تنقية الكروماتوغرافي من غير البروتينية المؤتلف الإيلاستين مثل والإنشطار مع الببتيدات والبروتينات من<em&gt; كولاي</em

Summary

البروتينية مثل الإيلاستين هي البوليمرات الحيوية التحفيز تستجيب مع التطبيقات بدءا من تنقية البروتين المؤتلف لتسليم المخدرات. يصف هذا البروتوكول تنقية وتوصيف البروتينية مثل الإيلاستين والببتيد أو البروتين اندماج بهم من القولونية باستخدام درجة حرارة المحلول المرحلة الانتقالية السلوك أقل الحرجة كبديل بسيطة لاللوني.

Abstract

البروتينية مثل الإيلاستين هي البوليمرات الحيوية المتكررة التي تظهر في مرحلة الحل درجة الحرارة أقل السلوك الحرجة التي تمر بمرحلة انتقالية، كما unimers للذوبان الموجودة تحت درجة حرارة التحول مميزة وتجميع في coacervates ميكرون النطاق فوق درجة حرارة انتقالها. تصميم البروتينية مثل الإيلاستين على المستوى الجيني يسمح بالتحكم الدقيق في تسلسلها وطول، والتي تملي خصائصها الحرارية. وتستخدم البروتينية مثل الإيلاستين في مجموعة متنوعة من التطبيقات بما في ذلك biosensing، هندسة الأنسجة، وتسليم المخدرات، حيث درجة حرارة التحول والهندسة المعمارية من البوليمر الحيوي ELP يمكن ضبطها لتطبيق معين من الفائدة. وعلاوة على ذلك، فإن المرحلة الانتقالية درجة حرارة المحلول السلوك أقل تنتقد البروتينية مثل الإيلاستين يسمح تنقية من خلال استجابتها الحرارية، بحيث تقوصر بهم انتقائية وresolubilization يسمح إزالة كل الملوثات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبانق التالية التعبير في الإشريكية القولونية. ويمكن استخدام هذا النهج لتنقية البروتينية مثل الإيلاستين وحدها أو بوصفها أداة لتنقية الببتيد أو البروتين اندماج حيث الببتيدات أو البروتينات المؤتلف وراثيا لإلحاق به ببتيد مثل الإيلاستين يمكن تنقيته دون اللوني. يصف هذا البروتوكول تنقية البروتينية مثل الإيلاستين والببتيد أو البروتين اندماج ويناقش تقنيات توصيف الأساسية لتقييم السلوك الحراري للمنتجات نقية ببتيد مثل الإيلاستين.

Introduction

الإيلاستين البروتينية مثل (ELPs) هي البوليمرات الحيوية تتألف من VPGXG خماسي الببتيد مكرر حيث X، بقايا الضيف، أي الأحماض الأمينية إلا البرولين. ELPs المعرض درجة حرارة المحلول أقل الحرجة (LCST) مرحلة انتقالية السلوك، مثل أن الحل ELP متجانسة سيفصل إلى مرحلتين عند التسخين لLCST لها، وهو ما يسمى عادة درجة حرارة التحول العكسي (T _ر) في الأدب ELP ^1. وتتكون المرحلتين من ELP المرحلة كرية مخفف جدا ومرحلة الرواسب الغنية ELP. يتم تشكيل الرواسب الغنية ELP على فترة زمنية قصيرة على تجميع سلاسل ELP الى جزيئات ميكرون الحجم التي تتجمع في وقت لاحق. يحدث هذا السلوك على مجموعة من بضع درجات مئوية وعادة ما هو عكسها، كما يتم استرداد حل متجانسة عند عودته إلى درجة حرارة أقل من T _ر.

وعادة ما يتم تصنيعه في ELPs كولاي (كولاي) جيئة وذهابام الجينات الاصطناعية التي هو ligated إلى البلازميد التعبير. ثم يتم تحويل هذا البلازميد إلى E. خط الخلية القولونية التي هي الأمثل للتعبير البروتين. وقد استخدمنا حصرا النظام متجه T7 لاك حيوان أليف للتعبير عن مجموعة كبيرة ومتنوعة من ELPs في E. القولونية، على الرغم من أن أنظمة التعبير الأخرى في الخميرة ^2-4، الفطريات ^5، والنباتات ^6-8 كما تم استخدامها من قبل المحققين الأخرى. ويوجد عدد من النهج لبناء وراثيا الجينات ELP المتكررة، بما في ذلك ربط العودية الاتجاه (RDL) ^9، ربط الاتجاه العودية بواسطة إعادة الإعمار البلازميد (PRE-RDL) ^10، وتتداخل تمديد المتداول دائرة التضخيم (OERCA) ^11. القدرة على مهندس ELPs على المستوى الجيني يتيح الفرصة لاستخدام تقنيات الحمض النووي المؤتلف لخلق ELPs مع مجموعة متنوعة من أبنية (على سبيل المثال، وحيدة، diblocks، triblocks، الخ)، والتي يمكن زيادة إلحاق مع ظيفيةالببتيدات والبروتينات. السيطرة على المستوى الجيني يضمن أيضا أن يتم التعبير عن كل ELP مع طول الدقيق وتكوين تمليها قالب البلازميد الوراثية، وتوفير منتجات البوليمر الحيوي monodisperse تماما.

الخصائص الحرارية من كل ELP تعتمد على المعلمات الجوهرية إلى البوليمر الحيوي مثل الوزن الجزيئي (MW)، وتسلسل، وكذلك العوامل الخارجية بما في ذلك تركيزه في حل وجود cosolutes الأخرى، مثل أملاح. طول ELP ¹² و تكوين بقايا ضيفه ^{1، 13، 14} هي معلمتين متعامد في تصميم ELP التي يمكن استخدامها للسيطرة على _ر T، حيث تؤدي مخلفات ضيف مسعور وأطوال سلسلة يعد في أقل تي _تي، في حين ماء بقايا الضيوف وأطوال سلسلة أقصر يؤدي إلى ارتفاع T _ر ق. تركيز ELP يرتبط عكسيا مع _ر T، حيث من الحلول غرامتركيز آكلى لحوم البشر ELP يكون أقل T _ر ق ^12. نوع وتركيز الأملاح تؤثر أيضا على ELP تي _تي، حيث تأثير الأملاح يتبع سلسلة هوفمايستر ^15. الأنيونات Kosmotropic (الكلورين ^- وأعلى في سلسلة هوفمايستر) خفض ELP T _ر وزيادة تركيز الملح يعزز هذا التأثير. يمكن ضبطها هذه المعايير الجوهرية وخارجي للحصول على السلوك الحراري في درجة حرارة تتراوح الهدف ما هو مطلوب لتطبيق معين من ELP.

سلوك التحفيز استجابة من ELPs مفيد لمجموعة متنوعة من التطبيقات بما في ذلك biosensing ^{16، 17، 18} هندسة الأنسجة، وتسليم المخدرات ^{19 و 20.} بالإضافة إلى ذلك، عندما تنصهر ELPs لالببتيدات أو البروتينات على المستوى الجيني، يمكن للELP بمثابة علامة تنقية بسيطة لتوفير وسيلة غير مكلفة لتنقية دفعة من الحماسي المؤتلفالمد والجزر أو البروتينات التي لا تتطلب اللوني ^21. التعديل من عملية تنقية يضمن أن نشاط بروتين الببتيد أو تنصهر إلى ELP المحافظة. الببتيد أو البروتين ELP اندماج يمكن تنقية للتطبيقات التي العلامة ELP مفيد ^{22، 23} أو بدلا من ذلك، عندما يكون مطلوبا الببتيد مجانا أو البروتين، يمكن إدراج موقع الاعتراف البروتيني بين الببتيد أو البروتين وELP. ومن ثم يمكن تحقيق إزالة العلامة ELP بواسطة الهضم مع البروتيني حرة أو ELP الانصهار البروتيني، حيث يوفر هذا الأخير سهولة إضافية من تجهيز وجولة نهائية من تنقية ELP يمكن فصل ELP العلامة والبروتيني ELP الانصهار من الببتيد الهدف أو البروتين في خطوة واحدة ^{24 و 25.} يصف بروتوكول باتباع الإجراء لتنقية ELPs والببتيد أو البروتين ELP اندماج عن طريق خصائصها الحرارية ويناقش التقنيات الأساسية للتميزالاستجابة الحرارية من المنتجات ELP.

Protocol

1. ELP التعبير

1. تطعيم 3 مل من وسائل الإعلام العقيمة رائع مع مرق الأسهم DMSO أو أجار لوحة مستعمرة E. القولونية مناسبة للتعبير البروتين الذي يحتوي على البلازميد المطلوب ELP-ترميز تحت سيطرة المروج T7 لاك. إضافة المضادات الحيوية المناسبة واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل (O / N) مع استمرار اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة.
2. إضافة 1 مل من ثقافة O / N إلى 1 لتر من مرق رائع وسائل الإعلام العقيمة في 4-L القارورة. إضافة المضادات الحيوية المناسبة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة مع استمرار اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة. ملاحظة: "المتسرب" التعبير خط الأساس الذي يشهده المروج T7 لاك غير كافية للتعبير عن مستوى عال من العديد من ELPs إذا تم تحضين ثقافة لمدة 24 ساعة. ومع ذلك، يمكن أن تستخدم نهجا أكثر تقليدية، حيث يتم يسببها بروتين تعبير مزيد بإضافة 0.2-1 ملي الآيزوبروبيل بيتا-D-thiogalactoside (IPTG) عندما الكثافة البصرية للثقافة تصل إلى 0.6.
3. نقل الثقافة من 4-L قارورة لزجاجة الطرد المركزي 1-L وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة في 2،000 ز س.
4. تجاهل طاف. ملاحظة: إذا كان يزرع أكثر من 1 لتر من الثقافة التي يمكن أن تكون موجزة وذلك بإضافة لتر آخر من ثقافة إلى بيليه وتكرار الخطوة 1.3. لتصل إلى 2 L الثقافة يمكن مكثف في بيليه خلية واحدة.
5. resuspend الكرية في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، والمياه، أو عازلة الأخرى المطلوبة للوصول إلى 45 مل من تعليق خلية ونقلها إلى أنبوب 50 مل المخروطية.

2 ELP تنقية: أولي خطوات والجولة الأولى من المرحلة الانتقالية العكسية الدراجات

1. يصوتن بيليه الخلية معلق لما مجموعه 9 دقيقة في دورات من 10 ثانية 'على' و 20 ثانية 'قبالة' في انتاج الطاقة من 85 واط، مع الحفاظ على عينة على الجليد. السماح لفترة وجيزة العينة لتبرد على الجليد ثم كرر دورة 9 دقيقة مرة أخرى. ملاحظة: إذا كان من المتوقع أن ELP لديها منخفضة جدا تي _تي و'قبالة' فاصل ويمكن زيادة تصل إلى 40 ثانية لتجنب التدفئة من الحل فوق T _ر.
2. نقل المحللة إلى 50 مل جولة أسفل أنبوب الطرد المركزي.
3. إضافة 2 مل من 10٪ (ث / ت) polyethyleneimine (PEI) لكل لتر من الثقافة ويهز إلى المزيج. ملاحظة: PEI هو بوليمر موجبة الشحنة التي تسعف في التكثيف من الملوثات الجينية سالبة الشحنة. لا تنفيذ هذه الخطوة إذا تم شحن هذه ELP سلبا، كما يجوز للPEI أيضا تتكثف وإزالة المنتج ELP.
4. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 16،000 ز س.
5. نقل طاف لتنظيف 50 مل جولة أسفل أنبوب الطرد المركزي وتجاهل بيليه.
6. اختياري "خبز من" الخطوة: احتضان العينة على 60 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لتفسد الملوثات البروتين ومن ثم نقل إلى 4 درجة مئوية أو إلى جليد حتى يتم resolubilized في ELP تماما. الطرد المركزي العينة عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 16،000 ز س. نقل طاف إلى البنودEAN 50 مل جولة أسفل أنبوب الطرد المركزي وتجاهل بيليه. ملاحظة: لا تنفيذ هذه الخطوة إذا تم تنصهر الببتيد أو البروتين إلى ELP ومن المتوقع أن تفسد في حالة من حرارة مرتفعة. قد يؤدي هذا التحول ELP لتصبح الحرارة لا رجعة فيه أو قد تدمر نشاط شاردة تنصهر.
7. لحث الانتقال ELP مع إضافة كلوريد الصوديوم البلورية (لا تتجاوز 3 M). بدلا من ذلك، سيترات الصوديوم (لا تتجاوز 0.3 M) يمكن استخدامها لELPs التي لديها أعلى T _ر ق أو عوائد منخفضة. ملاحظة: الحل يجب أن تتحول غائم مرة واحدة قد حلت الملح، مما يدل على الانفصال مرحلة ELP من الحل. ELPs ماء للغاية مع ارتفاع T _ر ق قد تتطلب درجة معينة من التدفئة، في تركيبة مع إضافة الملح، للحث على فصل المرحلة من ELP في هذا الاستقراء الأولي للانتقال ELP.
8. أجهزة الطرد المركزي في تمبرتث الغرفة (RT) لمدة 10 دقيقة في 16،000 x ج (تدور الساخنة). ملاحظة: إن بيليه ELP يجب به لوحظ، الذي يعتمد على العائد التعبير عن ELP الحجم. قد تظهر هذه بيليه ELP في البداية مبهمة، ولكن بعد التبريد سوف تظهر شفافة، وربما تكون في اللون البني. سوف بيليه ELP تصبح أكثر عديم اللون كما تتم إزالة عائدات تنقية والملوثات.
9. تجاهل طاف وإضافة 1-5 مل من العازلة المطلوب لبيليه. resuspend الكرية من قبل pipetting أو وضع أنبوب لتدوير في 4 درجات مئوية. ملاحظة: إن حجم المطلوب من العازلة تعتمد على حجم بيليه ELP، وبالتالي فإن العائد من ELP التعبير، حيث يجب أن تضاف كمية كافية من العازلة للسماح resolubilization من بيليه ELP. ELPs مع الاستفادة من المحتويات عالية السيستين تنقية في الماء مع 10 ملي تريس (2-carboxyethyl) الفوسفين هيدروكلوريد (TCEP، حمض الهيدروكلوريك) في درجة الحموضة 7 للقضاء على التفاعلات ثاني كبريتيد مع البروتينات تلويث. ELPs مع فائدة عالية المحتوى من تهمة تنقية في درجة الحموضة تعديلها لتحييد عهدتهم والحد ايلىالتفاعلات ctrostatic مع البروتينات تلويث.
10. نقل الحل ELP معلق في 1 مل مأخوذة بعين نظيفة أنابيب microcentrifuge 1.5 مل.
11. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 16،000 x ج (تدور الباردة). ينبغي أن يلاحظ وجود بيليه صغيرة من ملوثات غير قابلة للذوبان.
12. نقل طاف لأنبوب نظيفة وتجاهل بيليه.

3 ELP تنقية: جولات لاحقة من معكوس الانتقالية الدراجات

1. لحث الانتقال ELP مع الحرارة و / أو إضافة كلوريد الصوديوم. يمكن حضنت العينات على كتلة الحرارة أو في حمام مائي لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة أعلى من T _ر. إذا، ومع ذلك، وتنصهر في ELP لبروتين (استبعاد استخدام الحرارة) أو إذا كان ELP لديه T _ر العالية التي لا يمكن التوصل إليها مع الحرارة وحدها، على بعد 5 M حل كلوريد الصوديوم يمكن أن تضاف الإفلات من الحكمة للحث على ELP الانتقالية. ملاحظة: الحل يجب أن تتحول غائم، مما يدل على الانفصال مرحلة ELP من الحل.
2. الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 16،000 x ج (تدور الساخنة). إذا تم استخدام الحرارة في الخطوة 3.1، تنفيذ هذه الخطوة الطرد المركزي عند درجة حرارة أعلى ما كان مطلوبا للحث على التحول ELP. إذا تم استخدام كلوريد الصوديوم وحدها في الخطوة 3.1، تنفيذ هذه الخطوة الطرد المركزي في RT. ملاحظة: يجب وحظ بيليه ELP.
3. تجاهل طاف، إضافة 500-750 ميكرولتر من العازلة المطلوب، و resuspend بيليه من قبل pipetting أو وضع أنبوب لتدوير في 4 درجات مئوية.
4. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 16،000 x ج (تدور الباردة). ينبغي أن يلاحظ وجود بيليه صغيرة من ملوثات غير قابلة للذوبان.
5. نقل طاف لأنبوب نظيفة وتجاهل بيليه.
6. كرر الخطوات من 3،1-3،5 حتى يتم احترام أي بيليه الملوثات أثناء الخطوة 3.4.

4. معالجة ما بعد تنقية (اختياري)

1. إذا رغبت في ذلك، dialyze العينة ضد عازلة مناسبة لإزالة الملح الزائد من الحل ELP المنقى. ملاحظة: يجب أن ELPs أن يكون مجفف بالتجميدمدال ضد ده ₂ س س / N عند 4 درجة مئوية.
2. إذا رغبت في ذلك، ويجفد ELP للتخزين على المدى الطويل من خلال تجميد الحل في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل lyophilizing O / N. ملاحظة: تجفيد لا ينبغي أن تستخدم لإلحاق ELPs مع البروتينات.
3. إذا رغبت في ذلك، واستعادة الببتيد مجانا أو البروتين من الببتيد أو البروتين ELP الانصهار عن طريق إزالة علامة ELP:
   1. هضم البروتين الببتيد أو ELP الانصهار مع البروتيني البيروكسيديز (على النحو الموصى به من قبل المورد البروتيني) أو مع الانصهار البروتيني ELP المقابلة لموقع البروتيني مصممة وراثيا بين الببتيد أو البروتين وELP.
   2. إذا كان ذلك ممكنا، وإزالة البروتيني البيروكسيديز باستخدام الخرز streptavidin المعدلة (على النحو الموصى به من قبل المورد البروتيني).
   3. لحث على الانتقال من ELP المشقوق و / أو البروتيني ELP الانصهار بإضافة الإفلات من الحكمة حل 5 M كلوريد الصوديوم.
   4. أجهزة الطرد المركزي في RT لمدة 10 دقيقة في 16،000 ز س. ملاحظة: يجب وحظ بيليه ELP.
   5. جمع طاف وتجاهل بيليه ELP. Dialyze طاف ضد عازلة المطلوب أو استخدام عامل تصفية الطرد المركزي لإجراء تبادل عازلة من أجل إزالة تركيز عالية من الملح من الببتيد نقية أو حل البروتين.
   6. تأكيد انشقاق كاملة من الببتيد مجانا أو البروتين من العلامة ELP بواسطة سلفات الصوديوم دوديسيل هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS-PAGE).

5 توصيف: SDS-PAGE

1. إعداد عينات ELP لSDS-PAGE عن طريق خلط 10 ميكرولتر من ELP مخففة في الماء مع 10 ميكرولتر من العازلة عينة تحتوي على 2 المركابتويثانول. ملاحظة: 40 ميكروغرام من ELP غالبا ما تكون كافية لتقييم حجم ونقاء المنتج ELP.
2. احتضان العينة على 100 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ثم تحميل على هلام بولي أكريلاميد جنبا إلى جنب مع البروتين سلم بحجم مناسب.
3. تشغيل هلام في 180 V حتى تقترب من صبغ الجزء السفلي من هلام (حوالي 45 دقيقة).
4. وصمة عار علىهلام مع محلول 0.5 M CuCl ₂ لمدة 5 دقائق، في حين هزاز. ملاحظة: وعادة لا تصور ELPs بواسطة Coomassie بريليانت الأزرق وصمة عار، وبعض متواليات ELP لا تتفاعل مع هذه الصبغة. Coomassie بريليانت الأزرق يتفاعل في المقام الأول مع بقايا أرجينين ويتفاعل مع الآخرين ضعيفة الأساسية مخلفات الحامض الاميني ليسين والعطرية ومخلفات التربتوفان، التيروزين، والفينيل ألانين ^26. وبالتالي ELPs والببتيد أو البروتين ELP اندماج يمكن ملطخة Coomassie بريليانت الأزرق إلا إذا تسلسل الأولية تضم عددا كافيا من هذه المخلفات محددة.
5. تحقق من أن ميجاوات من الفرقة ELP يقابل ذلك من MW النظرية المتوقعة من الجينات ELP وأنه لا فرق الملوثات دخيلة موجودة. ملاحظة: بعض ELPs تهاجر مع MW الظاهر أعلى تصل إلى 20٪ من MW المتوقعة على ^{9، 27.}

6 توصيف: مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز /التأين وقت من رحلة الطيف الكتلي (MALDI-TOF-MS)

1. إعداد الحل ELP في 50٪ أسيتونتريل مائي يحتوي على حمض trifluoroacetic 0.1٪ لتحقيق تركيز ELP ما يقرب من 25 ميكرومتر. ملاحظة: يجب أن يكون هذا الحل خالية من الملح، لذلك يجب أن ELP مدال ضد H ₂ O تنقية التالية.
2. إعداد مصفوفة حل من حمض sinapinic المشبعة 50٪ في أسيتونتريل مائي يحتوي على حمض trifluoroacetic 0.1٪.
3. إضافة 1 ميكرولتر من الحل ELP إلى 9 ميكرولتر من الحل مصفوفة لتحقيق تركيز ELP ما يقرب من 2.5 بمول / ميكرولتر. ملاحظة: يمكن أن تضعف هذا الخليط أيضا مع حل مصفوفة لتحسين إشارة MALDI-TOF.
4. إيداع 1-2 ميكرولتر من خليط ELP-مصفوفة على لوحة معدنية MALDI وترك بقعة يجف تماما.
5. الحصول 5-10 أطياف MALDI-TOF مع لتحديد الشامل لتوجيه الاتهام نسبة (م / ض) من ELP والاستدلال ميجاوات لقياسه.

7. توصيفن: قياس العكر وتشتت الضوء الحيوي يحددها درجة الحرارة

1. تحديد _ر T من ELP بواسطة يحددها درجة الحرارة قياس العكر:
   1. إعداد سلسلة التخفيف (على سبيل المثال، 5-100 ميكرون) من الحلول ELP في المخزن المؤقت المطلوب.
   2. باستخدام الأشعة فوق البنفسجية فيز طيفي التحكم في درجة حرارته، وقياس الكثافة الضوئية (OD) في 350 نانومتر على مجموعة من درجات الحرارة (على سبيل المثال، 20-80 درجة مئوية) بمعدل التدفئة من 1 درجة مئوية / دقيقة. ملاحظة: إذا كان يعتبر أي زيادة في OD تي _تي قد تتجاوز درجة الحرارة الحد العلوي من الصك. يمكن انخفض تي _تي واضحة من خلال إضافة كلوريد الصوديوم. تبدأ في 1 M كلوريد الصوديوم وزيادة في الخطوات من 0.5 M حتى يتم الكشف عن الانتقال ELP في درجة حرارة تتراوح قابلة للقياس.
   3. تحقق عكس اتجاه التحول ELP عن طريق قياس انخفاض في التطوير التنظيمي على نفس نطاق درجة الحرارة بمعدل التبريد من 1 درجة مئوية / دقيقة.
   4. تحديد _ر T من وطيالبوليمر ELP عن طريق تحديد نقطة انعطاف في ملف التعكر (OD تآمر مقابل درجة الحرارة). ملاحظة: هذه الحرارة يمكن تعريف بسهولة من المشتقة من منحنى OD، حيث يتم تعريف درجة الحرارة المقابلة لأقصى المشتقة مثل T _ر. سوف أبنية ELP أكثر تعقيدا عرض لمحات التعكر أكثر تعقيدا، وينبغي تحليلها كما هو موضح في القسم 7.2.
2. ويتحقق توصيف إضافية من ELPs التي تعرض الخصائص الحرارية أكثر تعقيدا (مثل بوليمرات diblock أن ELP الذاتي التجمع في المذيلات كروية) من خلال تشتت الضوء الحيوي (DLS):
   1. إعداد الحل ELP في المخزن المؤقت المطلوب وتمرير عينة من خلال مرشح مع 20-450 نانومتر حجم المسام. ملاحظة: سوف اختيار مرشح حجم المسام تعتمد على وجود وحجم، واستقرار أي المجالس ELP في الحل. ويفضل أصغر ممكنا حجم المسام تصفية للقضاء على الملوثات، مثلالغبار، وهذا يقلل من جودة القياسات DLS. وينبغي أن تستخدم مرشح أكبر حجم المسام عندما يتم اجهت مقاومة كبيرة عند تمرير حل ELP من خلال أحجام أصغر مرشح المسام.
   2. قياس نصف قطر الهيدروديناميكية (R _H) على مجموعة من درجات الحرارة الذي يتوافق مع المنطقة ذات الاهتمام المحددة في الملف الشخصى التعكر. ملاحظة: يكون unimers ELP عادة R _H <10 نانومتر، والجمعيات جسيمات متناهية الصغر لديها R _H ~ 20-100 نانومتر، والمجاميع لديها R _H> 500 نانومتر. كل زيادة في R _H يجب أن تتوافق مع زيادة في OD في 350 نانومتر تقاس الأشعة فوق البنفسجية فيز الطيفي بوصفها وظيفة من درجة الحرارة، والذي يتناسب مع حجم الجسيمات.

النتائج

نحن هنا وصف نتائج ممثلة لتنقية وتوصيف لالمبلمر المتجانس ELP وdiblock كوبوليمر ELP. بعد 24 ساعة من التعبير في E. القولونية، يتم جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي و lysed بواسطة صوتنة. عادة، وهو تغيير خفية في اللون يحدث بعد صوتنة، مؤكدا تحلل الخلية كافية (الشكل 1A). بعد إضافة جزيرة الأمير إدوارد، يتم جمع مكونات الجينوم والحطام الخلوية بواسطة الطرد المركزي، وفصل بيليه كبيرة من الملوثات غير القابلة للذوبان من ELP للذوبان في طاف (الشكل 1B). يتم تنقيته بواسطة ELP مزيد عكسية الدراجات الانتقالية (ITC)، الذي يستغل السلوك LCST لفصل ELP كلا من الملوثات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان (الشكل 2) ^28. يتم تشغيل المرحلة الانتقالية للELP بإضافة الحرارة و / أو الملح. النتائج الطرد المركزي في تشكيل بيليه في أسفل الأنبوب الذي يتكون من ELP لالثانية بعض الملوثات غير قابلة للذوبان (الشكل 1C). هذه الخطوة تسمى ساخنة تدور المرتجع الملوثات القابلة للذوبان في حين يتم الاحتفاظ طاف بيليه ELP ومعلق في المخزن الباردة. يتم طرد ELP resolubilized مرة أخرى في 4 درجات مئوية. هذه خطوة يطلق البرد تدور المرتجع بيليه من الملوثات غير القابلة للذوبان في حين يتم الاحتفاظ طاف تحتوي على ذوبان ELP. تكرار دورة بالتناوب يدور الساخنة والباردة يزيد من نقاء ELP، ولكن على حساب انخفاض العائد قليلا، كما يتم فقدان المتبقية ELP خلال كل جولة ITC في أنابيب الطرد المركزي وعلى نصائح ماصة.

وأكد تنقية ناجحة من ELPs والببتيد أو البروتين اندماج ELP بواسطة SDS-PAGE. مأخوذة الصغيرة التي اتخذت خلال عملية تنقية تدليل على تنقية التدريجي للELP من E. المحللة القولونية. هى overexpressed ELP في E. الخام كولاي المحللة والملوثات خفض الطرافةح جولات متعاقبة من مركز التجارة الدولية (الشكل 3). المنقى ELP يظهر على شكل فرقة واحدة بالقرب من MW النظرية توقع.

يتميز ELP تي _تي من قبل يحددها درجة الحرارة قياس العكر. الملف الشخصى التعكر من المبلمر المتجانس ELP يسلك زيادة حادة في واحد OD في 350 نانومتر (ما يقرب من 2.0 وحدة فوق خط الأساس لتركيز ELP من 25 ميكرومتر) (الشكل 4A). التبريد بالاشعة التعكر تأكيد طبيعة عكسها للانتقال ELP كما ترجع OD إلى خط الأساس عندما يتم خفض درجة حرارة أقل من تي _تي (الشكل 4B). ELP diblock بوليمرات يحمل لمحة التعكر أكثر تعقيدا، بالمقارنة مع المبلمر المتجانس ELPs. وOD يزيد عادة أول من 0.1-0.5 وحدة فوق خط الأساس، وبعد ذلك الزيادات OD بشكل حاد إلى 2.0 وحدة فوق خط الأساس (الشكل 5A). توفير قياسات DLS المعلومات حول التغيير في R _H فيما يتعلق درجة الحرارة، وشارك rroborating المعلومات المكتسبة من التشكيل الجانبي التعكر (الشكل 5B).

الشكل 1. تنقية ELP الأولية بعد 24 ساعة من التعبير، E. القولونية يتم جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي ومعلق في برنامج تلفزيوني. وهي lysed A) من قبل خلايا صوتنة، الذي يصاحبه تغير في اللون خفية مثل أن يظلم المحللة بعد صوتنة. ب) بعد إضافة PEI لاختصار الملوثات الحمض النووي، والمحللة هو طرد وفصل بيليه كبيرة من الحطام غير قابلة للذوبان من ذوبان ELP في طاف. C) هو فعل التحول ELP مع إضافة الحرارة و / أو الملح وأشكال الطرد المركزي لبيليه ELP شفافة.عنخ "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. الدراجات التحول العكسي. ELP يتم تنقيته عن طريق السلوك LCST في الفترة من الملوثات سواء القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان. بدءا المحللة ELP الغنية (1) وبفعل التحول ELP مع إضافة الحرارة و / أو الملح وELP يتم فصل بواسطة الطرد المركزي (تدور الساخنة) (2). يتم الاحتفاظ بيليه ELP (3A)، في حين يتم تجاهل طاف تحتوي على الملوثات القابلة للذوبان (3B). هو معلق على ELP في المخزن البارد (4) وطرد مرة أخرى في 4 درجات مئوية (تدور الباردة) (5). يتم تجاهل بيليه تحتوي على ملوثات غير قابلة للذوبان (6A)، في حين يتم الاحتفاظ طاف تحتوي على ذوبان ELP (6B). وتتكرر دورات بالتناوب يدور الساخنة والباردة حتى يتم الوصول إلى النقاء المطلوب، كما هو محدد معSDS-PAGE. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

تأكيد الشكل 3. تحليل SDS-PAGE منتجات تنقية ELP. تنقية الناجحة لELP بواسطة SDS-PAGE. بإفراط (overexpressed) ELP هو واضح في E. الخام المحللة القولونية بعد صوتنة (2). بعد إضافة PEI والطرد المركزي يتم الاحتفاظ ELP للذوبان إلى حد كبير في طاف (3)، على الرغم من بعض ELP فقدت في التخلص من الملوثات بيليه غير قابلة للذوبان (4). طاف بعد الأولى تدور الساخن يحتوي على مستويات عالية من الملوثات القابلة للذوبان (5). طاف بعد الأولى تدور الباردة يشير الفصل جيدة من ELP من الملوثات غير قابلة للذوبان (6). دورات إضافية من الملفات الساخنة (7) وجيدور القديمة (8) إزالة الملوثات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان المتبقية، على التوالي، حتى الساخنة (9) وتدور الباردة (10) supernatants النهائي يحمل أي العصابات الملوثة دخيلة، مؤكدا النقاء مرضية للمنتج ELP. هذا المبلمر المتجانس ELP، مع سلسلة من SKGPG (VGVPG) _80-Y، لديه الوزن الجزيئي المتوقع من 33.37 كيلو دالتون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4. توصيف ELP المبلمر المتجانس بواسطة يحددها درجة الحرارة قياس العكر. يتم تحديد ELP تي _تي من خلال رصد OD في 350 نانومتر مع زيادة درجة الحرارة بمعدل 1 ° C / دقيقة. A) homopolymers ELP المعرض زيادة حادة في واحد OD أن مواطنهإيناس _ر T بهم في إعطاء التركيز. B) يتم التحقق من عكس اتجاه التحول ELP من خلال رصد OD في 350 نانومتر من حل 25 μ M في حين خفض درجة الحرارة، حيث يتم تأكيد الانعكاسية التي كتبها عودة OD الى الاساس. هذا المبلمر المتجانس ELP لديه تسلسل SKGPG (VGVPG) _80-Y. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5. توصيف ELP diblock كوبوليمر بواسطة قياس العكر يحددها درجة الحرارة وتشتت الضوء الحيوي. ELPs التي تخضع نانو النطاق التجميع الذاتي، مثل ELP diblock بوليمرات التي تجمع الذاتي في المذيلات كروية، يحمل ملامح التعكر أكثر تعقيدا. أ) زيادة معتدلة في التطوير التنظيمي يشير إلى الانتقال من unimers لالمذيلات، وذلك قبل الزيادة السريعة في التطوير التنظيمي الذي يشير التجميع الكامل للELP في المجاميع ميكرون على نطاق القياسات. B) DLS تأكيد السلوك يستدل من التشكيل الجانبي التعكر ل الحل عند 25 ميكرومتر من خلال توفير المعلومات حول التغيير في R _H مع الاحترام لدرجة الحرارة. هنا unimer ELP لديه R _H ~ 8 نانومتر ومذيلة ديه R _H ~ 25 نانومتر. هذه مجموعة من البوليمرات diblock ELP لديه تسلسل GCGWPG (VGVPG) ₆₀ - (AGVPGGGVPG) _30-PGGS. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

ELPs تقدم وسيلة غير مكلفة وخالية من اللوني تنقية عن طريق استغلال سلوكهم مرحلة التحفيز استجابة. هذا النهج يستفيد من السلوك LCST من ELPs والببتيد أو البروتين ELP اندماج للقضاء على كل من الملوثات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان بعد التعبير عن ELPs المشفرة وراثيا في E. القولونية. هذا سهولة تنقية يمكن استخدامها لإنتاج ELPs لمجموعة متنوعة من التطبيقات، أو يمكن استغلالها لتنقية الببتيدات أو البروتينات المؤتلف الذي ELP يمكن أن تكون بمثابة علامة تنقية التي يمكن إزالتها مع تجهيز تنقية آخر.

ينطوي تنقية ELP الخطوات الأولية لليز E. القولونية وإزالة الجيني وغير قابلة للذوبان حطام خلية من الثقافة المحللة الخام (الشكل 1)، يليه إزالة الملوثات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان المتبقية عن طريق مركز التجارة الدولية (الشكل 2). الطرد المركزي بعد إحداث التحول ELP من قبل عدينشوئها من الحرارة أو الملح يفصل ELP من الملوثات القابلة للذوبان في طاف، في خطوة توصف تدور الساخنة. بعد resolubilizing في ELP، يتم طرد الحل مرة أخرى عند درجة حرارة أقل من T _ر لإزالة الملوثات بيليه غير قابلة للذوبان، في خطوة توصف تدور الباردة. يدور بالتناوب الساخنة والباردة يحسن نقاء الحل ELP مع كل دورة، بتكلفة صغيرة لانتاج. غلة تنقية تختلف تبعا لELP تي _تي، وطول، والببتيدات تنصهر أو البروتينات. عادة، هذا البروتوكول ينتج 100 ملغ من ELP تنقيته للتر الواحد من E. ثقافة القولونية، ولكن غلة يمكن أن تصل إلى 500 ملغ / لتر. يتم تأكيد نقاء النهائي للمنتج ELP بواسطة SDS-PAGE (الشكل 3). ميغاواط من ELP النقي يجب أن تطابق بشكل وثيق مع ميغاواط النظرية المشفرة بواسطة الجينات ELP. ومع ذلك، فإن بعض ELPs الهجرة في SDS-PAGE مع MW الظاهر أعلى تصل إلى 20٪ من MW المتوقعة على ^{9، 27.} تحليل أكثر دقة للELPلا يمكن أن يتحقق ميجاوات بحلول MALDI-TOF-MS، والتي يمكن أيضا تقديم معلومات إضافية عن نقاء المنتج ELP جنبا إلى جنب مع التقنيات التحليلية متعامد مثل اللوني السائل عالي الأداء (HPLC).

تنقية التالية، يتم قياس ELP تي _تي من قبل يحددها درجة الحرارة قياس العكر. هذه التقنية تراقب OD من حل ELP في حين يتم زيادة درجة الحرارة. تي _تي هو تركيز تعتمد ولذلك فمن المستحسن أن تميز سلسلة تركيز ذات الصلة بتطبيق المقصود من ELP. لhomopolymers ELP الشخصى التعكر يسلك زيادة حادة واحد الذي يتوافق مع انتقال ELP من unimer المجاميع إلى ميكرون النطاق (الشكل 4A). يتم تعريف T _T ودرجة الحرارة المقابلة لنقطة انعطاف في ملف تعريف التعكر، تحدد بالضبط كما الحد الأقصى للمشتقة الأولى من التطوير التنظيمي فيما يتعلق درجة الحرارة. حالة العكس منوأكد ELP المرحلة الانتقالية انخفاض في OD إلى خط الأساس كما هو خفض درجة حرارة أقل من تي _تي (الشكل 4B). سوف الشخصى التعكر مع زيادة وخفض درجة الحرارة سلالم تختلف في حجمها وحركية بسبب تسوية من coacervates ELP والتباطؤ متغير ELP resolubilization. الببتيد أو البروتين ELP اندماج يحمل بالمثل السلوك LCST في هذا الطريق، حيث الببتيد أو البروتين تنصهر إلى ELP يؤثر على T _ر. للبروتين اندماج ELP التحول هو عكسها تحت درجة حرارة انصهار من البروتين. بينما يحددها درجة الحرارة قياس العكر هو وسيلة ممتازة لتوصيف الحرارية من المنتجات الأولية ELP، وتقنيات بديلة، مثل المسح التفاضلي قياس الكالوري (DSC)، ويمكن أيضا أن تستخدم لقياس ELP T _ر.

ELPs مع السلوكيات الحرارية أبنية المعرض أكثر تعقيدا أكثر تعقيدا التي يمكن أيضا أن تتميز درجة الحرارة PROGRAقياس العكر mmed. ELP diblock بوليمرات، على سبيل المثال، تظهر لمحة التعكر مميزة الموافق أثار درجة حرارتها التجميع الذاتي في المذيلات كروية في درجة حرارة micellization الحرجة. لمثل هذه diblock بوليمرات ELP لOD عادة أول يزيد 0.1-0.5 وحدة فوق خط الأساس تشير إلى الانتقال من unimers لالمذيلات، وبعد ذلك زيادة حادة في التطوير التنظيمي (تصل إلى 2.0 وحدة فوق خط الأساس) عند درجة حرارة أعلى يدل على تشكيل ميكرون النطاق المجاميع (الشكل 5A). يتم الحصول على معلومات إضافية حول الذاتي تجميعها الهياكل ELP-تسبب درجة الحرارة مع دائرة الأراضي والمساحة، وهي تقنية الذي يقيس R _H المجالس ELP في الحل. التغييرات في R _H توافق بشكل وثيق مع التغيرات في قياس OD مع قياس العكر (الشكل 5B). unimers ELP عادة يحمل R _H <10 نانومتر بينما الجمعيات جسيمات متناهية الصغر يحمل R _H ~ 20-100 نانومتر والمجاميع يحمل R _H > 500 نانومتر. معلومات إضافية حول الذاتي تجميعها النانوية ELP، مثل تجميع عدد والتشكل، ويمكن الحصول على تشتت الضوء ثابتة أو المبردة المجهر الإلكتروني النافذ ^{17، 23، 29.}

نظرا لو tunability من الخواص الحرارية ELP، يتم الحصول على مجموعة من T _ر ق من خلال التصاميم ELP المختلفة. من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن المتأصلة T _ر ستؤثر على تعظيم الاستفادة من بروتوكول تنقية لكل ELP، حيث منخفضة للغاية أو عالية T _ر ق سيتطلب معظم التعديل في هذا البروتوكول القياسي. ELPs مع درجات حرارة مرتفعة للغاية تمر بمرحلة انتقالية قد تكون غير مناسبة لتنقية مع هذا النهج. إذا كان التصميم من ELPs الرواية والببتيد أو البروتين ELP اندماج قد تعرض للخطر الاستجابة الحرارية للELP، يمكن إدراج علامة بسيطة لتنقية الحامض الاميني البديلة يجمد اللوني تقارب المعادن. بالإضافة إلى ذلك،خصائص تسلسل ELP قد تتطلب تعديل هذا البروتوكول إذا اتهم بقايا ضيف. التلاعب في درجة الحموضة عازلة يمكن استخدامها كوسيلة لتغيير تهمة العام للELP في محاولة للقضاء على التفاعلات مع الملوثات كهرباء ^17. وعلاوة على ذلك، وهذا البروتوكول هو مناسبة لظرف خاص من اندماج ELP مع الببتيدات والبروتينات عند اتخاذ التدابير المناسبة لضمان عملية تنقية لا التشويش على نشاط شاردة تنصهر. مذكرات في جميع أنحاء بروتوكول بشأن هذه التعديلات تعمل على توجيه تنقية ELPs التي قد تقدم هذه التحديات فيما يتعلق تي _تي، تهمة، أو مخاوف الانصهار.

تنقية ELPs عن طريق السلوك LCST بهم يقدم مقاربة بسيطة وخالية من اللوني لتنقية غالبية ELPs والببتيد أو البروتين ELP اندماج المعبر عنها في E. القولونية. بروتوكول تلخيصها هنا يسمح تنقية سو ELPs في يوم واحد باستخدام المعدات التي هي مشتركة بين معظم مختبرات البيولوجيا. سهولة تنقية ELPs واندماج إرادتهم، ونحن نأمل، تشجيع التنوع المتزايد من التصاميم ELP التطبيقات الجديدة في علوم المواد، والتكنولوجيا الحيوية، والطب.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pET-24a(+) pET-25b(+)	Novagen	69749-3 69753-3	T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25).
Ultra BL21 (DE3) competent cells	Edge BioSystems	45363	Competent E. coli for recombinant protein expression.
Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media	MO BIO Laboratories	12105	Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use.
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG)	Gold Biotechnology	I2481C	IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression.
Phosphate buffered saline (PBS) tablet	Calbiochem	524650	These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 °C.
Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v)	MP Biomedicals	195444	PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O.
Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 ml	Thermo Scientific	3138-0050	These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml.
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl)	Thermo Scientific	20491	A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O.
Ready Gel Tris-HCl gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 μl	Bio-Rad Laboratories	161-1105	These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs.
Cupric chloride dihydrate (CuCl2·2H2O)	Fisher Scientific	C454-500	A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCl polyacrylamide gels.
Anotop 10 syringe filter: 0.02 μm 0.1 μm 0.2 μm	Whatman	6809-1002 6809-1012 6809-1022	These 10-mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements.
Millex-HV filter: 0.45 μm	EMD Millipore	SLHVX13NK	These 13-mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements.