JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

النفث ميكروفلويديك ضد واجهة قطرات الدهون طبقة ثنائية يوفر وسيلة موثوقة لتوليد الحويصلات مع السيطرة على التماثل الغشاء، إدراج البروتينات عبر الغشاء، والتغليف من المواد. هذه التقنية يمكن تطبيقها على دراسة مجموعة متنوعة من النظم البيولوجية حيث يتم المطلوب الجزيئات الحيوية مجزأة.

Abstract

يعرض أسفل إلى أعلى البيولوجيا التركيبية نهجا جديدا للتحقيق وإعادة تشكيل النظم البيوكيميائية، وربما الحد الأدنى من الكائنات الحية. هذا المجال الناشئ يشارك المهندسين والكيميائيين وعلماء الأحياء، والفيزياء لتصميم وتجميع المكونات البيولوجية الأساسية في المجمع، وأنظمة تعمل من أسفل إلى أعلى. هذه النظم من أسفل إلى أعلى قد يؤدي إلى تطوير خلايا اصطناعية للاستفسارات البيولوجية الأساسية والعلاجات المبتكرة 1،2. يمكن الحويصلات unilamellar العملاقة (GUVs) بمثابة منصة نموذجية لعلم الأحياء الاصطناعية نظرا لهيكل غشاء الخلية مثل والحجم. النفث ميكروفلويديك، أو microjetting، هو الاسلوب الذي يسمح لتوليد GUVs مع حجم تسيطر عليها، وتكوين الغشاء والبروتين عبر الغشاء التأسيس، والتغليف 3. المبدأ الأساسي لهذه الطريقة هو استخدام متعددة، البقول السوائل عالية التردد التي تم إنشاؤها بواسطة جهاز النافثة للحبر بيزو دفعتها إلى تشوه وعلقت لطبقة ثنائية IPID إلى GUV. هذه العملية هي أقرب إلى فقاعات الصابون تهب من فيلم الصابون. من خلال تغيير تركيبة الحل متدفق، وتكوين الحل يشمل، و / أو المكونات المدرجة في طبقة ثنائية، يمكن للباحثين تطبيق هذه التقنية لخلق الحويصلات حسب الطلب. وتصف هذه الورقة الإجراء لتوليد الحويصلات بسيطة من طبقة ثنائية واجهة الحبرية بواسطة microjetting.

Introduction

أصبح من الواضح بشكل متزايد أن بيولوجيا الخلية هي مشكلة متعددة المستويات التي تنطوي على دمج فهمنا من الجزيئات إلى الخلايا. بالتالي، مع العلم بالضبط كيفية عمل الجزيئات بشكل فردي ليست كافية لفهم السلوكيات الخلوية المعقدة. هذا يرجع جزئيا إلى وجود سلوكيات الناشئة من أنظمة متعددة المكونات، كما يتضح من إعادة تشكيل الأكتين التفاعل مع شبكة حويصلات الدهنية طبقة ثنائية 4، والتجمع المغزل الإنقسامية في القيطم استخراج 5، وديناميات المكانية الأجهزة انقسام الخلايا البكتيرية 6. طريقة واحدة لاستكمال نهج الاختزالية للتشريح العمليات الجزيئية من المنظومات الحية هو اتخاذ النهج المعاكس من إعادة تشكيل السلوكيات الخلوية باستخدام مجموعة صغيرة من المكونات البيولوجية. جزء هام من هذا النهج ينطوي على التغليف موثوقة من الجزيئات الحيوية في حجم المحصورة، سمة أساسية من سمات خلية.

e_content "> العديد من الاستراتيجيات المتبعة لتغليف الجزيئات الحيوية لدراسة نظم بيوميمتيك. النظام الأكثر ملاءمة من الناحية البيولوجية هو الأغشية طبقة ثنائية المادة الدهنية، والتي تحاكي القيود البيوكيميائية والفيزيائية التي تفرضها غشاء البلازما الخلية تشكيل حويصلات unilamellar العملاقة (GUVs) من خلال electroformation 7، واحدة من أكثر التقنيات المستخدمة على نطاق واسع لتوليد GUV 14، وعادة ما يكون الفقراء العائد التغليف نظرا لتعارضه مع العازلة الملح عالية 8. أيضا يتطلب Electroformation أحجام عينة كبيرة (> 100 ميكرولتر)، والتي يمكن أن يكون مشكلة للعمل مع البروتينات المنقى ، ويشتمل على نحو غير فعال جزيئات كبيرة بسبب صعوبة نشرها بين طبقات الدهون متباعدة عن كثب. وقد وضعت عدة نهج ميكروفلويديك لتوليد حويصلات الدهنية. طرق مستحلب مزدوجة، التي تمر من خلال مكونات واجهات اثنين بين طبقات المياه نفط المياه (W / O / W)، تعتمد على التبخر من فوالمذيبات latile لدفع تشكيل طبقة ثنائية الدهن 9. وقد استخدم البعض الآخر خط التجميع ميكروفلويديك التي تنتج تيار مستمر من الدهون طبقة ثنائية حويصلات أو 10 في خطوتين مستقلة 11. قمنا بتطوير تقنية بديلة تقوم على تطبيق بسرعة نبضات السائل ضد واجهة قطرات طبقة ثنائية لإنتاج 12 GUVs من حجم تسيطر عليها، وتكوينها، والتغليف. نهجنا، والمعروفة باسم النفث ميكروفلويديك، ويقدم المزايا مجتمعة من عدة تقنيات الجيل حويصلة القائمة، وتوفير نهج لإنشاء أنظمة الجزيئية البيولوجية وظيفية للتحقيق في مجموعة متنوعة من المشاكل البيولوجية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تصنيع غرفة اللانهاية

  1. تصميم غرفة اللانهاية (يسمى لشكله) باستخدام الكمبيوتر التصميم بمساعدة (CAD) والبرمجيات، وحفظ الملف بحيث أنه متوافق مع قطع الليزر. لإنشاء هذا الشكل، منفصلة دائرتين بقطر 0.183 في بمسافة مركز إلى مركز 0.15 بوصة قطع غرفة من 1/8- 3/16 في الاكريليك واضحة مع قطع الليزر. شكل اللانهاية يسهل الحبرية واجهة تشكيل طبقة ثنائية والاستقرار.
  2. حفر 1/16 من خلال ثقب في حافة الغرفة الاكريليك على شكل ما لا نهاية أيضا. كرر على الجانب المقابل. قطع مستطيل صغير من الاكريليك ورقة 0.2 مم مع مقص أو قاطع ليزر لتكون بمثابة الأسفل إلى الآبار.
  3. تطبيق طبقة رقيقة ولكن كاملة من التجفيف السريع لاصق على جانب واحد من 0.2 مم الاكريليك والغراء إلى الجزء السفلي من الغرفة. عقد 0.2 مم الاكريليك بإحكام في مكان ضد السفلي من الغرفة والاستغناءالغراء في واجهة للسماح للالغراء لإنشاء ختم ولكن تجنب يغطي مساحة العرض. تأكد من محاذاة الاكريليك بحيث حافته هو مطاردة مع حافة جدار الغرفة، وأنها تغطي تماما انقطاع غرفة اللانهاية. وهذا سوف يسمح لاختراق طائرة كافية ومنع التسرب من البئر.
  4. قطع اثنين من قطع صغيرة من المطاط الطبيعي لتغطية الثقوب المحفورة. تطبيق التجفيف السريع لاصق حول الثقب. وضع المطاط خلال ثقب والصحافة في جميع المجالات مع زوج من ملقط لتأمين. تكرار لكلا الثقوب المحفورة. تأكد من أن كافة الاتصالات لصقها هي الاختام كاملة وذلك لمنع أي تسرب.
  5. باستخدام 23 G، 1 في إبرة، كزة حفرة في المطاط الطبيعي على جانبي الغرفة لتسهيل الإدراج من طرف النافثة للحبر كهرضغطية.

2. إعداد التجريبية

حل تخزين الدهون في الكلوروفورم الأسهم في الفريزر -20 درجة مئوية. لهذه الدراسة، إما 1،2-diphytanoوقد استخدم YL-SN-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) أو 1،2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (DOPC). وعادة ما يتم إعداد 2 مل من 25 ملغ / مل حل الدهون في هذا البروتوكول وسوف تستمر لمدة شهرين عند تخزينها في -20 درجة مئوية.

  1. ل resuspend الدهون في ن ديكان، ونقل لأول مرة من قارورة الأسهم إلى وعاء زجاجي صغير، والجافة بلطف تحت الأرجون أو النيتروجين. عقد الجرة في زاوية بينما التجفيف لفضح المزيد من المساحة السطحية للغاز، والسماح للدهون لتجف بشكل أسرع.
  2. مع غطاء الجرة ثمل قليلا فقط على، والسماح للحل المجففة للجلوس تحت فراغ في مجفف لمدة 1-2 ساعة. ثم تضيف ن ديكان لresolubilize الدهون في 25 ملغ / مل. دوامة الحل لفترة وجيزة الدهون ويصوتن ذلك في sonicator الحمام لمدة 15 دقيقة. تخزين الدهون تشكيلها في ن ديكان في -20 درجة مئوية.
  3. إعداد محلول المخزون السكروز. في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، إضافة 900 ميكرولتر من 300 ملي السكروز و 100 ميكرولترمن 1٪ ميثيل (MC). يضاف لزيادة اللزوجة ميثيل من الحل، والذي يساعد في النفث. خطوة اختيارية: إضافة 1 ميكرولتر من اختياري داكنة اللون صبغة الطعام أو الخرز الفلورسنت لتقديم مزيد من التباين أو مضان في مجال التصوير، على التوالي. هذا الحل هو حل 300 الميلي أسمول السكروز مصممة لتتناسب الأسمولية الخلوية وتوفير النقيض خلال microjetting.
  4. رسم الحل في التخلص منها 1 مل حقنة بلاستيكية. في حين عقد المحقنة مع طرف متجهة لأعلى، ونفض الغبار رمح مرارا لطرد أي فقاعات نحو الحافة، ودفع المكبس لإخراج الهواء المحبوس. يجب التأكد من اخلاء جميع الهواء من الحقنة قبل المتابعة، لأنها سوف تتداخل مع انكماش كهرضغطية المناسبة المسؤولة عن النفث.
  5. تثبيت مرشح 0.22 ميكرون على نهاية الحقنة. لمنع الهواء من الوقوع في التصفية، عقد حقنة عموديا ودفع المكبس حتى يتم تشكيل قطرات أعلاه غيض. ملاحظة: وتم العثور على 33 ملم وحدة القطر تصفية حقنة لتعمل بشكل أفضل، ولكن المرشحات البديلة صغيرة مثل 3 مم مرشح حقنة يمكن استخدامها للحد من حجم القتلى.
  6. فك محول ليور الإناث من النافثة للحبر، والضغط بشكل آمن في مكانه على نهاية التصفية. مرة أخرى، إخراج السوائل لمنع احتباس الهواء. المسمار في الجزء العلوي من النافثة للحبر. السوائل يجب أن السفر إلى غيض من النافثة للحبر بعد تعلق تماما.

3. تستعد ومعدات

  1. باستخدام الخامس المشبك، جبل الجمعية حقنة على المسرح المجهر. نعلق السلك من النافثة للحبر إلى وحدة تحكم النافثة للحبر. ملاحظة: تم بناء المرحلة مخصصة لهذا البروتوكول، في حين أن مرحلة التصميم يمكن تحديد من قبل المستخدم، فمن الأهمية بمكان أن يكون التحكم XYZ مستقلة عن حقنة والسيطرة س ص من صاحب العينة.
  2. تحديد التكبير وضرورية لتحقيق مزيج عدسة التصوير المطلوب. هنا يتم استخدام هدفا 10X 10X والعدسة.
  3. استخدام كاميرا عالية السرعة (≥ 1،000 إطارا في الثانية) لتصور النفث وتوليد حويصلة. قبل التصوير، وأداء الكاميرا اللازمة المعايرة. استخدام الصورة القائمة على صناعة السيارات في الزناد ضمن برنامج الكاميرا لبدء التقاط الصور.
  4. جبل غرفة اللانهاية على خشبة المسرح المجهر. تأمين غرفة عن طريق تسجيل في مكانه على المسرح.
  5. محاذاة بعناية غيض النافثة للحبر مع فتحة ثقب في المطاط الطبيعي (انظر الشكل 1B). للقيام بذلك، وجعل النافثة للحبر على مقربة من القاعة وضبط المواقع بالعين، ثم إجراء تعديلات أكثر دقة من خلال عدسة المجهر. المضي قدما بحذر، والحركات الخشنة يمكن أن تلحق الضرر غيض النافثة للحبر.
  6. مرة واحدة يتم محاذاة النافثة للحبر، دعم التجمع حقنة بعيدا عن غرفة لمنع أي ضرر للالنافثة للحبر أثناء التحميل من الآبار. تأكد من أن حركة النافثة للحبر في اتجاه واحد بحيث يظل الانحياز مع ثقب في الغشاء.
  7. الصحافة بلطف على plunGER من التجمع حقنة حتى أشكال قطرات صغيرة في فوهة النافثة للحبر. هذا وسوف توفر بعض احداهما الأولي.
  8. إدخال المعلمات النفث. لموجة ثنائي القطب شبه منحرف، واستخدام المعلمات التالية: تردد 20 كيلوهرتز نبض، 3 الوقت μsec الارتفاع، 35 μsec مدة النبض، 3 الوقت μsec الخريف، 65 V الجهد المطبق (نبض السعة)، و 100 طائرة في البقول الزناد (عدد النبض) . ومع ذلك، فإن الجهد المطبق (نبض السعة) وعدد النبض (البقول طائرة في الزناد) يمكن أن تختلف إلى التحكم في حجم الحويصلة.

4. الجيل حويصلة

  1. إضافة 25-30 ميكرولتر حل الدهون العالقة في ن ديكان إلى غرفة ما لا نهاية، وتغطي كامل السطح من كلا البئرين.
  2. إضافة 25 ميكرولتر الجلوكوز (من نفس الأسمولية هو الحل السكروز) إلى الحافة الخارجية من واحد أيضا، pipetting لببطء وسلاسة. على الترسيب، ينبغي أن تشكل قطرة من الجلوكوز، لأن الجلوكوز والدهون الحل لا يختلطان. إضافة 25 أخرى1، ل الجلوكوز إلى البئر المقابلة، الأمر الذي سيجعل انخفاض آخر وتشكل طبقة ثنائية الغشاء الدهني في منتصف الغرفة في غضون 5-10 دقيقة.
  3. إدراج النافثة للحبر من خلال المطاط الطبيعي، وتوجيه ذلك بعناية نحو واجهة قطرات طبقة ثنائية. الاقتراب من طبقة ثنائية ببطء، كما قدم النافثة للحبر وسوف تحل محل وحدة التخزين، ويمكن أن تمزق طبقة ثنائية.
  4. عندما النافثة للحبر هو داخل ~ 200 ميكرون، تطبيق النفث مع إعدادات موضح في الخطوة 3.8. المسافة من طبقة ثنائية قد تختلف أساسا اعتمادا على الجهد والنبض العدد، بين غيرها من المعالم. يوصي هذا البروتوكول يتزايد ببطء إعدادات (الجهد وعدد النبض) ومراقبة طبقة ثنائية تشوه.

5. تنظيف معدات

  1. فصل التجمع حقنة من مرحلة المجهر، والتخلص من 1 مل حقنة بلاستيكية والتصفية.
  2. لتنظيف النافثة للحبر، ونضح الحلول التالية في النظام عن طريق غمس طرف في محلولن 7-10X كل: 70٪ من الإيثانول و 2٪ Neutrad حل في ماء دافئ، و 70٪ من الإيثانول، وده 2 O. إذا لم النافثة للحبر تناسب بشكل آمن على ماصة الطموح، وقطع طرف ماصة لتشكيل محول.
  3. تجف الغرفة مع الأنسجة. وضع غرفة اللانهاية في كوب 250 مل مع 2٪ ت / ت Neutrad في المياه الدافئة، ويصوتن لمدة 5-10 دقيقة. بعد صوتنة، يجف تماما الآبار تحت الهواء المضغوط. أي رطوبة في الآبار يمكن أن تعرض للخطر الاستقرار في غشاء الدهون طبقة ثنائية، لذلك فمن المستحسن أيضا أن يتم وضع الغرف في الفرن على 60 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لقد جمعنا الإعداد النفث ميكروفلويديك على المجهر مضان مقلوب التقليدية مع مرحلة العرف تجميعها من أجزاء تشكيله وميكرومتر دليل (الشكل 1). توصيف النافثة للحبر توفر نظرة ثاقبة في عملية توليد حويصلة. متفاوتة المسافة بين فوهة النافثة للحبر والدهون طبقة ثنائية يؤثر ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد تم تطوير العديد من التقنيات لتوليد حويصلة، بما في ذلك electroformation، مستحلب، والجيل الحبرية 14-16. ومع ذلك، وتقنيات تجريبية جديدة ضرورية للسماح لتصميم النظم البيولوجية مع التشابه المتزايد لنظم المعيشة. وعرضت وسائل ميكروفلويديك على وجه الخصوص زيادة مستوى السيطرة...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

أعلن عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر مايك Vahey من مختبر فليتشر في جامعة كاليفورنيا، بيركلي لتقديم المشورة بشأن المعلمات microjetting. وقد رعت هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HL117748 DP2-01.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Piezoelectric InkjetMicroFab TechnologiesMJ-AL-01-xxxxxx denotes orifice diameter in microns
Jet Drive III ControllerMicroFab TechnologiesCT-M3-02
High-speed cameraVision ResearchMiroEX2
DPhPC lipid in chloroformAvanti850356COrdered in small aliquots in vials
33 mm PVDF filters, 0.2 µmFisher ScientificSLGV033RS
1 ml SyringesFisher Scientific14823434
n-DecaneAcros Organics111871000
GlucoseAcros Organics410950010
SucroseSigma-AldrichS7903-1KG
MethylcelluloseFisher ScientificNC9084958
1/8 in AcrylicMcMaster Carr8560K239CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request
0.2 mm AcrylicAstra ProductsClarex clear 001
Acrylic CementTAP Plastics10693
Loctite 495 SuperglueFisher ScientificNC9011323
Loctite 3494 UV Strengthening AdhesiveStrobels Supply30765
Natural rubberMcMaster Carr85995K14
Custom stagehomemadeN/ACAD designs are available upon request

References

  1. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).
  2. Yeh, B. J., Lim, W. A. Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry. Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).
  3. Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).
  4. Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).
  5. Brown, K. S., et al. Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle. J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).
  6. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320, 789-792 (2008).
  7. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).
  8. Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques. Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).
  9. Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles. Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).
  10. Matosevic, S., Paegel, B. M. Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line. J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).
  11. Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles. ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).
  12. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).
  13. Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation. Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).
  14. Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
  15. Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).
  16. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet Microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
  17. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).
  18. Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis. Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).
  19. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

84 unilamellar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved