هندسة الأنسجة: بناء ومتعددة الخلايا 3D سقالة لتسليم الطبقات صفائح خلية

Summary

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Abstract

العديد من الأنسجة، مثل قلوب البشر البالغين، غير قادرين على تجديد كاف بعد الضرر. ^2،3 استراتيجيات في هندسة الأنسجة تقترح الابتكارات لمساعدة الجسم على الشفاء والإصلاح. على سبيل المثال، قد يكون النهج TE قادرة على تخفيف إعادة القلب بعد احتشاء عضلة القلب (MI)، وربما زيادة إجمالي وظائف القلب إلى القريب العادي قبل MI مستوى ⁴ كما هو الحال مع أي نوع من الأنسجة وظيفية، وتجديد أنسجة القلب الناجح ينطوي على تسليم السليم لل أنواع الخلايا متعددة مع العظة البيئية لصالح التكامل وبقاء الكسب غير المشروع زرع خلية / الأنسجة. يجب أن تعالج الأنسجة المهندسة معلمات متعددة بما في ذلك: الإشارات القابلة للذوبان، خلية الى خلية التفاعلات، والمواد مصفوفة تقييم وسائل إيصالها، آثارها على بقاء الخلية، والقوة المادية، وتسهيل وتنظيم الخلايا إلى الأنسجة. الدراسات باستخدام الحقن المباشر للخلايا الكسب غير المشروع فقط تجاهل هذه العناصر الأساسية. ^2،5،6لم يتم بعد إعداد تصميم النسيج الجمع بين هذه المكونات. هنا، نقدم مثالا لتصاميم متكاملة باستخدام طبقات من ألواح الخلايا منقوشة مع نوعين متميزين من المواد البيولوجية المشتقة من نوع من الخلايا التي تحتوي على الجهاز المستهدف والخلايا البطانية لتعزيز تكوين الأوعية جديد في "نسيج". على الرغم من أن هذه الدراسات تركز على توليد أنسجة تشبه القلب، وهذا التصميم الأنسجة يمكن تطبيقها على العديد من الأجهزة الأخرى من القلب مع تصميم المواد والحد الأدنى من التغييرات، ومن المفترض أن يكون المنتج قبالة الجاهزة للاستخدام للعلاجات التجدد. بروتوكول يتضمن خمس خطوات مفصلة. ويستخدم البولي درجة الحرارة حساسة (N -isopropylacrylamide) (pNIPAAM) لأطباق زراعة الأنسجة معطف. ثم، وخلايا أنسجة محددة يتم تربيتها على سطح لوحات مغلفة / أسطح micropattern لتشكيل خلية ورقة مع التصاقات جانبية قوية. ثالثا، يتم إنشاء مصفوفة قاعدة للأنسجة عن طريق الجمع بين مسامية مصفوفة مع permissi التوعية المستحدثةلقد الهلاميات المائية والخلايا البطانية. وأخيرا، يتم رفع الأوراق خلية من الأطباق pNIPAAM المغلفة ونقل إلى قاعدة عنصر، مما يجعل بناء كاملة.

Introduction

Injection of cells and/or single materials alone has shown variable success in other organ systems and limited success in cardiac regeneration.^5,7-12 Currently, stem cell-derived cells are delivered to damaged tissue using a variety of delivery methods including: direct cell injection into tissue and perfusion into the blood supply.^13-17 Others have implanted cells alone, materials alone and/or in combination with material carriers to help regenerate damaged organs.^18-21 This design combines multiple strategies that provide material strength, patterning in multiple materials and multiple cell types.

Specifically, the base acellularized fibrous matrix provides the foundational physical strength to the construct, making it suitable for suturing in into the patient, if necessary. The void spaces in the base matrix are filled with endothelial cells in a neovascular permissive hydrogel²² for rapidly establishing vascularization of the implanted construct. This composite is then integrated with pre-patterned cell sheets that allow enhanced cell-to-cell communication, more closely mimic the native tissue.^1,23-25 The overall production process for the layered cellular patch is outlined by the flowchart in Figure 1.

Protocol

1. إنشاء لوحات pNIPAAM المغلفة

1. حل 2.6 غرام من pNIPAAM في 2 مل من / 40٪ محلول الهكسان 60٪ التولوين.
2. حرارة الخليط إلى 60 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة أثار، حتى يتم حل pNIPAAM.
3. قطع ورق الترشيح في دائرة قطرها 60 ملم ورقة مكان في قمع بوخنر.
4. تصفية حل من خلال بوخنر القمع في وزنه قبل دورق زجاجي (لا تستخدم البلاستيك، والهكسان سوف تذوب البلاستيك).
5. ضع الكأس ومحتوياتها في فراغ جرس (24 رطل) O / N (16 ساعة). ملاحظة: حتى يتفاعل مع بقايا الآيزوبروبيل سيكون أكسدة لذلك تأكد من أنها لا تأتي في اتصال مع الأوكسجين.
6. تزن الكأس لتحديد وزن pNIPAAM.
7. إضافة ايزوبروبيل إلى pNIPAAM، وخلق 50/50 ث / ث الحل.
8. ضع 2 مل من محلول على سطح لوحة زراعة الأنسجة، ومعطف لمدة 5 دقائق تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
9. غسل لوحة مع 2 مل من برنامج تلفزيوني الدافئ مرتينقبل استخدام لثقافة الخلية.

2. إنشاء خلية صفائح

ملاحظة: يمكن إنشاء أوراق خلية من الخلايا الأولية للجهاز الهدف باستخدام عدد من الأساليب المختلفة، أو طلاء الأسطح زراعة الأنسجة مع الحرارية استجابة البوليمر كما هو موضح هنا. وتقدم لوحات الحرارية الحساسة قبل المغلفة أيضا عدد من البائعين.

ملاحظة: هذا البروتوكول هو لثقافة استخدام طبق 35 ملم. باختصار، يتم تحضين الخلايا أولا عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة عند التقاء لتأسيس اتصالات جانبية بين الخلايا المجاورة. للافراج عن صحائف خلية، يتعرض لوحات لدرجات حرارة أقل من 32 درجة مئوية. ثم يتم نقل ورقة الخلية إلى قاعدة مصفوفة ليفية قوية تحتوي على هيدروجيل متساهل التوعية المستحدثة مع الخلايا البطانية في الأوعية الدموية.

1. عزل السكان الخلية. ملاحظة: هذه الطريقة تعتمد على إجراءات اشتقاق الفردية ونوع من الخلايا. الفئران مو سلس الأبهروتستخدم خلايا scle (RASMC) في هذا المثال. هذه هي خلايا العضلات الملساء معزولة الأولية من الشريان الأورطي البطني من الفئران.
2. غسل الخلايا مع 2 مل من PBS الدافئ.
3. إضافة 3 مل من التربسين (أو الشق الآخر / حل يفصل) إلى الخلايا لمدة 5 دقائق.
4. تمنع التربسين بإضافة 3 مل من وسائل الإعلام والثقافة، أو حل العازلة الفوسفات (PBS) التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS).
5. جمع الخلايا في أنبوب مخروطي الشكل والاعتماد قسامة.
6. تدور الخلايا في 1،000 دورة في الدقيقة (228 x ج) لمدة 5 دقائق.
7. نضح وطاف resuspend الخلايا في وسائل الإعلام نموها (يتم استخدام SmGM2 بالإضافة إلى عدة رصاصة مستنبت للRASMC).
8. وضع وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا على 35 ملم الحرارية الحساسة وحة - pNIPAAM لوحة المغلفة بتركيز التي من شأنها تحقيق 100٪ التقاء. ملاحظة: للحصول RASMCs تم تحديد هذا العدد ليكون 100،000 خلية / سم ^2. ولكن نظرا لفقدان الخلايا أثناء وفاة، و 120٪ من ذلك فا يستخدم LUE.
9. وضع في حاضنة عند 37 درجة CO / N. ملاحظة: من المهم للحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية للحفاظ على التصاق الخلية إلى لوحة.

3. إعداد مصفوفة التأسيسية

ملاحظة: مختلف المصفوفات ليفية 3D يمكن استخدامها لطبقة مصفوفة ليفية قوية بين الأوراق الخلايا الحساسة. وتشمل بعض الأمثلة: جلفوم، bioglass والمواد الطبيعية acellularized ²⁶ أو nanospun المواد ^27،28 وقدمت المثانة البولية الخنزير مصفوفة (UBM) المستخدمة في هذه الدراسات بسخاء من وجهة نظرنا متعاون، الدكتور Badylak ^29.

1. قبل استخدامها، وتحديد خصائص المصفوفة بما في ذلك عدم وجود محتوى الخلوي إذا تم استخدام مصفوفة decellularized، ^27،28 بقاء الخلية المحددة، والفضاء باطل ²²
2. قطع مصفوفة تعقيمها قبل إلى الحجم المطلوب والشكل. ملاحظة: وهنا، يستخدم حفرة لكمة لقطع دائرة قطرها 4 مم.

ve_title "> 4. الخلايا البطانية لحصد في حديث التوعي متساهل هيدروجيل

ملاحظة: يمكن الحصول على الخلايا البطانية من مجموعة متنوعة من المصادر، بما في ذلك التمييز من الخلايا الجذعية أو السلف. هنا، وتستخدم HuVECs.

1. استخدام أي هيدروجيل متساهل (الليفين، والمواد الهلامية الكولاجين) لفترة طويلة كما المرة عبر ربط قصيرة بما يكفي للسماح للخلايا تبقى قابلة للحياة. ملاحظة: هنا، هلام لHyaluronan (HA) على ربط عبر مع يستخدم جسر ثاني كبريتيد.
2. إعداد هيدروجيل HA وفقا لبروتوكول الشركة.
3. جمع الخلايا البطانية وتفريق في حل وحيد الخلية باستخدام 1X التربسين. ملاحظة: يمكن أيضا Accutase أو خلية التفكك العازلة استخدامها لتشتت خلية واحدة.
4. تنشيط انزيم التربسين باستخدام مبلغ مساو من مثبط التربسين فول الصويا (إذا كان من المهم أن الخلايا لا تتلامس مع المصل) أو 10٪ FBS في برنامج تلفزيوني، وجمع الحل / الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل.
5. Count الخلايا، وحساب حجم الحاجة للأبعاد التصحيح (كميا سابقا). ملاحظة: للحصول على 4 ملم التصحيح، وتستخدم هنا من 2 مليون الخلايا البطانية.
6. استخراج خلايا من 2 مليون، والمكان الى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد.
7. تدور في (228 x ج) لمدة 5 دقائق.
8. نضح طاف، وترك الخلايا كما بيليه في أنبوب مخروطي.
9. مزيج من المواد السائلة HA والجيلاتين في 1: الحصة 1. ثم إضافة 80٪ من حجم التداول الكلي في أنبوب مخروطي يحتوي على بيليه.
10. resuspend الخلايا البطانية في 1: 1 HA / خليط الجيلاتين
11. وضع خلايا معلقة في خليط HA / الجيلاتين في قاعدة مصفوفة ليفية من الخطوة 2.
12. إضافة 1/5 (20٪) من حجم التداول الكلي المطلوب للرابط عبر
13. احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.

5. عزل صفائح خلية

1. إزالة لوحات 35 ملم pNIPAAM المعاملة التي تحتوي على خلايا من الحاضنة ومكان في غطاء ثقافة الخلية فيRT.
2. نضح بسرعة وسائل الإعلام من الخلايا، وإضافة 2 مل من 6٪ الجيلاتين العادية الذي تم تسخينه إلى 37 درجة مئوية.
3. في حين أن الجيلاتين لا تزال دافئة، ضع شعرية معدنية في الجيلاتين، غمر تحت سطح الجيلاتين العادية (فيلم 1).
4. وضع لوحة كاملة على الجليد لمدة 5 إلى 7 دقائق، والسماح للالجيلاتين لتتصلب.
5. بعد 7 دقائق، واستخدام ملعقة لفصل بعناية حواف الجيلاتين من الجانب من لوحة، ومن ثم استخدام ملقط لرفع شعرية معدنية من لوحة ملاحظة: الجيلاتين 6٪، ورقة خلية يجب أن ترفع مع شعرية.
6. نقل ورقة الخلية إلى الطبق ووضع على رأس قاعدة ليفية مصفوفة هيدروجيل الجمع، ووضع بعناية شعرية على أعلى بناء. ملاحظة: الجانب القمي من ورقة خلية ستبقى في هذا المنصب.
7. إضافة 2 مل من وسائل الإعلام دافئ (37 درجة مئوية).
8. احتضان O / N السماح للخلايا ورقة التمسك السطح هيدروجيل.
9. إزالة رانه شعرية المعادن بعد حل ارتفاع درجة حرارة (حوالي 1 ساعة)، أو في اليوم التالي.

النتائج

مخطط التدفق (الشكل 1) يبين طريقة الكلي لجعل التصحيح متعدد الطبقات. يتم فصل الخلايا من ورقة لوحة تعامل pNIPAAM بإسقاط درجة حرارة أقل من 32 درجة مئوية. ثم يتم وضع ورقة خلية على رأس هيدروجيل عبر ربط تحتوي على الخلايا البطانية المصنف في مصفوفة ليفية الأساسية (الشك?...

Discussion

الخطوات الحاسمة في البروتوكول ما يلي: طلاء أسطح لوحة مع البوليمر thermoresponsive والتلاعب في أوراق الخلية بعد التبريد لوحات. لأن خلايا مختلفة تظهر الخصائص الفيزيائية المختلفة، مثل adhesivity، يجب أن يكون الأمثل الوقت لرفع كل نوع من الخلايا المختلفة. العنصر الثاني، والأكثر تحدي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Calcein-AM	Invitrogen	C3099	Cell tracker / live dye
Lysotracker Red	Invitrogen	L7528	Cell tracker
Neutral Red	Sigma	N7005	Visible Cell dye
pNIPAAM	Sigma Aldrich	412780250	Poly(N-isopropylacrylamide)
Toluene	Sigma Aldrich	244511-1L
Hexane	Sigma Aldrich	296090-1L
RAOSMC	Lonza	R-ASM-580	Rat Aortic Smooth Muscle Cells
SmGM2	Lonza	CC-4149	Smooth Muscle Media
HUVEC	Invitrogen	C-003-5C	Human Venous Endothelial Cells
HyStem	Glycosan/Biotime
Isopropyl alcohol	VWR International	BDH1133-4LP
Trypsin	Corning Cellgro	25-053-C1
PBS	Gibco	14287-072
FBS	Gibco	16140-071
Specific Equipment
Filter paper	Ahlstrom	6310-0900
Buchner Funnel	Sigma Aldrich	Z247308
UpCell Plates	Nunc	2014-11
UV light	Jelight Company	UVO Cleaner Model No.42