ריכוז Itraconazole מופחת ומשכים מצליחים בטיפול<em&gt; Dendrobatidis Batrachochytrium</em&gt; זיהום בדו

Summary

זיהום dendrobatidis Batrachochytrium בדו חיים ניתן למנוע באמצעות ריכוז מופחת (0.0025%) ומשך זמן קצר יותר (אמבטיות של חמש דקות לשישה ימים) של itraconazole מ משמשים בדרך כלל. תמותה ותופעות לוואי שלילי פחות פחות נצפו באמצעות פרוטוקול טיפול שונה זה.

Abstract

דו חיים חווים את הירידה הגדולה ביותר מכל סוג חוליות וגורם מוביל לירידות אלה הוא הפתוגן פטרייתי, dendrobatidis Batrachochytrium (BD), מה שגורם chytridiomycosis המחלה. מושבות הבטחה השבויה חשובות בעולם עבור מיני דוחי מאוימים ועשויות להיות חבל ההצלה רק לאלה באיום קריטי של הכחדה. שמירה על מושבות ללא מחלה היא בראש סדר עדיפויות של מנהלים בשבי, עדיין טיפולים יעילים ובטוחים לכל מינים ובכל שלבי חיים לא זוהו. הטיפול הכימותרפי בשימוש נרחב ביותר הוא itraconazole, אם כי המינון נפוץ יכול להזיק לאנשים מסוימים ומינים. ביצענו ניסוי טיפול קליני להעריך האם מינון נמוך יותר ובטוח יותר, אך אפקטיבי של itraconazole אפשר היה לציין לרפא זיהומי Bd. מצאנו כי על ידי הפחתת ריכוז הטיפול .01-.0025% וצמצום משך הטיפול מ11ימים -6 5 אמבטיות דקות, צפרדעים יכולים להירפא של זיהום Bd עם תופעות לוואי ותמותה הקשורים לטיפול פחות פחות.

Introduction

דו חיים כיום חווים את הירידה הגדולה ביותר במגוון הביולוגי של כל מיני חוליות ^1. Chytridiomycosis, מחלת עור הנגרמת על ידי פטריית dendrobatidis chytrid Batrachochytrium הפתוגן (BD), היא אחד מהגורמים העיקריים לירידות הדרמטיות הללו ^{2 BD} הוא פתוגן הגרוע ביותר על שיא בגרימת אובדן מגוון ביולוגי:. זה מדביק מעל 600 מינים של דו חיים ויש לו גרם לירידות בלמעלה -300 מינים, מתוכם רבים ככל 200 מינים הפכו בסכנת הכחדה או שנכחד ^2,3. פטריית chytrid דוחי לא לארח ספציפית ולא ברור מה איכויות של המארח לאפשר לזיהום Bd להתקדם ולגרום למחלות קשות. Chytridiomycosis גורם למוות ע"י שיבוש תעלות יונים בעור, וכתוצאה מכך אובדן אלקטרוליטים ואי ספיקת לב ^4. כמו כן, supernatant Bd (לא מכיל zoospores BD) גורם לתגובה חיסונית בראשנים ⁵ leadinחוקרים גרם להאמין Bd מייצר רעיל תוצר ^6.

מכיוון שמינים רבים הם במהירות בירידה, מושבות אבטחה בשבי ותוכניות רבייה הן אמצעי שימור חשוב, ועשויות להיות חבל ההצלה רק לכמה מינים. הקמת ותחזוקה של מושבות ללא מחלה היא אתגר עבור מתקני דוחי ניהול. השיטות כימותרפיות הנוכחיות לטיפול בדלקות BD, למרות יעיל, יכולות להזיק לבעלי החיים שטופלו, ואין שיטת טיפול אחת הייתה מוצלחת בין זנים וסוגים של דו חיים גיל ^7.

מספר מחקרים קליניים של טיפולים לזיהום Bd בוצעו ^7. שלוש שיטות הנפוצות ביותר של טיפול הן טיפול בחום, כלורמפניקול וitraconazole. טיפול בחום הוא אפשרות טיפול nonchemotherapeutic שנראה שיש מעט תופעות לוואי, ניתן להשתמש בם בשלבי חייו מרובים, והוא generברית יעילה. בניסוי טיפול, Chatfield וריצ'רדס-זאוואצקי ⁸ מצאו כי 96% מבעלי החיים שטופלו פינו זיהומים לאחר ששוכן ב30 מעלות צלזיוס במשך 10 ימים. למרות שהמשפט הזה לא היה 100% מוצלח, זה מספק בסיס לאחרים כדי להעריך טיפול בחום למיניהם. טיפול בחום, אם כי יעיל למינים רבים, אינו מעשי עבור מינים רבים אלפיני שלא יכול להישאר בטמפרטורות גבוהות לזמן ממושך. כלורמפניקול, אנטיבקטריאלי, שמש בהצלחה לטיפול בBd במינים רבים, ומעכב את צמיחת פטרייה במבחנה. כאנטיבקטריאלי, כלורמפניקול לא לתקוף את הפטרייה באופן ספציפי, אבל כבר ידוע לגרום לאפופטוזיס בתאי אוקריוטים ^9. זה כבר העריך כי טיפול כלורמפניקול גורם אפופטוזיס בעור, הרג המנבגים תאיים, למרות שמנגנון פעולה המדויק אינו ידוע. למרות שאף ניסוי קליני כבר נערך, ולכןמינון וזמן טיפול לא הוערכו, פרוטוקולי טיפול הנוכחיים בדרך כלל דורשים טבילה לשבועות עד ארבעה שבועות ^10,11, מה שהופך את הטיפול הזה מעשי עבור דו חיים יבשתיים. כלורמפניקול גם היה מוגבל במדינות מסוימות לשימוש וטרינרים כי חשיפה של בני אדם נמצאת קשורה לצורה נדירה של אנמיה אפלסטית ^12.

Itraconazole, פטריות azole, היא בשימוש נרחב ביותר לטיפול בזיהום בBd דו חיים בשבי. הפרוטוקול הנפוץ ביותר הוא חיות רחצה בפתרון itraconazole 0.01% במשך חמש דקות ביום במשך 11 ימים רצופים. פרוטוקול זה נגזר מסטנדרטים המשמשים לניהול של יונקים, ו, בעוד יעיל לדו חיים, הוא אינו מבוסס על ניסויים קליניים בדו חיים ^11,13. פרוטוקול זה יכול לגרום לתופעות לוואי שליליות במינים מסוימים, במיוחד בסוג רנא ובראשנים וmetamorphs האחרון ^11.טיפול ראשן היה מוצלח באמצעות ריכוז נמוך בהרבה (0.0005%) של itraconazole, אבל היה קשור עם depigmentation ^14. ריכוז זהה זה trialed על metamorphs האחרון ונמצא כי הוא נכשל בטיפול בזיהום ^15. מכיוון שקיימת סיכון לתופעות לוואי שלילי עם טיפול itraconazole, כמה מתרגלים השתמשו מחצית הריכוז הרגיל (0.005%) ל11 ימים רצופים ומצאו את זה כדי להיות מוצלח בריפוי דלקות Bd ^16.

המחקר הנוכחי הוא סיכום של ניסוי קליני לטיפול באמצעות itraconazole לטיפול בזיהום Bd ^15. הפרוטוקול מתאר ניסיון למצוא את הזמן וטיפול במינון הנמוך ביותר שהוא גם בטוח ויעיל לטיפול בבעלי חיים נגועים Bd עם itraconazole. בעלי חיים המשמשים במחקר זה היו metamorphs האחרון של קרפדות חוף מפרץ, Incilius nebulifer.

Protocol

אישור אתיקה: מחקר זה והשיטות שלה אושרו על ידי הוועדה של אוניברסיטת טוליין שימוש בבעלי חיים ובטיפול (פרוטוקול לא 0407.).

1. בדיקות לזיהום Bd

1. בניקוי עבור BD
   1. בעלי חיים ספוגית עם מקלון צמר גפן סטרילי חמש פעמים בventrum, חמש פעמים בכל ירך, מכל צד, וכל איבר בסכום כולל של 45 שבץ. בניקוי הוא שיטה לא פולשנית של דגימה עבור BD על עור של דוחי.
   2. בעדינות לסובב את ספוגית בזמן ובין שבץ על מנת להבטיח את הכמות הגדולה ביותר של ה-DNA שנאספה בספוגית.
   3. מטליות חנות ב1.5 מיליליטר microtubes ב -20 ° C.
2. הפקת DNA וassay qPCR
   1. תמצית ה-DNA הגנומי מהמטליות באמצעות ערכת בידוד DNA זמינה מסחרי, בהתאם להוראות לרקמות בעלי חיים.
   2. נתח את ה-DNA שחולץ באמצעות זמן אמת PCR (qPCR) הבאה בויל אח' ^17, בשינויים הבאים.:
   3. לדלל דגימות מיצוי DNA 1:10 עם מים כפולים deionized.
   4. הוספת 0.7 μl של אלבומין בסרום שור (BSA) על מנת למנוע עיכוב ה-PCR.
   5. כולל שליטה פנימית חיובית בכל דגימה כדי להבטיח עיכוב PCR לא משפיע על תוצאות.
   6. דגימות לרוץ עם ביקורת חיובית ושלילית ושורה של סטנדרטים דילול להעריך עומס zoospore (זיהום).

2. חיסון

1. תרבות Bd
   1. הכן מרק tryptone ידי הוספת tryptone 10 גרם לאוסמוזה ההפוכה או 1 ליטר מים deionized, autoclaved (121 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות) ונותנת לו להתקרר. ברגע שהתקרר ל23 מעלות צלזיוס, להוסיף 1 מיליליטר פניצילין, סטרפטומיצין.
   2. לגדול זן BD (JEL411 מג' Longcore, מבודד מGuabal, פנמה ממור Phyllomedusa) במרק tryptone במשך שבעה ימים ב23 ° C.
2. העבר את bרוט התרבות לtryptone וצלחות אגר.
   1. כדי להפוך את הצלחות, להוסיף 10 tryptone גרם ו10 אגר גרם לאוסמוזה ההפוכה או 1 ליטר מים deionized וחיטוי (121 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות).
   2. ברגע שתערובת autoclaved הוא מגניב מספיק כדי לגעת, אבל, לפני שהוא נקרש לשפוך לתוך צלחות פטרי, 1/4-1/3 מלאים, בזרימה למינרית.
   3. כאשר אגר נקרש והתקררתי לחלוטין, להוסיף 0.5 מיליליטר מרק Bd לכל צלחת ולהתפשט באופן שווה סביב הצלחת. לאפשר לו להתייבש.
   4. לאחר הצלחות מחוסנת עם zoospores BD, צלחות חותם עם Parafilm.
   5. לאפשר צלחות לדגירה על 23 מעלות צלזיוס במשך חמישה עד שבעה ימים. בדוק zoospore תנועה כדי להבטיח את הכדאיות לפני החיסון.
3. צלחות מבול לפתרון חיסון zoospore
   1. לאחר חמישה עד שבעה הימים של הדגירה Bd וצמיחה, להציף כל צלחת עם 5 מיליליטר של מים ברז בגילים ולאפשר zoospores להיכנס לתקשורת ל10 דקות.
   2. יוצקים את suspe zoosporension לתוך מיכל נייד.
   3. מעריך ריכוז zoospore עם hemocytometer.
   4. לדלל תערובת לריכוז של 1 x 10 ⁶ ל3 מיליליטר עם מי ברז בגילים.
4. לחסן חיות
   1. ב50 מיליליטר מכלים נפרדים, לחסן כל חיה על ידי שפיכת 3 תערובת הבידוד מיליליטר מעל ventrum. אפשר לבידוד נוסף כדי לטפטף לתוך הבסיס של מיכל החיסון.
   2. כל בעל חיים יישארו במכל חיסון ל24 שעות כדי להבטיח זיהום.
   3. לאחר 24 שעות של חיסון, להחזיר חיות לTerraria חיטוי הבודד.
   4. לאפשר זיהום לבנות במשך שבועיים. לאשר זיהום עם ספוגית ותוצאות qPCR, ולהתחיל בטיפול.
   5. עבור פקדים BD-שליליים, צלחות אגר מבול BD-חופשי עם 5 מיליליטר בגילי מים ברז, ולחסן מדומה בעלי החיים משתמשים באותן השיטות כאמור לעיל.

3. טיפול משטר

1. תכשיריםמחדש אמבטיה טיפול
   1. הוספת 2.50 מיליליטר itraconazole מימיים (1% אוראלי פתרון Sporanox) לפתרון 1 של L אמפיבי רינגר (itraconazole 0.0025% - ריכוז הטיפול היעיל הנמוך ביותר).
      1. המתכון של דוחי רינגר פתרון: אוסמוזה ההפוכה או 1 ליטר מים deionized, נתרן כלורי 6.6 גרם, 0.15 אשלגן כלורי גרם, 0.15 כלוריד הסידן גרם, ו0.2 סודיום ביקרבונט גרם. פתרון החיטוי (C ° 121 ל40 דקות) ולהתקרר לטמפרטורת חדר.
      2. ל0.01% ריכוז טיפול itraconazole, להוסיף itraconazole 10.00 מיליליטר מימיים (1% אוראלי פתרון Sporanox) לפתרון של 1 L אמפיבי רינגר
      3. ל0.005% ריכוז טיפול itraconazole, להוסיף 5.00 מיליליטר itraconazole מימיים (1% אוראלי פתרון Sporanox) לפתרון של 1 L אמפיבי רינגר.
   2. עבור פקדים BD-חיוביים ו-BD-שליליים, לרחוץ בעלי חיים בפתרון של אמפיבי רינגר ללא itraconazole.
2. טיפול
   1. הנח דו חיים בודדים ב50 מיליליטר מכולות לחטא עם 35 מיליליטר של פתרון הטיפול.
   2. בעלי החיים להבטיח מכוסים במלואן במשך חמש דקות על ידי בעדינות מתערבל מיכל.
   3. להחזיר חיות לTerraria חיטוי. חזור על פעולה במשך שישה ימים.
3. להבטיח את הצלחה של טיפול
   1. בעלי החיים מבחן לזיהום Bd על טיפול היום מתחילים.
   2. בעלי חיים מבחן לזיהום Bd שבוע לאחר סיום טיפול, ופעם בשבוע במשך ארבעה שבועות כדי להבטיח זיהום יש פינה.

4. BD כBiohazard

1. לחטא שבועי Terraria בודד.
   1. להתרחץ מכולות Terraria וטיפול ב10% אמבטיה פתרון אקונומיקה.
   2. יש לשטוף את כל מיכל מולבן פעמיים עם מים זורמים.
   3. לאפשר מכולות להתייבש במשך 24 שעות לפני שימוש חוזר.
2. ללבוש כפפות nitrile נקיות בעת טיפול בבעלי חיים על מנת למנוע זיהום צולבשל הפתוגן Bd. שינוי כפפות בין טיפול בכל בעלי חיים.
3. לחטא את כל הפסולת נוזלית לפני סילוק על ידי הבאת הפתרון לאקונומיקת 10%.
4. החיטוי כל הפסולת מוצקה כי הוא עלול להיות חשוף לBd לפני הסילוק.

תוצאות

טיפול Itraconazole נחשב מוצלח אם כל בעלי החיים היו BD-שליליים ארבעה שבועות לאחר הטיפול הסתיים. לפני הטיפול החל, כשבועיים לאחר החיסון, כל בעלי החיים מחוסן-BD היו נגועים, עם מטען ממוצע zoospore של 1,121.7 (± 17.34), בעוד ארבעה שבועות לאחר הטיפול הסתיים, חיות בקרת BD-החיוביות ה?...

Discussion

שימוש בפרוטוקול זה היינו יכול בצורה בטוחה ויעיל להפחית את מינון טיפול ובזמן טיפול itraconazole עבור BD ב דו חיים. המינון הנמוך ביותר לטיפול והזמן (0.0025% במשך שישה ימים) היה טיפול מוצלח לט הנגוע subclinically nebulifer. היעילות של שני מינונים נמוכים יותר וזמן טיפול להדגים א...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox	Janssen Pharmaceutica Inc.
NaCl	Fisher Scientific	S640-500
KCl	Fisher Scientific	BP366-1
CaCl2	Fisher Scientific	BP510-100
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328-500
Sterile cotton swabs	Medical and Wire Equipment	MW113
1.5 ml Microtubes	Sarstedt	73.703.217
Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69581
7500 Real-time PCR	Applied Biosystems	4351104
VIC IPC	Applied Biosystems	4308323
BSA	Applied Biosystems	AM2618
Agar	Invitrogen	30391023
Tryptone	Invitrogen	Q10029
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Petri Dish	Sigma Aldrich	CLS430589