Bicouche lipidique des vésicules génération utilisant microfluidique jets

Résumé

Jet microfluidique contre une bicouche lipidique de l'interface des gouttelettes fournit un moyen fiable pour générer des vésicules avec le contrôle de l'asymétrie de la membrane, l'incorporation de protéines transmembranaires, et l'encapsulation des matériaux. Cette technique peut être appliquée pour étudier une variété de systèmes biologiques où les biomolécules compartimentés sont souhaitées.

Résumé

Bottom-up biologie synthétique présente une nouvelle approche pour l'étude et la reconstitution des systèmes biochimiques et, potentiellement, les organismes minimes. Ce domaine émergent engage des ingénieurs, des chimistes, des biologistes et physiciens de concevoir et assembler des composants biologiques de base dans les systèmes complexes, fonctionnant de bas en haut. Ces systèmes bottom-up pourraient conduire à l'élaboration de cellules artificielles pour des enquêtes biologiques fondamentales et des thérapeutiques innovantes ^1,2. Vésicules unilamellaires géants (GUVS) peuvent servir de plate-forme de modèle pour la biologie synthétique en raison de leur structure et la taille membrane cellulaire comme. Éjection microfluidique, ou microjetting, est une technique qui permet la génération de GUVs de taille contrôlée, la composition de la membrane, une protéine transmembranaire de constitution, et l'encapsulation ^3. Le principe de base de cette méthode est l'utilisation de plusieurs, des impulsions de fluide à haute fréquence générés par un dispositif à jet d'encre piézo-actionné pour déformer une suspendu lbicouche ipid dans une GUV. Le processus est semblable à des bulles de savon à partir d'un film de savon. En faisant varier la composition de la solution à jets, la composition de la solution globale, et / ou les composants inclus dans la bicouche, les chercheurs peuvent appliquer cette technique pour créer des vésicules personnalisés. Cet article décrit la procédure pour générer des vésicules simples à partir d'un bicouche d'interface de gouttelettes par microjetting.

Introduction

Il est devenu de plus en plus clair que la biologie cellulaire est un problème multi-échelle qui consiste à intégrer notre compréhension des molécules aux cellules. Par conséquent, savoir précisément comment les molécules travaillent individuellement n'est pas suffisante pour comprendre les comportements cellulaires complexes. Ceci est partiellement dû à l'existence de comportements émergents de systèmes multi-composants, comme en témoigne la reconstitution de l'actine interaction avec le réseau avec des vésicules bicouches lipidiques ^4, l'assemblage du fuseau mitotique dans Xenopus extrait ^5, et la dynamique spatiale de bactéries mécanismes de la division cellulaire ^6. Une façon de compléter l'approche réductionniste de disséquer les mécanismes moléculaires des systèmes vivants est de prendre la démarche inverse de reconstituer les comportements cellulaires en utilisant un ensemble minimal de composants biologiques. Une partie essentielle de cette approche implique l'encapsulation fiable de biomolécules dans un volume confiné, un élément clé de la cellule.

e_content "> Il existe plusieurs stratégies pour encapsuler des biomolécules pour l'étude de systèmes biomimétiques. Le système le plus d'intérêt biologique est membranes bicouches lipidiques, qui imitent les contraintes biochimiques et physiques imposées par la membrane plasmique de la cellule. formation de vésicules unilamellaires géantes (les GUVS) par électroformation ^7, l'une des techniques les plus largement utilisés pour la production d'GUV ^14, a généralement un rendement d'encapsulation pauvres en raison de son incompatibilité avec le tampon de sel trop élevée ^8. électroformation exige aussi grands volumes d'échantillons (> 100 pi), ce qui pourrait être un problème pour travailler avec des protéines purifiées , et incorpore de manière inefficace grandes molécules en raison de la difficulté de diffusion entre les couches lipidiques peu espacées. Plusieurs approches microfluidiques pour générer des vésicules lipidiques ont été développés. Les procédés de double émulsion, qui passent des composants par l'intermédiaire de deux interfaces entre les couches d'eau-huile-eau (W / O / W), repose sur l'évaporation d'un volatile solvant pour conduire lipides formation bicouche ^9. D'autres ont utilisé une ligne d'assemblage microfluidique qui produit un courant continu de vésicules bicouches lipidiques ¹⁰ ou en deux étapes indépendantes ^11. Nous avons mis au point une autre technique basée sur l'application d'impulsions de fluide rapide contre une bicouche d'interface des gouttelettes ¹² pour produire GUVs de taille contrôlée, la composition, et l'encapsulation. Notre approche, connue sous le nom de jet microfluidique, offre les avantages combinés de plusieurs techniques existantes de production de vésicules, fournissant une approche pour créer des systèmes biomoléculaires fonctionnels pour enquêter sur une série de problèmes biologiques.

Protocole

Une. Infinity Chambre Fabrication

1. Concevoir la chambre de l'infini (du nom de sa forme) en utilisant un ordinateur de conception assistée (CAO), et enregistrer le fichier tel qu'il est compatible avec un cutter laser. Pour créer cette forme, séparés deux cercles de diamètre 0,183 à une distance de centre à centre de 0,15 po Couper la chambre de 1/8- 3/16 en acrylique clair avec la découpe au laser. La forme de l'infini facilite l'interface gouttelette formation bicouche et la stabilité.
2. Percez un trou de 1/16 en passant par le bord de la chambre à l'acrylique et en forme de l'infini. Répéter l'opération sur le côté opposé. Couper un petit rectangle d'une feuille acrylique de 0,2 mm avec des ciseaux ou un couteau à laser pour servir de fond dans les puits.
3. Appliquer une fine couche de colle, mais complète à séchage rapide à un côté de l'acrylique de 0,2 mm et il colle à la partie inférieure de la chambre. Maintenir l'acrylique de 0,2 mm fermement en place contre le fond de la chambre et distribuerla colle à l'interface pour permettre à la colle pour créer un joint, mais éviter de couvrir la zone de visualisation. Veiller à aligner l'acrylique de telle sorte que son bord est de niveau avec le bord de la paroi de la chambre et qu'il recouvre complètement la découpe de la chambre de débordement. Ceci permettra une pénétration suffisante de jet et d'éviter les fuites du puits.
4. Couper deux petits morceaux de caoutchouc naturel pour couvrir les trous percés. Appliquer la colle à séchage rapide autour du trou. Placez le caoutchouc sur le trou et appuyez sur tous les domaines avec une paire de pinces pour le fixer. Répétez l'opération pour les deux trous percés. Assurez-vous que toutes les connexions sont joints collés complètes de manière à éviter toute fuite.
5. L'utilisation d'un 23 G, dans une aiguille, percer un trou dans le caoutchouc naturel des deux côtés de la chambre pour faciliter l'insertion de la pointe de jet d'encre piézo-électrique.

2. Préparation expérimentale

Conserver la solution stock de lipides dans le chloroforme dans un congélateur à -20 ° C. Pour cette étude, soit le 1,2-diphytanoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DPhPC) ou le 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC) a été utilisé. 2 ml de 25 mg / ml solution lipidique est généralement préparé dans ce protocole et durera deux mois lorsqu'il est conservé à -20 ° C.

1. Pour remettre le lipide dans le n-décane, d'abord transférer à partir d'un tube de réserve à un petit pot de verre, et doucement sec sous argon ou de l'azote. Tenir le pot à un angle tout en séchant à exposer plus de surface pour le gaz, permettant le lipide à sécher plus vite.
2. Avec le capuchon de la fiole que légèrement vissé sur, laisser la solution reposer séché sous vide dans un dessiccateur pendant 1 à 2 h. Puis ajouter le n-décane à resolubiliser le lipide à 25 mg / ml. Vortex la solution lipidique brièvement et soniquer dans un bain sonique pendant 15 min. Stocker les lipides reconstitué dans le n-décane à -20 ° C.
3. Préparer une solution stock de saccharose. Dans un tube à centrifugation de 1,5 ml, ajouter 900 ul de 300 mM de saccharose et 100 plde 1% de méthylcellulose (MC). La méthylcellulose est ajoutée pour augmenter la viscosité de la solution, ce qui facilite la projection. Étape facultative: Ajouter un option 1 pl de colorant alimentaire de couleur sombre ou des billes fluorescentes de prêter plus de contraste ou de la fluorescence en imagerie, respectivement. Cette solution est une solution 300 mOsm de saccharose conçu pour correspondre à osmolarité cellulaire et de fournir un contraste pendant microjetting.
4. Aspirer la solution dans un jetable 1 ml seringue en plastique. En tenant la seringue avec la pointe vers le haut, faites glisser l'arbre à plusieurs reprises pour chasser les bulles vers la pointe, et pousser le piston pour éjecter l'air emprisonné. Assurez-vous d'évacuer tout l'air de la seringue avant de procéder, comme il va interférer avec la contraction piézoélectrique bon responsable de jet.
5. Installer un filtre de 0,22 um à l'extrémité de la seringue. Pour empêcher l'air d'être piégées dans le filtre, tenir la seringue verticalement et pousser le piston jusqu'à ce qu'une goutte est formée au-dessus de la pointe. Note: A33 mm unité de filtre de seringue de diamètre a été trouvé pour fonctionner au mieux, mais d'autres filtres que la taille d'un filtre à seringue de 3 mm de diamètre peut être utilisé pour réduire le volume mort.
6. Dévissez l'adaptateur Luer femelle du jet d'encre, et en toute sécurité presser en place sur l'extrémité du filtre. Encore une fois, éjecter un fluide pour éviter d'emprisonner l'air. Visser dans le haut de la jet d'encre. Liquide doit se rendre à la pointe de l'encre après qu'il soit complètement fixé.

3. Préparant l'équipement

1. Avec utilisation d'un serre-joint, monter l'ensemble de seringue sur la platine du microscope. Fixez le fil de l'encre sur le contrôleur de jet d'encre. Remarque: Une étape de la coutume a été construit pour ce protocole, tandis que la mise en scène peut être déterminée par l'utilisateur, il est essentiel d'avoir le contrôle de xyz indépendant de la seringue et le contrôle xy du porte-échantillon.
2. Déterminer le grossissement et la combinaison de la lentille nécessaire pour obtenir l'image souhaitée. Voici un objectif 10X et 10X oculaire sont utilisés.
3. Utilisez un appareil photo à haute vitesse (≥ 1.000 images par seconde) pour visualiser la projection et la génération de la vésicule. Avant imagerie, effectuer l'étalonnage de l'appareil nécessaire. Utiliser basée sur l'image auto-déclenchement dans le logiciel de la caméra de lancer la capture d'image.
4. Montez la chambre de l'infini sur la platine du microscope. Fixez la chambre par le coller en place sur la scène.
5. Alignez soigneusement la pointe de jet d'encre avec le trou percé dans le caoutchouc naturel (voir figure 1b). Pour ce faire, amener le jet d'encre à proximité de la chambre et ajuster le positionnement à l'oeil, puis faire des ajustements plus précis à travers la lentille de microscope. Procéder avec prudence, que les mouvements secondaires peuvent endommager la pointe de jet d'encre.
6. Une fois que le jet d'encre est aligné, sauvegarder l'ensemble de seringue loin de la chambre pour éviter tout dommage à l'encre pendant le chargement des puits. Assurez-vous que le mouvement du jet d'encre est unidirectionnel de sorte qu'elle reste alignée avec le trou dans la membrane.
7. Appuyez doucement sur la PLUNger de l'ensemble de seringue jusqu'à une petite forme de gouttelettes à la buse à jet d'encre. Cela donnera une certaine contre-pression initiale.
8. Saisissez les paramètres de jets. Pour une onde bipolaire trapézoïdale, utilisez les paramètres suivants: 20 kHz de fréquence d'impulsion, 3 temps ps de montée, 35 durée us d'impulsion, 3 temps ps d'automne, 65 V tension appliquée (impulsion d'amplitude), et 100 impulsions de jet par déclenchement (nombre d'impulsions) . Cependant, la tension appliquée (d'amplitude des impulsions) et le nombre d'impulsions (impulsions de jet par déclenchement) peuvent être modifiées pour contrôler la taille des vésicules.

4. Vésicule génération

1. Ajouter la solution de lipide de 25 à 30 ul de suspension dans le n-décane à la chambre de débordement, qui couvre la surface entière des deux puits.
2. Ajouter 25 ul de glucose (de même osmolarité que la solution de saccharose) et le bord le plus extérieur d'un puits, le pipetage lentement et sans à-coup. Lors du dépôt, une goutte de glucose doit former, parce que le glucose et la solution de lipide ne se mélangent pas. Ajoutez un autre 251, l de glucose à l'opposé et, ce qui fera un autre goutte et former la membrane de la double couche lipidique dans le milieu de la chambre à l'intérieur de 5 à 10 min.
3. Insérez le jet d'encre à travers le caoutchouc naturel, et de guider avec précaution vers la bicouche interface gouttelette. Approche de la bicouche lentement, comme le jet d'encre introduite supplantera volume et peut se rompre la bicouche.
4. Lorsque le jet d'encre est à ~ 200 um, appliquer la projection avec les paramètres décrits dans l'étape 3.8. La distance de la bicouche peut varier principalement en fonction de la tension et du nombre d'impulsions, entre autres paramètres. Ce protocole recommande de plus en plus lentement paramètres (tension et le nombre d'impulsions) et en observant la déformation de la bicouche.

5. Nettoyage de l'équipement

1. Détachez l'ensemble de seringue de la platine du microscope, et de disposer de la 1 ml seringue de plastique et le filtre.
2. Pour nettoyer le jet d'encre, aspirer les solutions suivantes dans l'ordre en plongeant la pointe dans le solution 7-10x chaque: 70% d'éthanol, solution à 2% Neutrad dans l'eau chaude, 70% d'éthanol, et le trou DDH ₂ O. Si le jet d'encre ne tient pas bien sur la pipette d'aspiration, couper une pointe de pipette pour former un adaptateur.
3. Séchez la chambre avec le tissu. Placez la chambre de l'infini dans un bécher de 250 ml avec 2% v / v Neutrad dans l'eau chaude, et de traitement par ultrasons pendant 5-10 min. Après sonication, sécher les puits sous air comprimé. Toute trace d'humidité dans les puits peut compromettre la stabilité de la membrane de type bicouche lipidique, de sorte qu'il est également recommandé que les chambres sont placées dans une étuve à 60 ° C pendant 15 min.

Résultats

Nous avons assemblé une configuration de jet microfluidique sur un microscope inversé à fluorescence conventionnelle avec une scène personnalisée assemblé à partir de pièces usinées et des micromètres manuels (Figure 1). Caractérisation du jet d'encre permet de mieux comprendre le processus de génération de la vésicule. Faire varier la distance entre la buse à jet d'encre bicouche lipidique et affecte la force appliquée pour provoquer une déformation de la membrane. La proximit?...

Discussion

De nombreuses techniques ont été mises au point pour la production de vésicules, comprenant électroformation, d'émulsion, et la génération de gouttelettes ^{de 14 à 16.} Cependant, de nouvelles techniques expérimentales sont nécessaires pour permettre la conception de systèmes biologiques avec une similitude de plus en plus de systèmes vivants. Méthodes microfluidiques, en particulier, ont offert un niveau accru de contrôle régissant unilamellarity de membrane, monodispersité de la taille, et...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piezoelectric Inkjet	MicroFab Technologies	MJ-AL-01-xxx	xxx denotes orifice diameter in microns
Jet Drive III Controller	MicroFab Technologies	CT-M3-02
High-speed camera	Vision Research	MiroEX2
DPhPC lipid in chloroform	Avanti	850356C	Ordered in small aliquots in vials
33 mm PVDF filters, 0.2 µm	Fisher Scientific	SLGV033RS
1 ml Syringes	Fisher Scientific	14823434
n-Decane	Acros Organics	111871000
Glucose	Acros Organics	410950010
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903-1KG
Methylcellulose	Fisher Scientific	NC9084958
1/8 in Acrylic	McMaster Carr	8560K239	CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request
0.2 mm Acrylic	Astra Products	Clarex clear 001
Acrylic Cement	TAP Plastics	10693
Loctite 495 Superglue	Fisher Scientific	NC9011323
Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive	Strobels Supply	30765
Natural rubber	McMaster Carr	85995K14
Custom stage	homemade	N/A	CAD designs are available upon request