の増殖培地中で接着性間質細胞上/ mlで共培養し、2×10 5細胞（MS5）に再懸濁する。第三段階（7-9日間）において、細胞は、最大除核のサイトカイン（ 図1A）なしの新鮮な赤芽球の増殖培地中のMS-5細胞の層上で培養される。

全ての動物プロトコルはの施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されたシンシナティ小児病院医療センター。

  1. 骨および低密度骨髄細胞の単離の収穫
    1. 2ミリリットルを15 mlのコニカルチューブ中の2％ウシ胎児血清（FBS）を含有する滅菌IMDMを追加し、氷上に保つ。
    2. 機関が承認したプロトコル（頸椎脱臼に続いて例えば 、CO 2吸入、）は、次の（興味のある遺伝的に標的とするマウスの有無にかかわらず一緒に）2-6ヶ月の野生型C57/BL6マウスを安楽死させる。
    3. 、鉗子やメスを用いて骨盤骨、大腿骨、および両足の脛骨を分離IMDM +2％FBSを含むチューブに追加し、氷上に保つ。
    4. 1ミリリットルピンセットを用いて、滅菌フローサイトメトリーチューブとフラッシュ骨にIMDM +2％FBSおよび25-G×5/8 "針でツベルクリン注射器を追加します。フラッシュIMDM +2％FBS、骨を通して数回静かに（ ）を細胞懸濁液から〜500μLを吸引し、骨を再度フラッシングすることにより、およびフローcytometrに骨髄細胞を採取Yチューブ。骨が白くなったフラッシングは完了です。
    5. 50 mlのコニカルチューブの上に40μmのセルストレーナーセットを介して細胞懸濁液をフィルタリングする。 IMDM +2％のFBSと同じ培地を5mlの細胞懸濁液の最終体積を調節用いてセルストレーナーを洗浄する。
    6. 密度勾配遠心分離により、低密度骨髄細胞（LDBM）を準備し、慎重に25 750×gで15 mlチューブ、スピンでグラム/ mlの培地密度勾配細胞分離5mlの1.083に細胞懸濁液を5ml層ブレーキなし/低加速しながら、室温（RT）で分。
    7. 新しい15 mlチューブに上清（軟膜を取得するために15 mlチューブの2 mlのマークについてのすべてをバックアップ）を転送して、5分間525×gでIMDM +2％FBSで1以上の洗浄を行うRT。
    8. 上清を吸引し、室温で5分間、3ミリリットルRBC溶解緩衝液中にペレットを再懸濁させることによって、残りの赤血球（RBC）を溶解する。赤芽球の高い純度がある場合最後のステップ（生化学的研究用など ）で必要とされる、磁気分離による林NEG細胞に、このステップでさらにLDBM細胞を浄化する。
  2. LDBMまたはLIN NEG細胞 （ 図1A）から開始してex vivoで赤血球分化培養プロトコル
    1. 追加7ミリリットルIMDM +2％のFBS、5分およびRTでなる2mlの赤芽球増殖培地（EGM）中でペレット化した細胞を再懸濁するために525×gでスピン。
      A。 STEMPRO-34培地を含む
      B。 2.6％STEMPRO-34培地補充、
      C。 20％BIT-9500、
      D。 900 ng / mLの硫酸第一鉄、
      E。 90 ng / mLの硝酸鉄、
      F。 100単位/ mlペニシリン/ストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン
      グラム。 10 -6 Mヒドロコルチゾン
      H。および新たなサイトカインを追加しました：
      I）100 ng / mlのSCF、
      ii）の5 ng / mlのIL-3、および
      III）3 IU / mlのエポ。
    2. 裾を使用して自動化細胞カウンターを用いてまたは手動で顕微鏡で細胞を数えるocytometer。
    3. 5×10 5細胞/ウェルにEGM 2.5ミリリットル（2×10 5 LDBM細胞/ ml）の最終体積の濃度で6ウェル細胞培養プレートにおいてプレートし、37°C（インキュベートこれが考慮される文化の日の＃0など）。
    4. 、上清の1.5ミリリットルを吸引室温で5分間525×gでスピンし、すべての3サイトカインを含有し、日中2に戻ってウェルに毎日を追加する新鮮な培地1.5mLに再懸濁することによりメディアを変更し、3、4、最適化する増殖期。 3日目に、すべての細胞を除去カウントし、約2×10 5細胞/ mlの細胞ウエル濃度を維持するために適切な数のウェルに分割する。 37℃/ 5％CO 2で培養物を維持する。
    5. 4日目に、新たな細胞培養6ウェルプレートのウェルにプレートMS5細胞（マウス間質細胞株）。 MS5細胞培養培地は、20％FBS、100単位/ mlペニシリン/ストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを含有するα-MEMである。
    6. 5日目に、数を数える血球計数器を用いて顕微鏡で自動細胞カウンターを用いてまたは手動で元の培養プレートの各ウェル中の細胞（現在著しく赤芽球に富む）。
    7. 各ウェルからすべてのセルを持ち上げて、15 mlのコニカルチューブに移し、室温で5分間525×gでスピンダウンし、上清を吸引し、および2×10の濃度にのみEPO（3 IU / ml）を含む新鮮なEGMでペレットを溶解5細胞/ ml。
    8. MS-5細胞は、前日めっき（共培養時には70〜80％の集密度をターゲット）とEPOのみの（ではないが、その培地を含むEGMでこれらのウェル中の赤血球細胞を追加したウェルから上清を吸引し選択は、MS-5細胞）数日間、EGMでよく生き残る。
    9. 日の＃6に新鮮なEPOを追加する培地交換。
    10. 無添加サイトカインとEGMを使用して、その日の＃7にメディアを変更します。毎日、抗TER119及びSYTO-16で染色した後、フローサイトメトリーによる除核およびp日間7〜9、試験サンプル上のマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー（3章で詳述）のためのサンプルを染色するroceed。
      注：メッキ前と2日目に、4、6、および培養7、サイズ（FSC）対表面マーカーCD44およびTER119を評価することにより、フローサイトメトリーで赤芽球濃縮および分化のための培養細胞をモニター9また、CD71、TER119、およびFSC。また、10、11を使用することができる。

2。高速除核アッセイ、吉田らが記載したプロトコルに従って。変更した12（図1B）

  1. in vitroの赤血球生成培養のためのストレス赤血球生成誘導と間質細胞調製
    1. 動物実験委員会のガイドライン（ 例えばイソフルラン溶液による）あたりの2-6ヶ月の野生型C57/BL6マウスを麻酔。マウスが十分に緩やかな後足のピンチに反射的反応の欠如のためにとのチェックをして麻酔されていることを確認してください手順の間に定期的な呼吸。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医眼軟膏を使用してください。
    2. 500μLの最終容量に出血尾を経由して、ストレス赤血球生成を誘導する。インスリン注射器を用いて、動物の腹腔内に流体蘇生（注入する前に、トレンデレンブルグ体位に動物を保持し、内臓を傷つけないように下腹部に注射する）を保証するために生理食塩水を等量のを注入する。
    3. ケージの周りを移動し始めと陥ることなく、立って歩くことができるという動物によって示されるように、モータ制御を取り戻したまで無人マウスを放置しないでください。 phlebotomizedマウスは他のマウスなしでケージに入れている。
    4. 2日後、24ウェル細胞培養プレートのウェル中のMS-5細胞をプレート。 70〜80であることを目標とMS5細胞培地中で37℃/ 5％CO 2（20％FBS、100単位/ mlペニシリン/ストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを含有する-MEM）でのMS-5細胞をインキュベート％コンフルエントのI48時間後、n個のプレートウェル。
  2. 脾細胞の脾臓および処理の収穫
    1. 四日（96時間）ストレス赤血球生成誘導後、動物実験委員会が承認したプロトコル（頸椎脱臼に続いて例えば 、CO 2吸入）を通じて以前に出血させ、マウスを安楽死させる。
    2. 収穫脾臓とIMDM 2％FBSを含む15 mlのコニカルチューブに入れ、氷上に保つ。
    3. 背中の研究室では、無菌条件下で組織培養フード内で、50 mlチューブの上にセットさ40μmのセルストレーナーに脾臓を含むチューブを反転させる。 5 mlのプラスチックシリンジのプランジャーを使用して脾臓をつぶす。
    4. IMDM +2％FBSを細胞ストレーナーを洗浄し、同じ培地を用いて、5mlまでの細胞懸濁液の最終体積を調整します。
    5. 慎重にブレーキなし/低加速して、室温で25分間750×gで15 mlチューブとスピンで5ミリリットルの密度勾配細胞分離培地1.083グラム/ミリリットルで5ミリリットル脾臓細胞浮遊液を重ね。
    6. 転送新しい15 mlチューブに、室温で5分間525×gでIMDM +2％FBSを含む1以上の洗浄を行い、上清（バフィーコートを取得するために15 mlチューブの2 mlのマークについてまで溶液） 。
    7. 上清を吸引し、室温で5分間、3ミリリットルRBC溶解緩衝液中でペレットを再懸濁することによって赤血球を溶解する。
    8. 7ミリリットルIMDM +2％のFBSで細胞を洗浄し、4℃で5分間、525×gでRBC溶解緩衝液とスピンを希釈し、中和するために追加
    9. 上清を吸引し、および赤芽球増殖培地（EGM）2mlにペレット化した細胞を一時停止。
  3. プラスチック上の赤芽球が濃縮された孤立した低密度脾細胞、（高速のin vitro赤血球生成文化の第一段階）の培養
    1. 自動細胞カウンターにまたは手動で、血球計数器で細胞を数える。この段階では、脾臓当たりの単離された細胞の通常の数は、約15×10 6である。
    2. fで（サイトカインを含む更な​​るEGM内のセルを一時停止inal濃度）：SCF 50 ng / mlのIL-3 5 ng / mlの、そしてエポ2単位/ ml。
    3. / 24ウェル細胞培養プレートを1ml /ウェル（ウェルの細胞の総数に応じて当たりのセルの数が同じ）の最終体積中で、37℃でO / Nインキュベート板1〜5×10 6細胞5％CO 2。
  4. MS5細胞に対する赤芽球の培養物（ 体外赤血球産生培養において 、高速の第二段階
    1. 吸引穴プラスチックからの上清各ウェルに氷の上に、5分間PBS中に冷たい10mMのEDTAの2ミリリットルを追加することによって、（強く赤芽球が濃縮された）細胞を持ち上げる。
    2. （サイトカインなしで）EGMで一度洗って同じに再懸濁、新しいチューブに細胞を入れた。
    3. 1〜2 mLの量のプレート5×10 5 -1×10 6個の各MS5細胞で被覆された24ウェルプレートのウェル。薬理学的阻害剤は、実験に使用されている場合は、ここで適切な濃度で追加してください。
    4. によって導か6から8時間（時間インキュベート未処理のWTサンプル中の約30％-40％の摘出）の顕微鏡観察。 MS-5細胞に対する赤芽球の結合は、彼らの摘出を加速させる。
    5. 氷上で5分間、冷PBS + 10 mMのEDTAを2mlを添加することにより、各ウェルから細胞を持ち上げ。赤芽球と一緒に、MS-5細胞も収集することができるが、これらは、後で簡単にFSC こんにちは TER119として、フローサイトメトリー解析の際に除外することができます-細胞。
    6. この段階で、細胞をマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる分析のために固定し、染色することができる。

3。マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる除核の間に細胞内タンパク質または脂質ラフトの局在化のための赤芽球の染色

  1. RTおよび上清を吸引し、5分間525×gでのスピン、PBS中で細胞を洗浄。
  2. （固定時間が反によって異なる場合があり、15分間、PBS中の3.7％ホルムアルデヒド500μlの細胞ペレットを再懸濁することにより細胞を固定GENはプロービング）し、穏やかにピペッティングしている。
  3. 1.5 mlのプラスチック製遠心管に移し、室温で15分間インキュベートする。
  4. 20秒台微量2000 XGスピン、上清を吸引し、各チューブに500μlのPBSを添加し、緩やかにピペッティングすることによりワンウォッシュを行う。
  5. 20秒、吸引上清ベンチ微量2,000 XGでスピンし、少なくとも15分間氷上でチューブを保持します。透過化は、3.6から3.9は、迅速かつ効率的に行うべきであり、RTにて紡糸/吸引の後、細胞ペレットを直ちに細胞は、より自分の完全性を維持するために、氷上に戻すべきであるステップ。
  6. -20℃の冷凍庫からアセトン溶液を取り出し、氷上に置く。穏やかに500μlの氷冷50％アセトン（のdH 2 Oとの1:1）ピペッティングで第細胞ペレットを再懸濁することにより細胞を透過。
  7. 20秒、吸引上清500μLに再懸濁細胞ペレット用のベンチ微量2,000 XGでのスピン60;優しくピペッティングによる氷冷100％アセトン。
  8. 20秒台微量2000 XGスピン、上清を吸引し、静かにピペッティングして500μLの氷冷50％アセトン中でもう一度細胞ペレットを懸濁します。
  9. ベンチのマイクロスピン2000 20秒XG、上清を吸引し、穏やかにピペッティングすることにより冷FACSバッファー（PBS +0.5％BSA）で細胞を1回洗浄します。
  10. 目的の分子に対する抗体またはマーカーで標識カクテルを準備します。赤血球細胞染色用のF-アクチン染色および1μl/100μLTER119-PECy7 0.1 U/100μlのAF488-ファロイジンを。代替的または追加的染色も（1:50）、AF-594-結合コレラ毒素サブユニットB脂質ラフトを標識する（1:200）、抗pMRLC（Ser19）AF-488-抗β-チューブリン抗体を用いて行うことができる一次抗ウサギAF-488結合二次抗体（1:400）、続いて、リン酸化ミオシン制御軽鎖に対する抗体（1:50）、および抗γ-tubu抗ウサギAF-555結合二次抗体（1:300）、続いて林一次ウサギ抗体（1:100）。
  11. 上清を吸引後、穏やかにマーカーカクテル100μlのピペットで細胞ペレットを再懸濁し、RTで30分間インキュベートする。
  12. 核染色のDRAQ5の2.5μMを含むFACS緩衝液を準備します。
  13. ベンチマイクロ遠心にDRAQ5を含む60μlのFACS緩衝液中で20秒、吸引上清と再懸濁のために2000×gでスピンダウン、FACS緩衝液で細胞を洗浄。
  14. イメージングで実行試料は、撮像に固有解析ソフトウェアフローサイトメーターを用いて、実験あたり少なくとも10,000の事象を収集し、以前に公表13として生データファイルを補償し、 図2に示すように、結果を分析するフローサイトメーター。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

まず、細胞は、その明のアスペクト比（その長軸に対して彼らの未成年の長さの比）とそれらの明領域（その大きさの指標）に基づいて分析する。明Area値20を下回ると、200よりも高いとのイベントには、それぞれ、主に破片および細胞凝集体である、と分析（ 図2A）から除外されます。単一細胞（ゲート「R1」）は、画像の鮮鋭度を示すグラデーションRMSパラメータのためのそれ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

それはex vivoで赤血球の正常な、大規模生産を達成するために効果的に再現するのが最も困難であるインビトロ赤血球新生培養における工程であるため、近年、赤芽球除核の研究が増加する勢いを得ている。最近まで、赤芽球摘出利用主に蛍光顕微鏡の研究とは、フローサイトメトリー法。蛍光顕微鏡法は、関与する分子を同定するのに有用ではあるが、特定の時点で固定された...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

開示事項

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

謝辞

著者は、専門家の技術サポートのためにAmnisコーポレーション（EMD Millliporeの一部）からシンシナティ小児病院研究財団とリチャードDemarcoの、Sherree友人、そしてスコットモルデカイの研究フローサイトメトリーコアに感謝します。この作品は、国立衛生研究所によってサポートされていましたK08HL088126とR01HL116352（TAK）とP30のDK090971（YZ）を付与します。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
αMEM mediumCellGro15-012-CV
IMDM mediumHyclone (Thermo Scientific)SH30228.01
Stempro-34 SFMGIBCO (Life Tech)10640
Stempro-34 nutrient supplementGIBCO (Life Tech)10641-025
Fetal Bovine Serum (FBS)Atlanta Biologicals512450
BIT9500Stemcell Technologies09500
Bovine Serum Albumin (BSA)Fisher ScientificBP-1600-100
Phosphate buffered saline (PBS)Hyclone (Thermo Scientific)SH30028.02
Penicillin/StreptomycinHyclone (Thermo Scientific)SV30010
L-glutamineHyclone (Thermo Scientific)SH30590.01
Isothesia (Isoflurane)Butler-Schein029405
Histopaque 1.083 mg/mlSigma10831
BD Pharmlyse (RBC lysis buffer)BD Biosciences555899
AcetoneSigma-Aldrich534064
FormaldehydeFisher ScientificBP 531-500
HydrocortisoneSigmaH4001
Stem Cell Factor (SCF)Peprotech250-03
Interleukin-3 (IL-3)Peprotech213-13
EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO)AMGENavailable by pharmacy
CD44-FITC antibodyBD Pharmingen553133
CD71-FITC antibodyBD Pharmingen553266
Ter119-PECy7 antibodyBD Pharmingen557853
Phalloidin-AF488Invitrogen (Life Technologies)A12379
β-tubulin-AF488 antibodyCell Signaling#3623
anti-rabbit AF488-secondary antibodyInvitrogen (Life Technologies)A11008
anti-rabbit AF555-secondary antibodyInvitrogen (Life Technologies)A21428
AF594-cholera toxin B subunitInvitrogen (Life Technologies)C34777
pMRLC (Ser19) antibodyCell Signaling#3671
γ-tubulin antibodySigmaT-3559
Syto16Invitrogen (Life Technologies)S7578
Draq5BiostatusDR50200
Ferrous sulfateSigmaF7002
Ferric nitrateSigmaF3002
EDTAFisher ScientificBP120500
15-ml tubesBD Falcon352099
50-ml tubesBD Falcon352098
6-well platesBD Falcon353046
24-well platesBD Falcon351147
Flow tubesBD Falcon352008
Tuberculin syringeBD309602
Insulin syringeBD329461
Syringe needle 25-G 5/8BD305122
Capped flow tubesBD352058
40-μm cell strainerBD Falcon352340
Scalpel (disposable)Feather2975#21
FACS Canto Flow CytometerBD
ImagestreamX Mark II Imaging Flow CytometerAMNIS (EMD Millipore)
Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up.AMNIS (EMD Millipore)
Hemavet 950 Cell CounterDrew ScientificCDC-9950-002
NAPCO series 8000WJ IncubatorThermo scientific
Allegra X-15R CentrifugeBeckman Coulter392932
Mini Mouse Bench centrifugeDenvilleC0801

参考文献

  1. McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of "pyrenocytes" in the mammalian fetus. Blood. 111, 2409-2417 (2008).
  2. Chasis, J. A., Mohandas, N. Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis. Blood. 112, 470-478 (2008).
  3. Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts. J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).
  4. Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).
  5. Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation. Blood. 116, 3331-3340 (2010).
  6. McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
  7. Konstantinidis, D. G., et al. Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation. Blood. 119, 6118-6127 (2012).
  8. Giarratana, M. C., et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
  9. Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2009).
  10. Kalfa, T. A., et al. Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen. Haematologica. 95, 27-35 (2010).
  11. Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. J Vis Exp. , (2011).
  12. Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells. Nature. 437, 754-758 (2005).
  13. Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

88 FACS XY

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved