Lipiddoppelschicht Vesicle Erzeugung anhand Mikrofluidik Jetting

Zusammenfassung

Mikrofluidik-Strahl gegen eine Tröpfchen Schnittstelle Lipid-Doppelschicht bietet eine zuverlässige Möglichkeit, die Kontrolle über Vesikel mit Membran-Asymmetrie, die Aufnahme von Transmembranproteinen und Kapselung von Material zu erzeugen. Diese Technik kann angewandt werden, um eine Vielzahl von biologischen Systemen, in denen unterteilte Biomolekülen gewünscht studieren.

Zusammenfassung

Bottom-up-synthetische Biologie stellt einen neuartigen Ansatz für die Untersuchung und Wiederherstellung biochemischen Systemen und möglicherweise Minimalorganismen. Dieses neue Gebiet engagiert Ingenieure, Chemiker, Biologen, Physiker und in komplexe, funktionierende Systeme von Grund auf zu entwerfen und montieren biologische Grundkomponenten. Solche Bottom-up-Systeme könnten für die Entwicklung der künstlichen Zellen, die für die biologische Grundlagen Anfragen und innovative Therapien ^1,2 führen. Riesen einschichtige Vesikel (GUV) als Modellplattform für die synthetische Biologie aufgrund ihrer zellähnlichen Membranstruktur und Größe zu dienen. Mikrofluidausstoß oder microjetting, ist eine Technik, die für die Erzeugung von GUVs mit kontrollierter Größe, die Zusammensetzung der Membran, Membranprotein Einbau und Kapselung ³ ermöglicht. Das Grundprinzip dieses Verfahrens ist die Verwendung von mehreren Hochfrequenz-Fluidimpulse von einem piezobetätigten Tintenstrahlvorrichtung, um einen suspendierten l verformen erzeugtenIPID Doppelschicht in eine GUV. Das Verfahren ist vergleichbar mit Seifenblasen aus einem Seifenfilm. Durch Variation der Zusammensetzung der ausgestoßenen Lösung, die Zusammensetzung der Lösung, umfasst, und / oder der Komponenten in der Doppelschicht enthalten ist, können die Forscher, diese Technik anzuwenden, um maßgeschneiderte Vesikel zu erzeugen. Dieses Papier beschreibt das Verfahren, um einfache Vesikel aus einer Doppelschicht von Tröpfchen-Schnittstelle microjetting generieren.

Einleitung

Es wurde zunehmend klar, dass der Zellbiologie ist ein Multi-Problem, das die Integration unserer Verständnis von Molekülen, Zellen beinhaltet. Folglich genau zu wissen, wie Moleküle arbeiten einzeln nicht ausreicht, um komplexe zelluläre Verhaltensweisen zu verstehen. Dies ist teilweise auf das Vorhandensein von aufkommenden Verhaltens von Mehrkomponentensystemen, wie durch das Auflösen von Aktin-Netzwerk Interaktion mit Lipiddoppelschicht-Vesikel ^4, mitotischen Spindelanordnung in Xenopus Beispiel ⁵ extrahieren und die räumliche Dynamik der bakteriellen Zellteilung Maschinen ^6. Ein Weg, der reduktionistischen Ansatz zu sezieren die molekularen Prozesse lebender Systeme ergänzen ist, den umgekehrten Weg der Wiederherstellung zellulären Verhaltensweisen mit einem minimalen Satz von biologischen Komponenten zu nehmen. Ein wichtiger Teil dieses Ansatzes umfasst die zuverlässige Verkapselung von Biomolekülen in einem begrenzten Volumen, eine wichtige Funktion einer Zelle.

e_content "> Mehrere Strategien gibt es zur Verkapselung von Biomolekülen für die Untersuchung biomimetischer Systeme. Die meisten biologisch relevanten System Lipidmembranen, die die biochemischen und physikalischen Beschränkungen, die durch Plasmamembran der Zelle auferlegt imitieren. Bildung von Riesen einschichtige Vesikel (GUV), die durch Galvanoformation ^7, eine der am häufigsten verwendeten Techniken zum GUV Generation ¹⁴ weist typischerweise eine schlechte Ausbeute Verkapselung aufgrund seiner Unverträglichkeit mit Hochsalzpuffer ^8. Galvanoformation erfordert auch große Probenvolumina (> 100 &mgr; l), was ein Problem für die Arbeit mit gereinigten Proteinen könnte und ineffizient enthält große Moleküle aufgrund der Diffusion zwischen eng beieinander liegenden Lipidschichten. Mehrere mikrofluidischen Ansätze zur Erzeugung von Lipidbläschen entwickelt worden. Die Doppelemulsionsverfahren, die Komponenten über zwei Schnittstellen zwischen den Schichten Wasser-Öl-Wasser zu lassen (W / O / W), beruht auf der Verdampfung eines volatile Lösungsmittel zur Bildung Lipid-Doppelschicht ⁹ zu fahren. Andere haben eine mikrofluidische Montagelinie, die einen kontinuierlichen Strom von Lipid-Doppelschicht-Vesikel ¹⁰ oder in zwei unabhängigen Schritten ¹¹ erzeugt eingesetzt. Wir haben eine alternative Technik, die auf die Anwendung schnell Fluidpulse gegen eine Tröpfchen Schnittstelle Doppelschicht ¹² bis GUVs kontrollierter Größe, Zusammensetzung und Kapselung produzieren. Unser Ansatz, wie mikrofluidischen Strahl bekannt ist, bietet die kombinierten Vorteile von mehreren vorhandenen Vesikel-Generation-Techniken und bietet einen Ansatz für die Erstellung von funktionalen Biomolekülen zur Untersuchung einer Vielzahl von biologischen Problemen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

1. Unendlich Kammer Fabrication

1. Entwerfen Sie die Unendlichkeit Kammer (für seine Form benannt) mit Hilfe eines computergestützten Design (CAD)-Software, und speichern Sie die Datei, so dass es mit einem Laserschneider kompatibel ist. Um diese Form, separate zwei Kreise mit einem Durchmesser von 0.183 im erstellen von einem Mitte-zu-Mitte-Abstand von 0,15 in. Schneiden Sie die Kammer von 1/8- 3/16 in klarem Acryl mit dem Laserschneider. Der Infinity-Form erleichtert Tröpfchen-Schnittstelle Doppelschichtbildung und Stabilität.
2. Bohren Sie ein 1/16 im Loch durch die Kante der Acrylkammer in die Unendlichkeit-förmigen gut. Wiederholen, auf der gegenüberliegenden Seite. Schneiden Sie ein kleines Rechteck aus einem 0,2 mm Acrylglas mit einer Schere oder einem Laser-Cutter als unten in die Vertiefungen dienen.
3. Tragen Sie eine dünne Schicht, aber komplett von schnell trocknenden Kleber auf der einen Seite der 0,2 mm Acryl und kleben Sie es auf den Boden der Kammer. Halten Sie die 0,2 mm Acryl fest an Ort und Stelle gegen den Boden der Kammer und verzichtender Klebstoff an der Grenzfläche, damit der Klebstoff, um eine Dichtung zu schaffen, aber zu vermeiden für den Betrachtungsbereich. Seien Sie sicher, dass die Acryl so ausrichten, dass sein Rand ist bündig mit der Kante der Kammerwand und die Unendlichkeit Kammer Ausschnitt vollständig bedeckt. Dies wird für ausreichend Strahleindringtiefe ermöglichen und verhindern, dass ein Austreten des gut.
4. Schneiden Sie zwei kleine Stücke aus Naturkautschuk um die Bohrungen zu decken. Bewerben schnell trocknende Kleber um das Loch herum. Platzieren Sie die Gummi über das Loch und drücken Sie auf allen Gebieten mit einer Pinzette zu sichern. Wiederholen Sie für beide Bohrungen. Seien Sie sicher, dass alle Klebeverbindungen sind komplett Dichtungen, um ein Auslaufen zu verhindern.
5. Verwendung einer 23 G Nadel 1, stoßen ein Loch in dem Naturkautschuk auf beiden Seiten der Kammer, um das Einsetzen des piezoelektrischen Tintenstrahlspitze zu erleichtern.

2. Experimentelle Vorbereitung

Shop Lager Lipidlösung in Chloroform in einem -20 ° C Gefrierschrank. Für diese Studie entweder 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPhPC) oder 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) verwendet. 2 ml 25 mg / ml Lipidlösung wird in der Regel in diesem Protokoll hergestellt und für zwei Monate bei -20 ° C gelagert

1. Um das Lipid in n-Dekan resuspendieren, übertragen Sie sie von einem Lager in ein kleines Fläschchen Glas, und unter Argon oder Stickstoff sanft trocken. Halten Sie das Glas unter einem Winkel, während der Trocknung auf eine größere Oberfläche zu dem Gasfreizulegen, so dass das Lipid zu trocknen schneller.
2. Mit der Kappe der Dose nur leicht angeschraubt, damit die getrocknete Lösung unter Vakuum in einem Exsikkator für 1-2 Stunden zu sitzen. Dann wird n-Decan, das Lipid bei 25 mg / ml wieder aufzulösen. Vortex der Lipid-Lösung kurz und beschallen es in einem Ultraschallbad für 15 min. Bewahren Sie die wiederhergestellten Lipid in n-Decan bei -20 ° C
3. Bereiten Sie ein Lager Saccharose-Lösung. In einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, fügen 900 ul 300 mM Saccharose und 100 ulvon 1% Methylcellulose (MC). Methylcellulose zugegeben, um die Viskosität der Lösung, die in Strahlhilfen erhöhen. Optionaler Schritt: Hinzufügen eines optional 1 ul der dunklen Lebensmittelfarbe oder fluoreszierende Kügelchen, um mehr Kontrast oder Fluoreszenz-in-Bildgebung zu verleihen, sind. Diese Lösung ist ein 300 mOsm Saccharose-Lösung entwickelt, um zelluläre Osmolarität anzupassen und Kontrast während microjetting bieten.
4. Zeichnen Sie die Lösung in eine 1-ml-Kunststoffspritze. Während mit der Spitze nach oben hält die Spritze, Flick die Welle mehrmals, um alle Blasen in Richtung der Spitze zu vertreiben, und drücken Sie den Kolben, um die eingeschlossene Luft auszustoßen. Seien Sie sicher, dass alle Luft aus der Spritze, bevor Sie fortfahren zu evakuieren, da es mit der richtigen piezoelektrischen Kontraktion zum Strahlen verantwortlich stören.
5. Installieren eines 0,22 &mgr; m-Filter am Ende der Spritze. Um Luft in den Filter eingefangen zu vermeiden, halten Sie die Spritze senkrecht und drücken Sie den Kolben, bis ein Tröpfchen oberhalb der Spitze gebildet. Hinweis: Ein33 mm Durchmesser Spritzenfiltereinheit wurde festgestellt, am besten zu funktionieren, aber alternative Filter so klein wie ein 3 mm Durchmesser Spritzenfilter kann verwendet werden, um das tote Volumen zu reduzieren.
6. Schrauben Sie den Luer-Adapter des Tintenstrahl-, und an der Stelle drücken Sie sie sicher über das Ende des Filters. Auch auszuwerfen Flüssigkeit Lufteinschlüsse zu vermeiden. Schrauben Sie die Spitze der Inkjet. Flüssigkeit sollte bis zur Spitze des Tintenstrahl reisen, nachdem sie vollständig angebracht ist.

3. Bereitet die Ausrüstung

1. Verwendung einer Spannklammer, mount die Spritzeneinheit auf dem Mikroskoptisch. Befestigen Sie den Draht von der Inkjet an der Tintenstrahl-Controller. Anmerkung: Ein angepasstes Bühne war für dieses Protokoll errichtet, während das Bühnenbild kann vom Benutzer bestimmt werden kann, ist es wichtig, unabhängig xyz Kontrolle der Spritze und xy Steuerung des Probenhalters haben.
2. Bestimmen Sie die Vergrößerung und Objektivkombination erforderlich, um die gewünschte Abbildung zu erreichen. Hier ein 10X-Objektiv und Okular 10X verwendet.
3. Verwenden Sie eine Hochgeschwindigkeitskamera (≥ 1.000 fps), um die Strahl und Vesikel-Generation zu visualisieren. Vor der Bildgebung, führen notwendige Kamerakalibrierung. Nutzen Sie Image-basierte Auto-Trigger in der Kamera-Software, um Bildaufnahme zu initiieren.
4. Montieren Sie die Unendlichkeit Kammer auf dem Mikroskoptisch. Sichern Sie die Kammer durch Abkleben es in Platz auf der Bühne.
5. Richten Sie die Inkjet-Spitze mit dem Loch in der Naturkautschuk durchstochen (siehe Abbildung 1b). Um dies zu tun, bringen die Inkjet Nähe der Kammer und passen Sie die Positionierung mit dem Auge, dann machen Sie eine präzisere Anpassung durch das Mikroskop-Objektiv. Gehen Sie vorsichtig, als grobe Bewegungen können die Inkjet-Spitze beschädigen.
6. Nachdem die Tintenstrahlausgerichtet ist, den Rücken des Spritzenanordnung von der Kammer, um eine Beschädigung des Tintenstrahl während des Ladens der Vertiefungen zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass die Bewegung des Tintenstrahl unidirektional ausgerichtet, so dass es mit dem Loch in der Membran verbleibt.
7. Drücken Sie vorsichtig auf die plunger der Spritzenanordnung, bis eine kleine Tröpfchen bildet sich an der Tintenstrahldüse. Dies wird einige anfängliche Gegendruck.
8. Geben Sie die Strahlparameter. Für einen trapezförmigen bipolaren Welle, verwenden Sie die folgenden Parameter: 20 kHz Taktfrequenz, 3 Mikrosekunden Anstiegszeit, 35 Mikrosekunden Pulsdauer, 3 us Abfallzeit, 65 V angelegte Spannung (Pulsamplitude) und 100 Jet-Pulse pro Abzug (Impulszahl) . Jedoch kann die angelegte Spannung (Pulsamplitude) und Pulszahl (Strahlimpulse pro Trigger) variiert werden, um Vesikel Größe zu steuern.

4. Vesikel-Generation

1. In 25-30 ul Lipid-Lösung in n-Dekan an der Unendlichkeit Kammer aufgehängt, die das gesamte Oberfläche beider Brunnen.
2. In 25 ul Glucose (der gleiche Osmolarität wie die Saccharose-Lösung) an den äußersten Rand der man gut, Pipettieren langsam und gleichmäßig. Nach Abscheidung, sollte ein Tropfen von Glukose zu bilden, weil die Glukose-und Lipid-Lösung nicht zusammen. In weitere 251, l Glucose zu der gegenüberliegenden gut, die einen Tropfen bilden und bilden die Lipiddoppelschichtmembran in der Mitte der Kammer innerhalb von 5-10 min wird.
3. Legen Sie die Inkjet durch den Naturkautschuk, und sorgfältig zu führen es auf die Tröpfchen-Schnittstelle Doppelschicht. Nähern Sie sich der Doppelschicht langsam, als die eingeführt werden Inkjet-Volumen verdrängen und kann die Doppelschicht reißen.
4. Wenn der Tintenstrahldrucker ist innerhalb von ~ 200 um, gelten die Strahl mit den in Schritt 3.8 beschriebenen Einstellungen. Der Abstand von der Doppelschicht kann hauptsächlich in Abhängigkeit von der Spannung und Pulszahl unter anderen Parametern variieren. Dieses Protokoll empfiehlt langsam ansteigenden Werten (Spannung und Impulszahl) und unter Berücksichtigung Doppelschicht Deformation.

5. Reinigung der Geräte

1. Nehmen Sie die Spritzeneinheit aus dem Mikroskoptisch, und entsorgen Sie die 1 ml Kunststoffspritze und Filter.
2. Zur Reinigung des Tintenstrahl-, aspirieren die folgenden Lösungen, um durch Eintauchen der Spitze in die solution 7-10x jeweils: 70% Ethanol, 2% Neutrad Lösung in warmem Wasser, 70% Ethanol und ddH ₂ O. Wenn der Tintenstrahldrucker nicht richtig passt, auf der Aspiration Pipette, schneiden Sie eine Pipettenspitze, um einen Adapter zu bilden.
3. Trocknen Sie die Kammer mit Gewebe. Legen Sie die Unendlichkeit Kammer in einem 250 ml-Becherglas mit 2% v / v Neutrad in warmem Wasser und beschallen für 5-10 min. Nach der Beschallung, die Brunnen gründlich unter Druckluft trocknen. Keine Feuchtigkeit in den Vertiefungen kann die Stabilität der Lipid-Doppelschicht-Membran eindringen, so empfiehlt es sich zudem, dass die Kammern in einem Ofen bei 60 ° C für 15 Minuten platziert.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Wir haben eine mikrofluidische Strahl Setup auf einem herkömmlichen invertierten Fluoreszenzmikroskop mit einer benutzerdefinierten Etappe von bearbeiteten Teilen und manuelle Mikrometer montiert (Abb. 1) zusammengebaut. Charakterisierung des Tintenstrahl gibt Einblick in die Vesikel-Erzeugungsprozess. Verändern des Abstands zwischen der Tintenstrahldüse und Lipiddoppelschicht wirkt die Kraft aufgebracht, um eine Verformung der Membran verursachen. In unmittelbarer Nähe zu der Doppelschicht fokussie...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Viele Techniken zur Bläschenerzeugung entwickelt worden, einschließlich Galvanoformation, Emulsions-und Tröpfchenerzeugung ^14-16. Jedoch sind neue experimentelle Techniken notwendig, um für das Design von biologischen Systemen mit wachsender Ähnlichkeit mit lebenden Systemen zu ermöglichen. Mikrofluidik-Verfahren haben sich insbesondere ein erhöhtes Maß an Kontrolle über Membran unilamellarity, Monodispersität der Größe und interne Inhalte ^17,18 angeboten, womit Vesikel Modelle näher a...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piezoelectric Inkjet	MicroFab Technologies	MJ-AL-01-xxx	xxx denotes orifice diameter in microns
Jet Drive III Controller	MicroFab Technologies	CT-M3-02
High-speed camera	Vision Research	MiroEX2
DPhPC lipid in chloroform	Avanti	850356C	Ordered in small aliquots in vials
33 mm PVDF filters, 0.2 µm	Fisher Scientific	SLGV033RS
1 ml Syringes	Fisher Scientific	14823434
n-Decane	Acros Organics	111871000
Glucose	Acros Organics	410950010
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903-1KG
Methylcellulose	Fisher Scientific	NC9084958
1/8 in Acrylic	McMaster Carr	8560K239	CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request
0.2 mm Acrylic	Astra Products	Clarex clear 001
Acrylic Cement	TAP Plastics	10693
Loctite 495 Superglue	Fisher Scientific	NC9011323
Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive	Strobels Supply	30765
Natural rubber	McMaster Carr	85995K14
Custom stage	homemade	N/A	CAD designs are available upon request