انخفاض تركيز إتراكونازول والآماد ناجحة في علاج<em&gt; dendrobatidis Batrachochytrium</em&gt; عدوى في البرمائيات

Summary

يمكن القضاء على العدوى dendrobatidis Batrachochytrium في البرمائيات باستخدام التركيز المنخفض (0.0025٪) ومدة أقصر (الحمامات خمس دقائق لمدة ستة أيام) من الايتراكونازول من يستخدم عادة. وقد لوحظت أقل وفيات وعدد أقل من الآثار الجانبية السلبية باستخدام هذا البروتوكول العلاج تعديلها.

Abstract

البرمائيات تواجه أكبر انخفاض من أي فئة الفقاريات والسبب الرئيسي لهذه الانخفاضات هو الممرض الفطرية، dendrobatidis Batrachochytrium (دينار بحريني)، والذي يسبب chytridiomycosis المرض. المستعمرات ضمان الأسير مهمة في جميع أنحاء العالم للأنواع المهددة والبرمائيات قد تكون شريان الحياة الوحيد لتلك الموجودة في التهديد الحرجة من الانقراض. الحفاظ على المستعمرات خالية من المرض هو من أولويات مديري الأسير، لم يتم تحديدها حتى الآن علاجات آمنة وفعالة لجميع الأنواع وعبر مراحل الحياة. العلاج الكيميائي الأكثر استخداما على نطاق واسع هو الايتراكونازول، على الرغم من أن الجرعة المستخدمة عادة يمكن أن تكون ضارة لبعض الأفراد والأنواع. أجرينا محاكمة العلاج السريري لتقييم ما إذا كانت الجرعة أقل وأكثر أمانا لكنها فعالة من الايتراكونازول يمكن العثور على علاج التهابات دينار بحريني. وجدنا أن طريق الحد من تركيز العلاج ،01-،0025٪ وتخفيض مدة العلاج من 11-6 أيام من 5 دقائق الحمامات، ويمكن علاجه الضفادع من عدوى دينار بحريني مع آثار جانبية أقل وأقل الوفيات المرتبطة العلاج.

Introduction

البرمائيات تشهد حاليا أكبر انخفاض في التنوع البيولوجي من جميع الأصناف الفقارية ^1. Chytridiomycosis، مرض جلدي الناجمة عن حيدة الخلية لدى الحيوانات الفطرية dendrobatidis الممرض Batrachochytrium (دينار بحريني)، هي واحدة من الأسباب الرئيسية لهذه الانخفاضات الدراماتيكية ² دينار بحريني هو أسوأ الممرض على الاطلاق عن التسبب في فقدان التنوع البيولوجي: أن يصيب أكثر من 600 نوعا من البرمائيات وديه تسبب انخفاض في أكثر من 300 نوعا، منها أصبحت ما يصل الى 200 أنواع المهددة بالانقراض أو انقرضت ^2،3. وحيدة الخلية لدى الحيوانات البرمائية الفطر لا تستضيف محددة وليس واضحا ما هي الصفات للمضيف السماح للعدوى دينار بحريني إلى التقدم المسببة للأمراض شديدة. Chytridiomycosis يسبب الوفاة عن طريق تعطيل القنوات الأيونية في الجلد، مما يؤدي إلى فقدان الكهارل وفشل القلب ^4. أيضا، طاف دينار بحريني (لا تحتوي على zoospores دينار بحريني) يسبب استجابة مناعية في الضفادع الصغيرة ⁵ الشجريةز الباحثين إلى الاعتقاد دينار بحريني تنتج السمية من قبل المنتج ^6.

لأن العديد من الأنواع آخذة في الانخفاض بسرعة، المستعمرات ضمان الأسير وبرامج التربية هي التدابير الهامة الحفظ، ويمكن أن تكون شريان الحياة الوحيد بالنسبة لبعض الأنواع. إنشاء وصيانة المستعمرات خالية من المرض يشكل تحديا لإدارة المرافق البرمائيات. أساليب العلاج الكيميائي الحالي لعلاج الالتهابات دينار بحريني، على الرغم من فعالية، يمكن أن تكون ضارة للحيوانات يعالجون، وكانت لا توجد طريقة علاج واحد ناجح في كل أنواع وفئات العمر من البرمائيات ^7.

وقد أجريت التجارب السريرية قليلة من العلاجات لعدوى دينار بحريني ^7. الطرق الثلاثة الأكثر شيوعا للعلاج هي العلاج الحراري، الكلورامفينيكول والايتراكونازول. العلاج الحراري هو خيار العلاج nonchemotherapeutic الذي يظهر لديهم آثار جانبية قليلة، ويمكن استخدامها على عدة مراحل الحياة، وينايرحليف فعالة. في محاكمة العلاج، وجدت شاتفيلد ^{وريتشاردز-8} Zawacki أن 96٪ من الحيوانات المعالجة قد مسح العدوى بعد أن يقع في 30 درجة مئوية لمدة 10 يوما. على الرغم من أن هذه المحاكمة لم تكن ناجحة 100٪، فإنه يوفر الأساس للآخرين لتقييم العلاج الحراري للأنواع الخاصة بهم. العلاج الحراري، على الرغم من فعالية بالنسبة لكثير من الأنواع، وغير عملي لكثير من الأنواع جبال الألب التي لا يمكن أن تبقى في درجات حرارة عالية لفترة طويلة من الزمن. الكلورامفينيكول، وهو مضاد للجراثيم، وقد استخدمت بنجاح لعلاج دينار بحريني في كثير من الأنواع، ويمنع نمو الفطريات في المختبر. باعتبارها مضادة للجراثيم، والكلورامفينيكول لا يهاجم الفطر على وجه التحديد ولكن كان من المعروف أن يسبب موت الخلايا المبرمج في الخلايا حقيقية النواة ^9. وكان قد تردد أن العلاج يسبب موت الخلايا المبرمج الكلورامفينيكول في الجلد، مما أسفر عن مقتل مباغات داخل الخلايا، على الرغم من أن الآلية الدقيقة لعمل غير معروف. على الرغم من أنه لم يتم إجراء التجارب السريرية، وبالتاليلم يتم تقييم الجرعة ووقت العلاج، تتطلب بروتوكولات العلاج الحالية عادة غمر لمدة يومين أو أربعة أسابيع ^10،11، مما يجعل هذا العلاج غير عملي لالبرمائيات الأرضية. كما تم تقييد الكلورامفينيكول في بعض البلدان للاستخدام البيطري لأن ارتبط التعرض البشري مع شكل نادر من فقر الدم اللاتنسجي ^12.

الايتراكونازول، وهو مضاد آزول، هو الأكثر استخداما على نطاق واسع لعلاج عدوى دينار بحريني في عام البرمائيات في الأسر. البروتوكول الأكثر استخداما على نطاق واسع هو الحيوانات الاستحمام في حل الايتراكونازول 0.01٪ لمدة خمس دقائق في اليوم لمدة 11 يوما متتالية. وقد اشتق هذا البروتوكول من المعايير المستخدمة لإدارة الثدييات، و، في حين فعالة لالبرمائيات، لا يقوم على التجارب السريرية في البرمائيات ^11،13. هذا البروتوكول يمكن أن يسبب آثار جانبية سلبية في بعض الأنواع، وخاصة في جنس رنا والضفادع الصغيرة وmetamorphs الأخيرة ^11.وقد كان العلاج الشرغوف ناجحة باستخدام تركيز أقل من ذلك بكثير (0.0005٪) من الايتراكونازول، ولكن كان مرتبطا مع تصبغ ^14. تم محاكمتهم هذا نفس التركيز على metamorphs الأخيرة وجدت أن تنجح في علاج العدوى ^15. لأن هناك خطر الآثار الجانبية السلبية مع العلاج الايتراكونازول، استخدمت بعض الممارسين نصف تركيز المعتادة (0.005٪) لمدة 11 يوما متتالية وجدت هذا أن تكون ناجحة في علاج الالتهابات دينار بحريني ^16.

هذه الدراسة هو ملخص لمحاكمة العلاج السريري باستخدام الايتراكونازول لعلاج العدوى دينار بحريني ^15. يصف بروتوكول محاولة للعثور على أقل جرعة العلاج والوقت الذي هو على حد سواء آمنة وفعالة لعلاج الحيوانات المصابة دينار بحريني مع الايتراكونازول. كانت الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة metamorphs الأخيرة من الضفادع ساحل الخليج، Incilius nebulifer.

Protocol

الأخلاق الموافقة: تمت الموافقة على هذه الدراسة وأساليبها من خلال استخدام الحيوان والعناية جنة جامعة تولين في (البروتوكول لا 0407).

1. اختبار للعدوى دينار بحريني

1. ينظف لدينار بحريني
   1. الحيوانات مسحة مع مسحة القطن المعقم خمس مرات على ventrum، خمس مرات على كل الفخذ، كل جانب، ولكل الأطراف لما مجموعه 45 السكتات الدماغية. ينظف هو أسلوب موسع لأخذ العينات للدينار بحريني على الجلد البرمائيات.
   2. تناوب بلطف مسحة أثناء والسكتات الدماغية بين لضمان جمع أكبر قدر من الحمض النووي على مسحة.
   3. متجر مسحات في 1.5 مل microtubes في -20 درجة مئوية.
2. استخراج الحمض النووي وفحص QPCR
   1. استخراج الحمض النووي الجيني من مسحات باستخدام المتاحة تجاريا عدة عزل الحمض النووي، وفقا لتعليمات لأنسجة الحيوان.
   2. تحليل الحمض النووي المستخرج باستخدام كمية الوقت الحقيقي PCR (QPCR) التالية بويل وآخرون ^17، مع إجراء التعديلات التالية:
   3. تمييع عينات استخراج الحمض النووي 1:10 مع الماء منزوع الأيونات مزدوجة.
   4. إضافة 0.7 ميكرولتر من ألبومين المصل البقري (BSA) لمنع تثبيط PCR.
   5. تشمل مراقبة إيجابية الداخلية في كل عينة لضمان وPCR تثبيط لا تؤثر النتائج.
   6. عينات تشغيل مع السيطرة الإيجابية والسلبية وسلسلة من المعايير لتقدير التخفيف بوغ حرك (العدوى) حمولة.

2. تلقيح

1. ثقافة دينار بحريني
   1. إعداد مرق تريبتون بإضافة 10 ز تريبتون إلى 1 L التناضح العكسي أو منزوع الأيونات الماء، تعقيمها (121 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة) وتترك لتبرد. مرة واحدة يتم تبريده الى 23 درجة مئوية، إضافة 1 مل البنسلين، الستربتوميسين.
   2. تنمو سلالة دينار بحريني (JEL411 من J. Longcore، معزولة عن Guabal، بنما من Phyllomedusa يمور) في مرق تريبتون لمدة سبعة أيام في 23 درجة مئوية.
2. نقل بروث الثقافة وتريبتون لوحات أجار.
   1. لجعل لوحات، إضافة 10 ز 10 ز تريبتون وأجار إلى 1 L التناضح العكسي أو منزوع الأيونات الماء والأوتوكلاف (121 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة).
   2. مرة واحدة الخليط تعقيمها هو باردا بما فيه الكفاية للمس، ولكن قبل ذلك تجميده، تصب في أطباق بتري، 1/4-1/3 الكامل، في غطاء تدفق الصفحي.
   3. عندما الاكرم أجار وتبرد تماما، إضافة 0.5 مل مرق دينار بحريني إلى كل لوحة وموزعة بالتساوي في جميع أنحاء اللوحة. السماح ليجف.
   4. مرة واحدة يتم تلقيح لوحات مع zoospores دينار بحريني، لوحات الختم مع parafilm.
   5. السماح لوحات لاحتضان عند 23 درجة مئوية لمدة 5-7 أيام. تحقق بوغ حرك الحركة لضمان الجدوى قبل التلقيح.
3. لوحات الفيضانات لحل التلقيح بوغ حرك
   1. بعد 5-7 أيام من الحضانة دينار بحريني والنمو، وإغراق كل لوحة مع 5 مل من ماء الصنبور العمر وتسمح zoospores للدخول وسائل الإعلام لمدة 10 دقيقة.
   2. صب suspe بوغ حركnsion في وعاء المحمولة.
   3. ويقدر تركيز بوغ حرك مع عدادة الكريات.
   4. تمييع الخليط إلى تركيز من 1 × 10 ⁶ في 3 مل ماء الصنبور مع العمر.
4. تطعيم الحيوانات
   1. في الفردي 50 مل الحاويات، وتطعيم كل حيوان بصب 3 مل مزيج اللقاح على ventrum لها. سماح اضافية لقيحة بالتنقيط في قاعدة الحاوية التلقيح.
   2. ستبقى كل حيوان في حاوية التلقيح لمدة 24 ساعة لضمان العدوى.
   3. بعد 24 ساعة من التلقيح، والعودة إلى الحيوانات terraria تطهيرها الفردية.
   4. تسمح العدوى لبناء لمدة أسبوعين. تأكيد الإصابة مع مسحة والنتائج QPCR، وبدء العلاج.
   5. لضوابط BD-السلبية والفيضانات الحرة BD-لوحات أجار مع 5 مل الذين تتراوح أعمارهم بين ماء الصنبور، وتلقيح الحيوانات وهمية باستخدام نفس الأساليب على النحو الوارد أعلاه.

3. العلاج حمية

1. استعداداتإعادة حمام العلاج
   1. إضافة 2.50 مل الايتراكونازول مائي (1٪ سبورانوكس الحل عن طريق الفم) إلى 1 L الحل رينغر البرمائيات (0.0025٪ الايتراكونازول - أدنى تركيز العلاج الفعال).
      1. البرمائيات رينغر الحل وصفة: 1 L التناضح العكسي أو منزوع الأيونات الماء، وكلوريد الصوديوم 6.6 جم، 0.15 جم كلوريد البوتاسيوم وكلوريد الكالسيوم 0.15 غرام، و 0.2 غرام بيكربونات الصوديوم. الحل الأوتوكلاف (121 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة) والسماح لتبرد لدرجة حرارة الغرفة.
      2. ل0.01٪ تركيز العلاج الايتراكونازول، إضافة 10.00 مل الايتراكونازول مائي (1٪ سبورانوكس الحل عن طريق الفم) إلى الحل 1 L البرمائيات رينغر
      3. ل0.005٪ تركيز العلاج الايتراكونازول، إضافة 5.00 مل الايتراكونازول مائي (1٪ سبورانوكس الحل عن طريق الفم) إلى الحل 1 L البرمائيات رينغر.
   2. لضوابط BD-الإيجابية والسلبية BD-، والاستحمام الحيوانات في الحل رينغر البرمائيات مع عدم وجود الايتراكونازول.
2. العلاج <رأ>
3. وضع البرمائيات الفردية في تطهير الحاويات 50 مل مع 35 مل من محلول العلاج.
4. يتم تغطية ضمان الحيوانات تماما لمدة خمس دقائق قبل يحوم بلطف الحاوية.
5. العودة إلى الحيوانات terraria تطهيرها. أكرر لمدة ستة أيام.

ضمان نجاح العلاج

1. حيوانات الاختبار للعدوى دينار بحريني على العلاج اليوم تبدأ.
2. حيوانات الاختبار للعدوى دينار بحريني بعد أسبوع واحد التشطيبات العلاج، ومرة واحدة في الأسبوع وتطهيرها لمدة أربعة أسابيع لضمان العدوى.

4. دينار بحريني لعائلة السلمان

1. الأسبوعية terraria الفردية تطهير.
   1. يستحم الحاويات terraria والعلاج في 10٪ التبييض حمام الحل.
   2. شطف كل حاوية المبيضة مرتين مع المياه الجارية.
   3. تسمح الحاويات لتجف لمدة 24 ساعة قبل إعادة استخدامها.
2. ارتداء القفازات عند التعامل مع النتريل نظيفة الحيوانات لمنع التلوث المتبادلدينار بحريني الممرض. تغيير القفازات بين التعامل مع كل حيوان.
3. تطهير جميع النفايات السائلة قبل التخلص منها من خلال جلب حل التبييض 10٪.
4. الأوتوكلاف جميع النفايات الصلبة التي من المحتمل ان تعرض لدينار بحريني قبل التخلص منها.

النتائج

واعتبر العلاج الايتراكونازول ناجحة إذا كانت جميع الحيوانات BD-سلبية بعد أربعة أسابيع انتهت العلاج. قبل العلاج بدأت، بعد أسبوعين من التلقيح، وأصيب جميع الحيوانات الملقحة دينار بحريني، مع حمولة بوغ حرك متوسط ​​1،121.7 (± 17.34)، بينما بعد أربعة أسابيع انتهت العلا...

Discussion

باستخدام هذا البروتوكول تمكنا من خفض بأمان وفعالية جرعة العلاج ووقت العلاج الايتراكونازول للدينار بحريني في البرمائيات. كان أقل جرعة العلاج والوقت (0.0025٪ لمدة ستة أيام) لعلاج ناجح لإصابة دون سريريا أولا nebulifer. فعالية كل جرعة أقل ووقت العلاج تدليل على الحاجة ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox	Janssen Pharmaceutica Inc.
NaCl	Fisher Scientific	S640-500
KCl	Fisher Scientific	BP366-1
CaCl2	Fisher Scientific	BP510-100
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328-500
Sterile cotton swabs	Medical and Wire Equipment	MW113
1.5 ml Microtubes	Sarstedt	73.703.217
Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69581
7500 Real-time PCR	Applied Biosystems	4351104
VIC IPC	Applied Biosystems	4308323
BSA	Applied Biosystems	AM2618
Agar	Invitrogen	30391023
Tryptone	Invitrogen	Q10029
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Petri Dish	Sigma Aldrich	CLS430589