Ingegneria dei tessuti: Costruzione di un multicellulare 3D Ponteggio per la consegna di Layered fogli Cellulari

Riepilogo

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Abstract

Molti tessuti, come i cuori umani adulti, non sono in grado di rigenerarsi in modo adeguato dopo un danno. ^2,3 Strategie di ingegneria dei tessuti propongono innovazioni per aiutare il corpo nel recupero e riparazione. Ad esempio, gli approcci TE possono essere in grado di attenuare il rimodellamento cardiaco dopo infarto miocardico (MI) e possibilmente aumentare la funzione cardiaca totale a un livello normale di MI-pre vicino. ⁴ Come con qualsiasi tessuto funzionale, la rigenerazione del tessuto cardiaco di successo comporta la corretta consegna dei più tipi di cellule con stimoli ambientali che favoriscono l'integrazione e la sopravvivenza del trapianto di cellule / tessuti impiantati. Tessuti ingegnerizzati dovrebbero affrontare più parametri tra cui: segnali solubili, cell-to-cell interazioni e materiali a matrice, calcolati come veicoli per le consegne, i loro effetti sulla sopravvivenza delle cellule, la forza materiale, e la facilitazione di organizzazione cellula-tessuto. Gli studi che utilizzano l'iniezione diretta di cellule madri per marze ignorare solo questi elementi essenziali. ^2,5,6Un design di tessuto che unisce questi ingredienti deve ancora essere sviluppato. Qui, presentiamo un esempio di design integrate con stratificazione di fogli di cellule fantasia con due tipi distinti di materiali biologici di derivazione contenenti il ​​tipo di cellule dell'organo bersaglio e le cellule endoteliali per migliorare la formazione di nuovi vasi nel "tessuto". Sebbene questi studi si concentrano sulla generazione di tessuto cardiaco-like, questo disegno tessuto può essere applicato a molti altri organi oltre cuore con minimi cambiamenti di design e materiali, ed è pensato per essere un prodotto off-the-shelf per terapie rigenerative. Il protocollo contiene cinque passaggi dettagliati. Una temperatura sensibile Poli (N -isopropylacrylamide) (pNIPAAM) viene utilizzato per tessuti cappotto coltura piatti. Poi, le cellule del tessuto specifico sono coltivate sulla superficie delle piastre rivestite / superfici micropattern per formare fogli di cellule con forti aderenze laterali. In terzo luogo, una matrice di supporto è per il tessuto combinando matrice porosa con Permissi neovascolareve idrogel e cellule endoteliali. Infine, i fogli di cellule vengono sollevati dai piatti pNIPAAM rivestiti e trasferiti all'elemento di base, rendendo il costrutto completo.

Introduzione

Injection of cells and/or single materials alone has shown variable success in other organ systems and limited success in cardiac regeneration.^5,7-12 Currently, stem cell-derived cells are delivered to damaged tissue using a variety of delivery methods including: direct cell injection into tissue and perfusion into the blood supply.^13-17 Others have implanted cells alone, materials alone and/or in combination with material carriers to help regenerate damaged organs.^18-21 This design combines multiple strategies that provide material strength, patterning in multiple materials and multiple cell types.

Specifically, the base acellularized fibrous matrix provides the foundational physical strength to the construct, making it suitable for suturing in into the patient, if necessary. The void spaces in the base matrix are filled with endothelial cells in a neovascular permissive hydrogel²² for rapidly establishing vascularization of the implanted construct. This composite is then integrated with pre-patterned cell sheets that allow enhanced cell-to-cell communication, more closely mimic the native tissue.^1,23-25 The overall production process for the layered cellular patch is outlined by the flowchart in Figure 1.

Protocollo

1 Creazione di piatti pNIPAAM rivestite

1. Sciogliere 2.6 g di pNIPAAM in 2 ml di una soluzione di esano al 60% di toluene / 40%.
2. Riscaldare la miscela a 60 ° C per 10 min agitati, finché il pNIPAAM è disciolto.
3. Tagliare carta da filtro in un cerchio di diametro di 60 mm e carta posto in imbuto Buchner.
4. Filtrare la soluzione attraverso imbuto Buchner nel bicchiere di vetro pre-pesato (non usare la plastica, come esano si scioglierà la plastica).
5. Porre il bicchiere e contenuto in un vuoto campana (24 psi) O / N (16 ore). Nota: Fino a quando il residuo viene fatto reagire con isopropilico esso si ossida in modo da assicurarsi che non venga a contatto con l'ossigeno.
6. Pesare il becher per stabilire il peso del pNIPAAM.
7. Aggiungere alcool isopropilico al pNIPAAM, creando un 50/50 w / w soluzione.
8. Inserire 2 ml della soluzione sulla superficie della piastra di coltura tissutale, e cappotto per 5 min sotto luce UV.
9. Lavare la piastra con 2 ml di PBS caldo due volteprima di utilizzare per la coltura cellulare.

2 Creazione di fogli Cellulari

Nota: fogli di cellule primarie per l'organo bersaglio possono essere creati utilizzando una serie di metodi diversi, o da rivestimento di superfici di coltura di tessuti con polimero termo-sensibile come descritto qui. Lastre termo-sensibile pre-rivestiti sono offerti anche da un certo numero di fornitori.

Nota: Questo protocollo è per la cultura con un piatto da 35 mm. Brevemente, le cellule vengono incubate a 37 ° C per un minimo di 24 ore a confluenza per stabilire connessioni laterali tra celle adiacenti. Per rilasciare fogli cellulari, piastre vengono sottoposti a temperature inferiori a 32 ° C. Il foglio cella viene poi trasferito al forte matrice fibrosa base contenente un idrogel permissiva neovascolare con cellule endoteliali vascolari.

1. Isolare la popolazione cellulare. Nota: questo metodo dipende dai singoli procedimenti di derivazione e del tipo di cellule. Rat aortica mu lisciacellule SCLE (RASMC) sono utilizzati in questo esempio. Queste sono cellule muscolari lisce primarie isolate dall'aorta addominale di un topo.
2. Lavare le cellule con 2 ml di PBS caldo.
3. Aggiungere 3 ml di tripsina (o altro / soluzione dissociare scissione) alle cellule per 5 min.
4. Inibire la tripsina con l'aggiunta di 3 ml di terreno di coltura, o soluzione tampone fosfato (PBS) contenente 10% di siero fetale bovino (FBS).
5. Raccogliere le cellule in un tubo conico e contare una aliquota.
6. Spin le cellule a 1000 rpm (228 xg) per 5 min.
7. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in loro mezzi di crescita (SmGM2 più kit proiettile terreno di coltura viene utilizzato per RASMC).
8. Posizionare i supporti contenenti le cellule su un piatto di 35 millimetri termo-sensibili - piastra rivestita pNIPAAM ad una concentrazione che permetterà di conseguire il 100% di confluenza. Nota: Per RASMCs quel numero è stato determinato in 100.000 cellule / cm ^2. Tuttavia, a causa della perdita di cellule durante il passaggio, 120% di detto va viene utilizzato lue.
9. Mettere in un incubatore a 37 ° CO / N. Nota: È importante mantenere le cellule a 37 ° C per mantenere l'adesione delle cellule alla piastra.

3 Preparazione di Matrix Foundational

Nota: Vari matrici fibrosi 3D possono essere usati per sovrapporre forte matrice fibrosa tra i fogli di cellule delicate. Alcuni esempi includono: Gelfoam, Bioglass, materiali naturali acellularized ²⁶ o nanospun materiali ^27,28 Il suina matrice vescica urinaria (UBM) utilizzati in questi studi è stato generosamente fornito dal nostro collaboratore, il dott Badylak ^29.

1. Prima dell'uso, determinare le caratteristiche della matrice, tra cui la mancanza di contenuto cellulare se si utilizza matrice decellularized, ^27,28 cellulare vitalità specifico, e lo spazio vuoto. ²²
2. Tagliare la matrice pre-sterilizzato in una dimensione e forma desiderata. Nota: Qui, un foro-perforazione è utilizzata per tagliare un cerchio del diametro di 4 mm.

ve_title "> 4. Semina cellule endoteliali in un Neovascolare Permissivo Hydrogel

Nota: Le cellule endoteliali possono essere ottenuti da una varietà di fonti, tra cui la differenziazione da cellule staminali o progenitrici. Qui, vengono utilizzati HUVECs.

1. Utilizzare qualsiasi idrogel permissiva (fibrina, gel di collagene) fintanto che il tempo di reticolazione è abbastanza breve da consentire alle cellule rimangono vitali. Nota: Qui, un gel Hyaluronan (HA) basato reticolato con viene utilizzato un ponte disolfuro.
2. Preparare l'idrogel HA in conformità con il protocollo aziendale.
3. Raccogliere le cellule endoteliali e disperdersi in una soluzione singola cella utilizzando tripsina 1x. Nota: Accutase o cellulare Dissociazione Buffer potrebbero essere utilizzati anche per la dispersione singola cellula.
4. Disattivare l'enzima tripsina utilizzando una pari quantità di inibitore della tripsina di soia (se è importante che le cellule non vengano a contatto con il siero) o 10% FBS in PBS, raccogliendo la soluzione / cellule in un tubo da 15 ml.
5. Count le cellule, e calcolare il volume necessario per le dimensioni delle patch (precedentemente quantificato). Nota: Per una patch a 4 mm, sono usati qui 2 milioni di cellule endoteliali.
6. Estrarre 2 milioni di cellule, e inserire in un nuovo tubo da 15 ml.
7. Spin a (228 xg) per 5 min.
8. Aspirare il supernatante, lasciando le cellule come pellet in un tubo conico.
9. Mescolare i materiali liquidi HA e la gelatina in un 1: 1 razione. Aggiungere quindi 80% del volume totale nel tubo conico contenente il pellet.
10. Risospendere le cellule endoteliali nella miscela 1: 1 HA / gelatina
11. Posizionare le cellule in sospensione nella miscela HA / gelatina nella base matrice fibrosa dal punto 2.
12. Aggiungere 1/5 (20 percento) del volume totale desiderata del cross-linker
13. Incubare per 1 ora a 37 ° C.

5 Isolamento di fogli Cellulari

1. Rimuovere le piastre 35 millimetri pNIPAAM trattati contenenti le cellule dal incubatore e posto in una cappa di coltura cellulare aRT.
2. Aspirare rapidamente il supporto dalle cellule, e aggiungere 2 ml di 6% di gelatina normale che è stato riscaldato a 37 ° C.
3. Mentre la gelatina è ancora caldo, posizionare il reticolo di metallo nella gelatina, immergendo sotto la superficie della gelatina normale (Film 1).
4. Inserire l'intera piastra su ghiaccio per 5 a 7 minuti, consentendo la gelatina per indurire.
5. Dopo 7 minuti, utilizzare una spatola per separare accuratamente i bordi gelatina dal lato della piastra, e quindi utilizzare pinze per sollevare la grata metallica dalla piastra Nota: La gelatina 6%, e il foglio di cella deve sollevare con il reticolo.
6. Spostare il foglio cella al piatto e posto sulla sommità della combinazione matrice idrogel di base fibrosa, impostando attentamente il reticolo sopra il costrutto. Nota: La parte apicale dello strato di cellule sarà ancora in prima posizione.
7. Aggiungere 2 ml di supporti caldo (37 ° C).
8. Incubare O / N consentendo il foglio di cellule di aderire alla superficie idrogel.
9. Rimuovere tegli reticolo di metallo dopo la soluzione si riscalda (circa 1 ora), o il giorno successivo.

Risultati

Il diagramma di flusso (figura 1) illustra il metodo generale di rendere la patch multistrato. Fogli cellulari sono staccati dalla piastra trattata pNIPAAM facendo cadere la temperatura sotto i 32 ° C. Poi il foglio cella è posto in cima al idrogel reticolato contenente le cellule endoteliali seminate nella matrice fibrosa sottostante (Figura 1). Le piastre termosensibili pretrattati possono essere utilizzati anche per creare i fogli di cellule. Superfici speciali topologiche sono usa...

Discussione

I passaggi critici nel protocollo comprendono: rivestimento delle superfici delle piastre con il polimero thermoresponsive e manipolare i fogli di cellule dopo il raffreddamento delle piastre. Poiché le cellule differenti presentano differenti proprietà fisiche, come adesività, il tempo di sollevamento deve essere ottimizzata per ogni tipo di cellula diversa. Il secondo, e più significativamente impegnativo componente di questo protocollo, incentrata sulla manipolazione dello strato di cellule, un aspetto critico di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Calcein-AM	Invitrogen	C3099	Cell tracker / live dye
Lysotracker Red	Invitrogen	L7528	Cell tracker
Neutral Red	Sigma	N7005	Visible Cell dye
pNIPAAM	Sigma Aldrich	412780250	Poly(N-isopropylacrylamide)
Toluene	Sigma Aldrich	244511-1L
Hexane	Sigma Aldrich	296090-1L
RAOSMC	Lonza	R-ASM-580	Rat Aortic Smooth Muscle Cells
SmGM2	Lonza	CC-4149	Smooth Muscle Media
HUVEC	Invitrogen	C-003-5C	Human Venous Endothelial Cells
HyStem	Glycosan/Biotime
Isopropyl alcohol	VWR International	BDH1133-4LP
Trypsin	Corning Cellgro	25-053-C1
PBS	Gibco	14287-072
FBS	Gibco	16140-071
Specific Equipment
Filter paper	Ahlstrom	6310-0900
Buchner Funnel	Sigma Aldrich	Z247308
UpCell Plates	Nunc	2014-11
UV light	Jelight Company	UVO Cleaner Model No.42