عكس النهج الوراثية عن طريق القلب البطيني Morpholino حقن لبالنقل متعددة يصعب الهدف الأنسجة في الزرد اليرقة

Summary

طريقة الوراثية العكسية للتكيف الزرد لتقييم وظيفة الجين خلال مراحل لاحقة من التطور والتوازن الفسيولوجية مثل تجديد الأنسجة باستخدام الحقن داخل البطينات من morpholinos الجينات المحددة.

Abstract

الزرد هو نموذج مهم لفهم الخلية والبيولوجيا الجزيئية من الجهاز وأطرافهم التجدد. ومع ذلك، استراتيجيات لتوظيف الجزيئية وعلم الوراثة العكسية لم يتم تطويرها بشكل كاف لتقييم وظيفة الجين في تجديد أو توازن الأنسجة أثناء مراحل اليرقات بعد مرحلة التطور الجنيني الزرد، والعديد من الأنسجة داخل اليرقة الزرد يصعب استهدافها. الحقن داخل البطينات من morpholinos الجينات المحددة تقدم طريقة بديلة لعدم القدرة الحالية لاستهداف genomically الجينات الزرد في الطريقة التي تسيطر عليها مؤقتا في هذه المراحل. يسمح هذا الأسلوب لتشتت كاملة والتأسيس لاحقة من morpholino في الأنسجة المختلفة في جميع أنحاء الجسم، بما في ذلك الهياكل التي كانت في السابق من المستحيل التوصل إلى مثل تلك الموجودة في الزعنفة الذيلية اليرقات، بنية غالبا ما تستخدم للبحث noninvasively تجديد الأنسجة. وحاضرا أيضا العديد من الجينات تفعيلها خلال اليرقات finfold التجديدر في تجديد الأنسجة الفقاريات الكبار، وبالتالي فإن اليرقة هو نموذجا مفيدا لفهم التجديد في البالغين. يسمح هذا الأسلوب morpholino التشتت لتحديد سريعة وسهلة من الجينات المطلوبة لتجديد أنسجة اليرقات وكذلك الظواهر الفسيولوجية الأخرى التي تنظم توازن الأنسجة بعد مرحلة التطور الجنيني. لذلك، يوفر هذا الأسلوب تسليم استراتيجية حاجة حاليا للسيطرة الزمني لتقييم وظيفة الجين بعد مرحلة التطور الجنيني.

Introduction

تجديد الأجهزة والزوائد المهم بشكل أساسي من أجل البقاء واللياقة البدنية؛ ومع ذلك، العديد من الفقاريات بما في ذلك رجل حدت قدرات التجدد. بينما توجد العديد من النماذج الحيوانية التي لديها القدرة على التجدد واسعة، عكس التقنيات الوراثية لتقييم وظيفة الجين خلال الجهاز وأطرافهم التجديد تبقى محدودة جدا أو غير موجودة. لذا، ثمة حاجة إلى نهج جديد لتشريح البيولوجيا الجزيئية للتجديد في هذه الكائنات الطراز.

الزرد هو نموذج راسخة لفهم الخلية والبيولوجيا الجزيئية من الجهاز وأطرافهم تجديد ^1، وليس فقط بسبب قدرة كبيرة لتجديد أجهزة متعددة والأنسجة والزوائد، ولكن أيضا لأن العديد من خطوط الأسماك المعدلة وراثيا موجودة لتعقب الخلايا و لoverexpress الجينات يبني ^{2، 3.} ومع ذلك، وتثبيط الجينات في الزرد اليرقات يقتصر أساسا إلى overexpression من بنيات المهيمنة على السلبية، والتي ليست متاحة لجميع الجينات في المصالح أو التي يمكن الحصول على مكاسب من وظيفة الآثار التي لا تعكس النشاط الذاتية من الجين المنتج التحوير. وبالتالي، هناك حاجة إلى طريقة بديلة لإزالة تحديدا التعبير الجيني بالضربة القاضية أو ضربة قاضية للتغلب على هذه القضايا.

الجينات المحددة التي تستهدف استخدام TALENS موجود كوسيلة الوراثية العكسية لبالضربة القاضية وظيفة الجين؛ ومع ذلك، فإن هذه الاستراتيجية هو خروج المغلوب محدودة جدا في كثير من الأحيان إلى عمليات تقييم وظيفية خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر، لأن الاحتياجات الأولية من الجين منع المزيد من التقدم من التطور الجنيني. وبالتالي، دراسة الظواهر في وقت لاحق مثل تجديد أو توازن الجهاز بعد التطوير باستخدام TALENS تنتفي صفة ^{4، 5.} وبالتالي، هناك حاجة إلى الجين استراتيجية إزالة البديلة التي تستهدف وظيفة الجين بعد التنمية في وقت مبكر لتقييم متطلبات الجينات في الأجهزة والهياكل تشكيلها بالكامل.

وقد تبين Morpholino الحقن لتكون فعالة في استهداف الجينات في عدد قليل من أجهزة الكبار والكبار تجديد زعنفة ^6-8، ولكن هذه الأساليب تتطلب التثقيب الكهربائي والعديد من الأعضاء الداخلية يصعب ل electroporate إما بسبب موقعها أو بسبب حساسيتها للالكهربائية انقطاع. علاوة على ذلك، بعض الأنسجة في يرقة يصعب حقن مباشر، وذلك لأن الحقن المباشر قد يعطل السلامة الهيكلية أو بسبب حجمها يحد. الزعنفة الذيلية لليرقة واحدة من هذه البنية، لأن الحقن المباشر في finfold غير ممكن. وبالتالي، هناك حاجة إلى بديل لالتثقيب الكهربائي والحقن المباشر لاستهداف الجينات في الأنسجة التي إما أن تكون صغيرة جدا لحقن أو لا يمكن electroporated.

من أجل استهداف وتمنع وظيفة جينات معينة خلال تجديد الزعنفة الذيلية اليرقات، ونحن قد عدلت التقنيات morpholino القائمة السماح لssessment من خلال تجديد وظيفة الجين الزعنفة الذيلية في وقت متأخر من مراحل اليرقة. هذا الأسلوب يعمل داخل البطيني تسليم ⁹ من بين فلوريسئين الموسومة morpholinos جنبا إلى جنب مع إندو بورتر ترنسفكأيشن الكاشف ^10. مرة واحدة في البطين، خليط morpholino-إندو بورتر ينتشر بسرعة في جميع انحاء اليرقة عن طريق الأوعية الدموية ويدخل الأنسجة التي كان من المستحيل سابقا لاستهداف. هذه الطريقة حقن يجوز تعديل لاستهداف الجينات في أنسجة معينة وربما الى حد بعيد يمكن تطبيقها في النماذج الحيوانية الأخرى التي تفتقر حاليا أساليب الوراثية العكسية لتثبيط وظيفة الجينات. وبالتالي، فإنه يوفر طريقة سريعة وسهلة مع إمكانية استخدام مجموعة واسعة لدراسة وظيفة الجين على الفور خلال توازن الجهاز عامة والتجديد في مراحل اليرقات.

Protocol

1. إعداد الإبر الزجاج (الشكل 1)

1. استخدام الزجاج الشعيرات الدموية مع 0.75 مم لإعداد الإبر الحقن (الشكل 1A).
2. وضع الزجاج الشعرية في مجتذب الإبرة وسحب الإبرة مع المعلمة التالية: قيمة دورة التدفئة: 463؛ سحب قيمة دورة: 230؛ السرعة: 150 ميللي ثانية؛ الوقت: 150 ميللي ثانية (الشكل 1B).
3. كسر الزجاج الشعرية سحبت مع ملاقط ساعاتي لإنتاج إبرة قطرها 20 ميكرومتر تحت المجسام مع العدسة ميكرون.
4. استخدام مخرطة مع المبللة عجلة الغزل المطاط لشحذ الإبرة وتنتج 20 ميكرون شطبة (أرقام 1C و1D). ملاحظة: شارب، والإبر مشطوف تحسين سهولة الإدراج في البطين، وبالتالي التقليل من الأضرار التي لحقت الأنسجة والعضلات مثقبة تسمح لختم بعد إزالة الإبرة (أرقام 1E-G).

2. Preparأوجه من الحل Morpholino

1. إعداد الأسهم morpholino عن طريق إذابة morpholino مجفف بالتجميد في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى تركيز النهائي من 7.5 ملم. [راجع إرشادات الشركة المصنعة للحصول على التفاصيل (الجدول مواد)].
2. إعداد الحل الحقن morpholino عن طريق خلط 2.5 ميكرولتر حل الأسهم morpholino (7.5 ملم) مع 2.8 ميكرولتر إندو بورتر محلول المخزون (1 ملم) (انظر الجدول مواد) لتركيز النهائي من 3.5 ملم و 0.5 ملم morpholino إندو بورتر.

3. إعداد حقن Morpholino (الشكل 2)

1. تحميل إبرة الزجاج مشطوف مع 5 ميكرولتر من هذا الحل باستخدام micropipette مع 10 ميكرولتر ماصة microloader طرف.
2. ادخال الإبرة الزجاج في ماسك الإبرة من مياداة مجهرية متصلة مضخة هوائية بيكو (أرقام 2A-C).
3. وضع حامل إبرة بجانب المجهر بحيث الإبرة الاحتياجات فقطيمكن نقلها في اتجاه واحد إلى مستو أدخله في البطين في القلب من اليرقة (الشكل 2A).
4. ضبط زاوية للحقن بنحو 45 درجة.
5. تعيين قيم microinjector على النحو التالي: عقد الضغط: 20 £ لكل بوصة مربعة (رطل)؛ طرد الضغط: 15 رطل؛ 100 ميللي ثانية مجموعة من تبوب، قيمة الفترة من 1.9 (10.9 ميللي ثانية يناظر).
6. تذوب الاغاروز في برنامج تلفزيوني 1X باستخدام الميكروويف القياسية لإنتاج 20 مل من 1.5٪ (ث / ت) هلام. صب جل ذاب في طبق بتري 10 سم. وضع شكل حقن مخدد في الاغاروز دافئ حتى أنه بمجرد صلابة، فإن الاغاروز يكون الأخاديد التي سيتم وضعها اليرقة مخدرا ¹¹ (2D و 2E أرقام).

4. حقن (الشكل 3)

1. تخدير اليرقات في 100 مل من الماء الحوض مع 20 ملغ / لتر تريكين (L-إيثيل-M-الأمينية بنزوات الميثان سلفونات) حتى يتوقف عن الاستجابة للمس.
2. استخدام البلاستيك باستور pipettه لنقل بعناية اليرقة مخدرا في أخدود من العفن الرطب الاغاروز بحيث الجانب البطني تواجه ضد الجدار الاغاروز العمودي للأخدود (الشكل 3A).
3. وضع لوحة الاغاروز تحت stereomicroscope بحيث البطين تواجه بعيدا عن إبرة الحقن (الشكل 3A).
4. خفض الإبرة إلى أدخله في البطين في القلب. ادخال الإبرة فقط 1-2 ميكرون إلى البطين مع الحرص على عدم ادخال الإبرة عميقا جدا (أرقام 3B و 3C).
5. مرة واحدة يتم إدخال الإبرة، وضخ الحل morpholino إلى البطين مع 4-6 والبقول، وتقديم كل NL 3 من الحل، مع انتظار فترات السماح المقاصة من القلب (أرقام 3D و 3E).
6. بعد الحقن، وإزالة الإبرة (موازية لطائرة من الإدراج) ومن ثم نقل بعناية اليرقة باستخدام ماصة باستور بلاستيكية مملوءة E3 المتوسطة البكالورياك في طبق بتري تحتوي المتوسطة E3 الطازجة.
7. وضع إبرة في طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني 1X لمنع جفاف الإبرة عند نقل اليرقة حقن.
8. كرر الخطوات من 4،1-4،6 كل 12-24 ساعة لمدة التجربة. ملاحظة: تكرار الحقن يضمن امتصاص وصيانة morpholino في الخلايا.

5. تحليلات حقن (الشكل 4)

1. تخدير الأسماك في 100 مل من الماء الحوض مع 20 ملغ / لتر تريكين حتى يتوقف عن الاستجابة للمس.
2. وضع اليرقة أفقيا على شقة الرطب 1.5٪ (ث / ت) لوحة الاغاروز مغطاة E3 المتوسطة.
3. اليرقات الصورة باستخدام stereomicroscope مع brightfield والتصوير مضان. ملاحظة: كما أن اليرقات شفافة، ينبغي أن يكون morpholino فلوريسئين الموسومة مرئية كما الفلورية الخضراء في الأوعية الدموية في جميع أنحاء الحيوان مباشرة بعد الحقن. وهذا مضان مزيد من تفريق إلى الأنسجة عن طريق أوعية دموية15 دقيقة (أرقام 4A-4C).

6. تقييم التجديدي ثمرة

1. تقييم الصور الملتقطة باستخدام فيجي صورة J البرمجيات الحرة (http://fiji.sc/Fiji). للتحقيق في التجديد، واستخدام أداة تتبع خط لتحديد مقدار النمو التجديدي الذي طرأ على السيطرة وحقن morpholino اليرقة.
2. لمعايرة الصور، فتح أحد ملفات الصور الأصلية في فيجي عن طريق سحب وإسقاط الملفات في إطار فيجي الرئيسي.
3. لتعيين نطاق لجميع الصور التالية، انتقل إلى "تحليل" في القائمة الرئيسية.
4. في القائمة المنسدلة انقر على "نطاق محدد".
5. في هذا الإطار، بدوره على "جلوبل" الخيار بالضغط على خانة الاختيار.
6. الآن فتح الصورة لقياس مقدار النمو التجدد مرة أخرى عن طريق السحب والإسقاط (انظر الخطوة 6.1).
7. اختيار "التحديدات مرفوعة" أداة في شريط الأدوات.
8. تطويق المنطقة المراد قياسها (فايgures 4J-4L).
9. اضغط على Ctrl + M. وهذا فتح جديد "نتائج" نافذة تظهر قيمة المنطقة المحاصرة في مربع بكسل.

النتائج

يتم وضع حاد، مشطوف حقن الإبرة بسهولة في البطين في القلب من اليرقة الزرد عندما اقترب ظهريا (الشكل 3A). قلب يستمر الضخ ويتم الاحتفاظ تدفق الدم رغم وجود إبرة (أرقام 3B و 3C). الحقن الدقيق لا يعطل التشكل من البطين أو تقلصات القلب (الشكل 3D) عل...

Discussion

يوفر حقن داخل البطيني طريقة تقييم سريع وموثوق بها لاختبار وظيفة الجين في مراحل لاحقة من التطور أو من التوازن الجسم دون التأثير على وظيفة الجين خلال مرحلة التطور الجنيني. لضمان نجاح هذه التقنية، ينبغي للمرء أن يكون على بينة من أربع نقاط هامة: 1) حجم الإبرة، 2) التجفيف من...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Morpholino with 3´fluorescein tag	Gene Tools Inc.	Customized	More information at www.gene-tools.com
Endo-Porter	Gene Tools Inc.		More information at www.gene-tools.com
Agarose	Serva	120623	For pouring plates to place the fish during injections and imaging
Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate)	Applichem		For anesthesia
E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4)			For larval husbandry
Petri Dishes	Sarstedt	821.472	For placing the fish during injections and imaging
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-3	For preparing injection needles
Microloader pipette tips	Eppendorf	5,242,956,003	For loading the needle
Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml)	Brand	747760/ 74775	For transfering larva
Flaming/Brown needle puller	Sutter		More information at www.sutter.com
Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5)	World Precision Instruments, Inc.	501985	To brake the needle before sharpening
Dissecting microscope	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	Part of the whole injection setup
Fluorescence camera	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	To image the fluorescence after injeciton
PicoNozzle kit (microinjector holder)	World Precision Instruments	5430-12	For microinjections
Pneumatic PicoPump (microinjector)	World Precision Instruments	SYS-PV820	For microinjections