Disminución de la concentración de itraconazol y Duración del éxito en el tratamiento de<em&gt; Batrachochytrium dendrobatidis</em&gt; La infección en anfibios

Resumen

Infección por Batrachochytrium dendrobatidis en los anfibios puede ser eliminado utilizando una concentración reducida (0,0025%) y menor duración (baños de cinco minutos durante seis días) de itraconazol que la que se utiliza generalmente. Se observaron menos mortalidad y menos efectos secundarios negativos utilizando este protocolo de tratamiento modificado.

Resumen

Los anfibios están experimentando el mayor descenso de toda clase de vertebrados y la principal causa de este descenso es un hongo patógeno Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), que causa la enfermedad quitridiomicosis. Colonias de aseguramiento en cautiverio son importantes en todo el mundo para las especies de anfibios amenazadas y pueden ser la única tabla de salvación para los de amenaza crítica de extinción. El mantenimiento de colonias gratuitas de enfermedades es una prioridad de los directivos en cautividad, no se han identificado aún los tratamientos seguros y eficaces para todas las especies y entre las etapas de vida. El tratamiento quimioterapéutico más utilizado es el itraconazol, aunque la dosis utilizada puede ser perjudicial para algunos individuos y especies. Se realizó un ensayo de tratamiento clínico para evaluar si una dosis más baja y más seguro, pero eficaz de itraconazol se pudo encontrar para curar infecciones de BD. Hemos encontrado que mediante la reducción de la concentración de tratamiento desde 0,01 hasta 0,0025% y la reducción de la duración del tratamiento de 11-6 Días de 5 mínimo baños, ranas podrían curarse de la infección Bd con menos efectos secundarios y menos mortalidad asociada al tratamiento.

Introducción

Los anfibios están actualmente experimentando el mayor declive de la biodiversidad de todos los taxones de vertebrados ^1. La quitridiomicosis, una enfermedad de la piel causada por los patógenos fúngicos Batrachochytrium dendrobatidis (Bd chytrid), es una de las principales causas de estos descensos dramáticos ² Bd es el peor patógeno en el expediente para causar la pérdida de biodiversidad:. Infecta a más de 600 especies de anfibios y tiene causado la disminución de más de 300 especies, de las cuales por lo menos 200 especies se han convertido en grave peligro de extinción o extintas ^2,3. El hongo quítrido no es sede específica y no está claro cuáles son las cualidades de la máquina permite la infección Bd progresar causando una enfermedad grave. La quitridiomicosis causa la muerte mediante la interrupción de los canales iónicos en la piel, dando como resultado la pérdida de electrolitos e insuficiencia cardíaca ^4. También, Bd. sobrenadante (que no contiene zoosporas Bd) provoca una respuesta inmune en renacuajos ⁵ leading investigadores creen Bd produce un subproducto tóxico ^6.

Debido a que muchas especies están disminuyendo rápidamente, las colonias de aseguramiento de la cautividad y los programas de cría son importantes medidas de conservación, y pueden ser la única tabla de salvación para algunas especies. El establecimiento y mantenimiento de la enfermedad colonias libres es un reto para las instalaciones de gestión de anfibios. Los métodos quimioterapéuticos actuales para el tratamiento de infecciones Bd, aunque es eficaz, pueden ser perjudiciales para los animales que son tratados, y ningún método de tratamiento único ha sido un éxito en todas estas especies y clases de edad de anfibios ^7.

Se han realizado pocos ensayos clínicos de tratamientos para la infección Bd. ^7. Los tres métodos más utilizados del tratamiento son la terapia de calor, el cloranfenicol y el itraconazol. La terapia de calor es una opción de tratamiento nonchemotherapeutic que parece tener pocos efectos secundarios, pueden ser utilizados en múltiples etapas de la vida, y es generalmentealiado eficaz. En un ensayo de tratamiento, Chatfield y Richards-Zawacki ⁸ encontraron que el 96% de los animales tratados se había despejado las infecciones después de ser alojados a 30 ° C durante 10 días. Aunque este ensayo no fue del 100% de éxito, proporciona una línea de base para que otros puedan evaluar la terapia de calor para su propia especie. La terapia de calor, aunque es eficaz para muchas especies, es poco práctico para muchas especies alpinas que no puede permanecer a altas temperaturas durante un período prolongado de tiempo. Cloranfenicol, un antibacteriano, se ha utilizado con éxito para tratar Bd en muchas especies, e inhibe el crecimiento de hongos in vitro. Como un antibacteriano, el cloranfenicol no ataca el hongo específicamente, pero se ha sabido para causar la apoptosis en células eucariotas ^9. Se ha especulado que la terapia de cloranfenicol provoca la apoptosis en la piel, causando la muerte de esporangios intracelular, aunque el mecanismo de acción exacto es desconocido. Aunque ningún estudio clínico ha sido realizado, y por lo tantola dosis y el tiempo de tratamiento no han sido evaluados, los protocolos de tratamiento actuales suelen requerir la inmersión de dos a cuatro semanas ^10,11, por lo que este tratamiento poco práctico para los anfibios terrestres. El cloranfenicol también ha sido restringido en algunos países para uso veterinario, ya que la exposición humana se ha asociado con una forma rara de anemia aplásica ^12.

El itraconazol, un antifúngico azol, es el más utilizado para el tratamiento de la infección Bd en anfibios en cautiverio. El protocolo más utilizado es el animal de baño en una solución de itraconazol 0,01% durante cinco minutos al día durante 11 días consecutivos. Este protocolo se deriva de las normas utilizadas para la administración de los mamíferos, y, si bien es efectivo para los anfibios, que no se basa en los ensayos clínicos en los anfibios ^11,13. Este protocolo puede causar efectos secundarios negativos en ciertas especies, especialmente en el género Rana y en renacuajos y metamorfos últimos ^11.Renacuajo tratamiento ha sido exitoso el uso de una concentración mucho más baja (0,0005%) de itraconazol, pero se asoció con despigmentación ^14. Esta misma concentración se probó en metamorfos recientes y se encontró que no tener éxito en el tratamiento de la infección ^15. Debido a que existe el riesgo de efectos secundarios negativos con el tratamiento itraconazol, algunos médicos han utilizado la mitad de la concentración habitual (0,005%) durante 11 días consecutivos, y se encontró que esto tenga éxito en la curación de las infecciones Bd ^16.

El presente estudio es un resumen de un ensayo de tratamiento clínico utilizando itraconazol para tratar la infección Bd. ^15. El protocolo describe un intento de encontrar la dosis y tiempo de tratamiento más bajo que es seguro y efectivo para el tratamiento de animales infectados con Bd itraconazol. Los animales utilizados en este estudio fueron los últimos metamorfos de sapos costa del golfo, Incilius nebulifer.

Protocolo

Aprobación ética: Este estudio y sus métodos fueron aprobadas por Animal uso y cuidado Comité de la Universidad de Tulane (Protocolo n º 0.407.).

1. Las pruebas para detectar la infección por Bd

1. Hisopado para Bd
   1. Animales hisopos con un hisopo de algodón estéril en cinco ocasiones en la zona ventral, cinco veces en cada muslo, cada lado, y cada extremidad por un total de 45 golpes. Swabbing es un método no invasivo de muestreo para Bd en la piel de los anfibios.
   2. Gire suavemente el hisopo durante y entre golpes para asegurar la mayor cantidad de ADN se recoge en el bastoncillo.
   3. Hisopos tienda en 1,5 ml microtubos a -20 ° C.
2. Extracción de ADN y el ensayo qPCR
   1. Extraer el ADN genómico a partir de los hisopos utilizando un kit de aislamiento de ADN disponibles comercialmente, de acuerdo con las instrucciones para el tejido animal.
   2. Analizar el ADN extraído utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) después Boyle et al ^17, con las siguientes modificaciones.:
   3. Diluir las muestras de extracción de ADN a 1:10 con agua doblemente desionizada.
   4. Añadir 0,7 l de albúmina de suero bovino (BSA) para evitar la inhibición de la PCR.
   5. Incluir un control positivo interno en cada muestra para asegurar inhibición de la PCR no estaba afectando los resultados.
   6. Corra las muestras con un control positivo y negativo y una serie de normas de dilución para estimar zoosporas (infección) de carga.

2. Inoculación

1. Cultura Bd
   1. Preparar caldo de triptona mediante la adición de 10 g de triptona al 1 L de ósmosis inversa o agua desionizada, en autoclave (121 ° C durante 40 min) y se dejó enfriar. Una vez enfriado a 23 ° C, añadir 1 ml de penicilina-estreptomicina.
   2. Crece la tensión Bd (JEL411 de J. Longcore, aislado de Guabal, Panamá de un Phyllomedusa lemur) en un caldo triptona durante siete días a 23 ° C.
2. Transfiera la broth cultura de triptona y placas de agar.
   1. Para hacer las placas, añadir 10 g de triptona y 10 g de agar a 1 L de ósmosis inversa o agua desionizada y se autoclave (121 ° C durante 40 min).
   2. Una vez que la mezcla en autoclave se enfríe lo suficiente para tocar, pero antes de que se congela, verter en placas de Petri, 1/4-1/3 completo, en una campana de flujo laminar.
   3. Cuando el agar se ha solidificado y enfriado completamente, añadir 0,5 ml de caldo Bd a cada placa y se extendió uniformemente alrededor de la placa. Deje que se seque.
   4. Una vez que las placas se inoculan con zoosporas Bd, placas de sellado con Parafilm.
   5. Permitir placas se incuban a 23 ° C durante cinco a siete días. Compruebe zoosporas movimiento para asegurar la viabilidad antes de la inoculación.
3. Placas de inundación para la solución de la inoculación de zoosporas
   1. Después de los cinco a siete días de incubación y crecimiento Bd, inundar cada placa con 5 ml de agua del grifo de edad y permitir que las zoosporas entren los medios de comunicación durante 10 minutos.
   2. Vierta la suspe zoosporasnsion en un recipiente portátil.
   3. Calcule la concentración de zoosporas con un hemocitómetro.
   4. Diluir la mezcla a una concentración de 1 x 10 ⁶ por 3 ml con agua del grifo edad.
4. Se inoculan los animales
   1. En individuales 50 ml contenedores, inocular cada animal mediante el vertido de 3 ml de mezcla de inóculo sobre la zona ventral. Permita inóculo adicional gotee en la base del recipiente de la inoculación.
   2. Cada animal se mantendrá en el recipiente de la inoculación durante 24 horas para asegurar la infección.
   3. Después de 24 horas de la inoculación, los animales volver a terrarios desinfectados individuales.
   4. Permitir la infección para construir durante dos semanas. Confirme la infección con hisopo y qPCR resultados, y comenzar el tratamiento.
   5. Para los controles Bd-negativas, inundaciones Bd-libre de las placas de agar con 5 ml de edades comprendidas agua del grifo, y la inoculación simulada a los animales con los mismos métodos que el anterior.

3. Régimen de tratamiento

1. Prepare baño de tratamiento
   1. Añadir 2,50 ml itraconazol acuosa (1% solución oral de Sporanox) a 1 Solución de L Anfibios Ringer (0.0025% itraconazol - la concentración de tratamiento eficaz más baja).
      1. Anfibio de solución de Ringer receta: 1 L de ósmosis inversa o agua desionizada, 6,6 g de cloruro de sodio, 0,15 g de cloruro de potasio, 0,15 g de cloruro de calcio, y 0,2 g de bicarbonato de sodio. Solución autoclave (121 ° C durante 40 min) y dejar enfriar a temperatura ambiente.
      2. Por concentración de tratamiento itraconazol 0,01%, añadir itraconazol acuosa 10,00 ml (1% Sporanox Solución oral) a la Solución 1 L Anfibios de Ringer
      3. Por concentración de tratamiento itraconazol 0,005%, añadir 5,00 ml itraconazol acuosa (1% Sporanox Solución oral) a la Solución 1 L Anfibios de Ringer.
   2. Para los controles Bd-positivos y negativos-Bd, bañar animales en solución de Ringer Anfibios sin itraconazol.
2. Tratamiento
   1. Coloque anfibios individuales en desinfectados 50 ml de contenedores con 35 ml de la solución de tratamiento.
   2. Asegurarse de animales están totalmente cubiertos por cinco minutos por mover el recipiente.
   3. Animales Retorno a terrarios desinfectados. Repita durante seis días.
3. Asegurar el éxito del tratamiento
   1. Animales de ensayo para la infección Bd en el tratamiento de día comience.
   2. Animales de ensayo para la infección Bd una semana después de acabados de tratamiento, y una vez a la semana durante cuatro semanas para asegurar que la infección haya desaparecido.

4. Bd como Biohazard

1. Desinfectar semanal terrarios individual.
   1. Bañe los contenedores terrarios y tratamiento en un 10% de lejía baño solución.
   2. Enjuague cada contenedor blanqueado dos veces con agua corriente.
   3. Permitir a los contenedores que se seque durante 24 horas antes de la reutilización.
2. Use guantes de nitrilo limpios al manipular animales para evitar la contaminación cruzadade Bd patógeno. Cambie los guantes entre el manejo de cada animal.
3. Desinfecte todos los residuos líquidos antes de su eliminación por lo que la solución al 10% de lejía.
4. Autoclave todos los residuos sólidos que se puedan estar expuestos a BD antes de su eliminación.

Resultados

Tratamiento itraconazol fue considerada exitosa si todos los animales estaban Bd-negativo cuatro semanas después de finalizado el tratamiento. Antes del tratamiento se inició, dos semanas después de la inoculación, los animales inoculados con Bd fueron infectadas, con una carga de zoosporas media de 1,121.7 (± 17,34), mientras que cuatro semanas después de finalizado el tratamiento, los animales de control Bd-positivos tenían una media de carga de zoosporas de 16,765.12 ( ± 14643.08). ...

Discusión

El uso de este protocolo hemos sido capaces de reducir la dosis de tratamiento y el tiempo de tratamiento itraconazol para Bd en anfibios con seguridad y eficacia. La dosis de tratamiento más bajo y el tiempo (0.0025% por seis días) fue de un tratamiento exitoso para I. infección subclínica nebulifer. La eficacia de administrar una dosis más baja y el tiempo de tratamiento demuestran la necesidad de ensayos clínicos de tratamiento para tratamientos de la infección de Bd, como a...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox	Janssen Pharmaceutica Inc.
NaCl	Fisher Scientific	S640-500
KCl	Fisher Scientific	BP366-1
CaCl2	Fisher Scientific	BP510-100
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328-500
Sterile cotton swabs	Medical and Wire Equipment	MW113
1.5 ml Microtubes	Sarstedt	73.703.217
Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69581
7500 Real-time PCR	Applied Biosystems	4351104
VIC IPC	Applied Biosystems	4308323
BSA	Applied Biosystems	AM2618
Agar	Invitrogen	30391023
Tryptone	Invitrogen	Q10029
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Petri Dish	Sigma Aldrich	CLS430589