Rückwärts Genetische Morpholino Ansatz mit Herz ventrikuläre Injektion auf mehrere Schwer zu Zielgeweben in der Zebrafisch-Larve Transfektion

Zusammenfassung

Ein anpassungsfähiges reversen genetischen Methode für Zebrafisch-Gen-Funktion während der späteren Phasen der Entwicklung und physiologischen Homöostase wie Geweberegeneration unter Verwendung intraventrikuläre Injektion von Gen-spezifischen morpholinos beurteilen.

Zusammenfassung

Der Zebrafisch ist ein wichtiges Modell, um die Zell-und Molekularbiologie der Organ-und Anhängsel Regeneration zu verstehen. Allerdings molekularen Strategien zur reversen Genetik beschäftigen haben noch nicht ausreichend entwickelt, um Gen-Funktion bei der Regeneration oder Gewebe-Homöostase während der Larvenstadien nach Zebrafischembryogenese zu bewerten und mehrere Gewebe innerhalb des Zebrafisch-Larve sind schwer zu zielen. Intraventrikuläre Injektion von genspezifischen Morpholinos bieten ein alternatives Verfahren für die aktuelle Unfähigkeit genomisch Zielzebrafisch-Gene in einer zeitlich gesteuerten Weise in diesen Phasen. Dieses Verfahren ermöglicht eine vollständige Dispersion und anschließende Einarbeitung des Morpholino in verschiedenen Geweben im ganzen Körper, einschließlich Strukturen, die bisher unmöglich zu erreichen, wie sie im Larvenschwanzflosse, eine Struktur oft verwendet, um nicht-invasiv zu erforschen Geweberegeneration waren. Mehrere Gene während der Larven finfold Regeneration aktiviert werden auch Präsentationt bei der Regeneration von Geweben erwachsener Wirbeltiere, so dass die Larve ist ein nützliches Modell, um die Regeneration bei Erwachsenen zu verstehen. Diese Morpholino Dispersionsmethode erlaubt die schnelle und einfache Identifizierung von Genen, die für die Regeneration von Gewebe Larven sowie anderen physiologischen Erscheinungen regulieren Gewebshomöostase nach Embryogenese erforderlich. Daher stellt diese Methode ein Liefer aktuell benötigten Strategie zur zeitlichen Steuerung der Auswertung von Genfunktionen nach Embryogenese.

Einleitung

Regeneration von Organen und Anhängsel ist grundlegend wichtig für das Überleben und Fitness; jedoch haben mehrere Wirbeltieren einschließlich des Menschen regenerative Fähigkeiten beschränkt. Während mehreren Tiermodellen existieren, die umfangreichen Regenerationsfähigkeit haben, Reverse genetische Techniken, um Gen-Funktion während der Organregeneration und Anhängsel zu beurteilen sind sehr begrenzt oder gar nicht vorhanden. Daher sind neue Methoden erforderlich, um die Molekularbiologie der Regeneration in diesen Modellorganismen zu sezieren.

Der Zebrafisch ist ein gut etabliertes Modell für das Verständnis der Zell-und Molekularbiologie der Organregeneration und ^ein Anhängsel, nicht nur wegen ihrer großen Fähigkeit, mehrere Organe, Gewebe und Anhängsel zu regenerieren, sondern auch, weil mehrere transgene Fische Linien existieren, um Zellen zu verfolgen und Gen-Konstrukte überexprimieren ^{2, 3.} Allerdings ist Gen-Hemmung in Zebrafisch-Larven hauptsächlich auf die overexpre begrenztssion der dominant-negative Konstrukte, die nicht für alle Gene von Interesse sind oder deren Transgen Produkt kann gain-of-function-Effekte, die die endogene Aktivität des Gens spiegeln nicht erwerben. Somit wird eine alternative Methode, um speziell zu entfernen Genexpression durch KO oder Zuschlags notwendig, um diese Probleme zu überwinden.

Gen-spezifischen Targeting mit TALENS als Reverse genetische Mittel, um Gen-Knockout-Funktion besteht; Dies ist jedoch Knockout Strategie während der frühen Embryogenese sehr häufig zu funktionellen Beurteilungen, da ursprünglichen Anforderungen des Gens zu verhindern weiteren Verlauf der Embryonalentwicklung. So, das Studium später Phänomene wie Regeneration oder Organ Homöostase nach der Entwicklung mit TALENS ausgeschlossen ^{4, 5.} Daher ist eine alternative Strategie zum Entfernen Gen benötigt, die Gen-Funktion richtet sich nach der frühen Entwicklung bis zur Gen-Anforderungen voll ausgebildete Organe und Strukturen zu beurteilen.

Morpholino-Injektion wurde als wirksam bei der Targeting-Gene in einigen adulten Organen und der Erwachsenen Regenerieren Rippen ^6-8, aber diese Methoden erfordern Elektroporation und viele innere Organe schwer zu elektroporieren entweder aufgrund ihrer Lage oder wegen ihrer Empfindlichkeit gegenüber elektrischen Störung. Darüber hinaus sind einige Gewebe in der Larve schwer direkt zu injizieren, da eine direkte Injektion kann ihre strukturelle Integrität stören oder weil ihre Größe ist die Begrenzung. Die Schwanzflosse der Larve ist eine solche Struktur, da eine direkte Injektion in die finfold ist nicht möglich. Somit eine Alternative zur Elektroporation und direkte Injektion erforderlich war, um Gene in Geweben, die entweder zu klein oder zu injizieren kann elektroporiert werden Ziel.

Um während der Regeneration des Larvenschwanzflosse Ziel und hemmen die Funktion von spezifischen Genen haben wir Morpholino bestehenden Technologien erlauben die eine modifizierteEURTEILUNG der Gen-Funktion während der Schwanzflosse Regeneration in der späten inszeniert Larve. Dieses Verfahren verwendet intraventrikuläre Liefer ⁹ von Fluorescein-markierten morpholinos zusammen mit Endo-Porter Transfektionsreagenz ^10. Sobald im Ventrikel, schnell der Morpholino-Endo-Porter Mischung während der Larve über das Gefäßsystem verteilt und tritt Gewebe, die bisher nicht zum Ziel gewesen. Diese Injektionsverfahren kann modifiziert werden, um Zielgene in spezifischen Geweben und möglicherweise auch in anderen Tiermodellen, die gegenwärtig nicht reversen genetischen Methoden Genfunktion hemmen angewendet werden. So bietet es eine schnelle und einfache Methode mit dem Potenzial für eine breite Palette verwenden, um Gen-Funktion sofort studieren während der allgemeinen Organ-Homöostase und Regeneration bei Larvenstadien.

Protokoll

1. Herstellung der Glas-Nadeln (Abbildung 1)

1. Verwenden Glaskapillaren mit einem Durchmesser von 0,75 mm bis Injektionsnadeln (Abbildung 1A) vorzubereiten.
2. Legen Sie die Glaskapillare in eine Nadel Zieher und ziehen Sie die Nadel mit dem folgenden Parameter: Heizung Zykluswert: 463; Ziehen Zykluswert: 230; Geschwindigkeit: 150 ms; Zeit: 150 ms (Fig. 1B).
3. Brechen Sie das Glas gezogen Kapillare mit Uhrmacher-Pinzette, eine Nadel Durchmesser 20 um unter einem Stereoskop mit einem Mikrometer-Okular zu produzieren.
4. Verwenden Sie eine Drehbank mit einem angefeuchteten Gummi Spinnrad, um die Nadel zu schärfen und produzieren ein 20 um Fase (1C und 1D). Hinweis: Sharp, abgeschrägten Nadeln Verbesserung der Leichtigkeit des Einsetzens in die Herzkammer und damit Minimierung der Schädigung des Gewebes und damit die Loch Muskel nach dem Entfernen der Nadel (Fig. 1E-G) wieder zu verschließen.

2. Preparation der Morpholino-Lösung

1. Bereiten Sie die Morpholino Lager durch Auflösen des lyophilisierten Morpholino in 1x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einer Endkonzentration von 7,5 mM. [Siehe Anweisungen des Herstellers für Details (Material Tabelle)].
2. Bereiten Sie die Morpholino Injektionslösung durch Mischen von 2,5 ul Morpholin-Stammlösung (7,5 mM) mit 2,8 ul Endo-Porter-Stammlösung (1 mM) (Siehe Tabelle Materialien) für eine endgültige Konzentration von 3,5 mM und 0,5 mM Morpholino Endo-Porter.

3. Herstellung der Morpholino-Injektion (Fig. 2)

1. Laden Sie die abgeschrägte Glas Nadel mit 5 ul dieser Lösung mit einer Mikropipette mit einem 10 ul Microloader Pipettenspitze.
2. Einfügen der Glas Nadel in den Nadelhalter des Mikromanipulators mit dem pneumatischen pico Pumpe (Fig. 2A-C) verbunden ist.
3. Platzieren des Nadelhalters neben dem Mikroskop, so daß die Nadel nur Bedürfnissenin einer planaren Richtung bewegt werden, um in die Herzkammer der Larve (2A) einzufügen.
4. Einstellen des Winkels für die Injektionen bei 45 °.
5. Stellen Sie die Mikroinjektor Werte wie folgt: Haltedruck: 20 Pfund pro Quadratzoll (psi); Ausstoßdruck: 15 psi; 100 ms Bereich von Gating, Periodenwert von 1,9 (entspricht 10,9 ms).
6. Schmelz Agarose in 1x PBS unter Verwendung eines Standard-Mikrowellen zu 20 ml einer 1,5% (w / v) Gel zu erzeugen. Gießen geschmolzenen Gel in eine 10 cm-Petrischale. Legen Sie eine gerillte Form der Injektion in die warme Agarose, so dass einmal ausgehärtet, wird die Agarose-Furchen, in denen die Larve sediert platziert werden ¹¹ (Figuren 2D und 2E) haben.

4. Injektionen (Fig. 3)

1. Anesthetize Larve in 100 ml Aquarienwasser mit 20 mg / L Tricaine (L-Ethyl-m-Amino-benzoat-Methan-Sulfonat), bis sie reagiert auf Berührung.
2. Mit einem Kunststoff Pasteur pipette, um die Larve sediert transferieren in eine Nut des nassen Agarose-Form, so dass die Bauchseite zugewandt ist gegen die vertikale Agarose Wand der Nut (3A).
3. Platzieren der Agarose Platte unter dem Stereomikroskop, so daß die Herzkammer abgewandt ist die Injektionsnadel (Fig. 3A).
4. Senken Sie die Nadel, um sie in der Herzkammer einfügen. Führen Sie die Nadel nur 1-2 um in die Herzkammer kümmert sich nicht um die Nadel zu tief (3B und 3C) einfügen.
5. Sobald die Nadel eingeführt ist, spritzen die Morpholino-Lösung in die Kammer mit 4-6 Pulse, jeder, die 3 nl der Lösung mit Warteintervalle Lichtung des Herzens (Fig. 3D und 3E) zu ermöglichen.
6. Nach der Injektion die Nadel entfernen (parallel zur Ebene der Insertion) und dann sorgfältig übertragen die Larven mit einem Kunststoff-Pasteur-Pipette mit E3 Medium gefüllt back in eine Petrischale mit frischen E3-Medium.
7. Platzieren der Nadel in eine Petrischale mit 1x PBS, um das Trocknen der Nadel zu verhindern, wenn die Übertragung der Larven injiziert.
8. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.6 jede 12-24 h für die Dauer des Experiments. Hinweis: Wiederholen der Injektionen gewährleistet die Aufnahme und Aufrechterhaltung der Morpholino in Zellen.

5. Analysen Injektionen (Fig. 4)

1. Anesthetize die Fische im Aquarium 100 ml Wasser mit 20 mg / L Tricaine, bis sie reagiert auf Berührung.
2. Legen Sie die Larve seitlich auf einer flachen nassen 1,5% (w / v) Agarose-Platte mit E3 Medium bedeckt.
3. Bild Larven mit einem Stereomikroskop mit Hellfeld-und Fluoreszenzbildgebung. Hinweis: Da die Larven durchsichtig sind, sollte der Fluorescein-markierten Morpholino als fluoreszierende grün in den Blutgefäßen im gesamten Tier direkt nach der Injektion sichtbar sein. Diese Fluoreszenz wird weiter in die vaskularisierten Geweben zerstreuen durch15 min (in den 4A-4C).

6. Beurteilung der Regenerative Outgrowth

1. Bewerten Sie die aufgenommenen Bilder mit Fiji Bild J freie Software (http://fiji.sc/Fiji). Zur Untersuchung der Regeneration, verwenden Sie die Line-Tracing-Tool, um die Menge der regenerativen Wachstum, das auf Kontrolle und Morpholino-injizierten Larve tretenen bestimmen.
2. Um Bilder zu kalibrieren, öffnen Sie eine der Original-Bilddateien in Fidschi durch Drag & Drop die Datei in das Hauptfenster Fidschi.
3. Um den Maßstab für alle folgenden Bilder einzustellen, gehen Sie auf "Analysieren" im Hauptmenü.
4. In der Drop-Down-Menü klicken Sie auf "Set scale".
5. In diesem Fenster aktivieren Sie die Option "Global", indem Sie das Kontrollkästchen.
6. Nun öffnen Sie das Bild, um die Menge der regenerativen Wachstum wieder per Drag & Drop (siehe Schritt 6.1) zu messen.
7. Wählen Sie die "Freihand-Auswahl"-Werkzeug in der Werkzeugleiste.
8. Umkreisen Sie die zu messenden Bereich (Figures 4J-4L).
9. Drücken Sie Strg + M. Damit wird ein neues Fenster "Ergebnisse", die den Wert des eingekreisten Bereichs in quadratischen Pixeln zu öffnen.

Ergebnisse

Die scharfe, abgeschrägte Injektionsnadel wird einfach in die Herzkammer des Zebrafisch-Larve platziert, wenn dorsal angefahren (3A). Das Herz pumpt weiter und trotz der Anwesenheit der Nadel (3B und 3C) Blutstrom aufrechterhalten wird. Vorsichtig Injektionen nicht stören die Morphologie der Herzkammer oder der Herzkontraktionen (Fig. 3D), trotz der Injektion des Morpholino in das Herz (Fig. 3E).

Innerhalb...

Diskussion

Die intraventrikuläre Injektion bietet eine schnelle und zuverlässige Beurteilung Verfahren zur Prüfung der Genfunktion in späteren Phasen der Entwicklung oder der Homöostase des Körpers, ohne die Gen-Funktion während der Embryogenese. Um den Erfolg dieser Technik zu gewährleisten, sollte man sich bewusst sein, vier kritische Punkte: 1) Nadel, 2) Trocknen aus der Nadel, 3) zu minimieren Volumen und 4) minimale Belichtungszeit in der Sedierung Lösung. Nadeln, die zu klein sind, werden häufig verstopfen, währen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Morpholino with 3´fluorescein tag	Gene Tools Inc.	Customized	More information at www.gene-tools.com
Endo-Porter	Gene Tools Inc.		More information at www.gene-tools.com
Agarose	Serva	120623	For pouring plates to place the fish during injections and imaging
Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate)	Applichem		For anesthesia
E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4)			For larval husbandry
Petri Dishes	Sarstedt	821.472	For placing the fish during injections and imaging
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-3	For preparing injection needles
Microloader pipette tips	Eppendorf	5,242,956,003	For loading the needle
Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml)	Brand	747760/ 74775	For transfering larva
Flaming/Brown needle puller	Sutter		More information at www.sutter.com
Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5)	World Precision Instruments, Inc.	501985	To brake the needle before sharpening
Dissecting microscope	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	Part of the whole injection setup
Fluorescence camera	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	To image the fluorescence after injeciton
PicoNozzle kit (microinjector holder)	World Precision Instruments	5430-12	For microinjections
Pneumatic PicoPump (microinjector)	World Precision Instruments	SYS-PV820	For microinjections