הפוך גישת morpholino גנטית באמצעות הזרקת לב חדרית לtransfect רקמות קשה ליעד מרובים בזחל דג הזברה

Summary

שיטה להתאמה הפוכה גנטית לדג זברה כדי להעריך את תפקוד גן בשלבים מאוחר יותר של התפתחות והומאוסטזיס פיסיולוגי כגון התחדשות רקמות באמצעות זריקות תוך חדרי של morpholinos גן ספציפי.

Abstract

דג הזברה הוא מודל חשוב להבין את התא וביולוגיה מולקולרית של איבר והתחדשות סרח. עם זאת, אסטרטגיות מולקולריות להעסיק גנטיקה הפוכה עדיין לא פותחו במידה מספקת כדי להעריך את תפקוד גן בהתחדשות או הומאוסטזיס רקמות בשלבי זחל אחרי עובר דג הזברה, וכמה רקמות בתוך זחל דג הזברה הן קשות להתמקד. זריקות תוך חדרי של morpholinos גן ספציפי להציע שיטה חלופית לחוסר היכולת הנוכחית למקד genomically גנים דג הזברה באופן temporally מבוקר בשלבים האלה. שיטה זו מאפשרת לפיזור מלא ושילוב הבא של morpholino לרקמות שונות בגוף, כוללים מבנים שהיו בעבר בלתי אפשריים להגיע כגון אלה בסנפיר הזנב הזחל, מבנה המשמש לעתים קרובות כדי לחקור התחדשות רקמות noninvasively. מספר גנים מופעלים במהלך רגנרציה finfold זחל גם presenלא בהתחדשות רקמות חוליות מבוגרים, ולכן הזחל הוא מודל שימושי כדי להבין התחדשות במבוגרים. שיטת פיזור morpholino זה מאפשרת זיהוי קל ומהיר של גנים הנדרשים להתחדשות של רקמות זחל כמו גם תופעות פיסיולוגיות אחרות המסדירות הומאוסטזיס רקמות אחרי העובר. לכן, שיטת מסירה זו מספקת אסטרטגיה דרושה כעת לשליטה זמנית להערכה של תפקוד גן אחרי העובר.

Introduction

התחדשות של איברים ואיברים חשובה ביסודו להישרדות ולכושר; עם זאת, כמה בעלי חוליות, כולל אדם יש יכולת מוגבלת רגנרטיבית. בעוד כמה מודלים של בעלי החיים קיימים שיש להם יכולת התחדשות נרחבת, להפוך טכניקות גנטיות על מנת להעריך את תפקוד גן באיברים והתחדשות סרח יישאר מוגבל מאוד או לא קיימים. לכן, גישות חדשות נדרשות כדי לנתח את הביולוגיה המולקולרית של התחדשות באורגניזמים המודל הבאים.

דג הזברה היא מודל מבוסס היטב להבנת התא וביולוגיה מולקולרית של איבר ואיבר התחדשות ^1, לא רק בגלל היכולת שלו המשמעותית להתחדש איברים מרובים, רקמות ואיברים, אלא גם משום שכמה קווי דגים מהונדסים קיימים כדי לעקוב אחר תאים ו לביטוי יתר גן בונה ^{2, 3.} עם זאת, עיכוב גן בדג זברת זחל מוגבל בעיקר לoverexpression של מבנים דומיננטיים שליליים, שאינם זמינים לכל הגנים של עניין או transgene שהמוצר יכול לרכוש השפעות לזכות-of-פונקציה שאינו משקפות את פעילות אנדוגני של הגן. לפיכך, יש צורך בשיטה חלופית כדי להסיר ביטוי גנים ספציפי בנוקאאוט או מציאה כדי להתגבר על בעיות אלה.

גן ספציפי מיקוד באמצעות TALENS קיים כאמצעי גנטי הפוך למפסיד יוצא, תפקוד גן; עם זאת, אסטרטגית נוקאאוט הזה היא לעתים קרובות מאוד מוגבל להערכות תפקודיות בעובר מוקדם, כי דרישות ראשוניות של הגן למנוע התקדמות נוספת של התפתחות עוברית. לפיכך, חקר תופעות מאוחר יותר כגון התחדשות או הומאוסטזיס איברים לאחר פיתוח באמצעות TALENS מנועה ^{4, 5.} לכן, יש צורך באסטרטגית הסרת גן חלופית, כי מטרות תפקוד גן אחרי התפתחות מוקדמת להעריך את הדרישות של גנים באיברים ומבנים שהוקמו באופן מלא.

Morpholino הזרקה הוכח כיעילה במיקוד גנים בכמה איברים בוגרים והמבוגרים התחדשות ^6-8 סנפיר, אך שיטות אלו דורשות electroporation ורבים איברים פנימיים קשים electroporate או בשל מיקומם או בשל רגישותם לחשמלית הפרעה. יתר על כן, כמה רקמות בזחל קשות להזריק ישירות, כי הזרקה ישירה עלולה לשבש את השלמות המבנית שלהם או בגלל הגודל שלהם הוא מגבילה. סנפיר הזנב של הזחל הוא מבנה אחד כזה, כי הזרקה ישירה לתוך finfold אינה אפשרית. לפיכך, חלופה לelectroporation והזרקה ישירה הייתה צורך למקד גנים ברקמות שגם הם קטנים מדי כדי להזריק או שלא ניתן electroporated.

על מנת למקד ומעכבים את הפונקציה של גנים ספציפיים במהלך ההתחדשות של סנפיר הזנב הזחל, יש לנו שונה בטכנולוגיות קיימות מאפשר morpholinossessment של תפקוד הגן במהלך רגנרציה של סנפיר הזנב בזחל מבוים המאוחר. שיטה זו מעסיקה משלוח תוך חדרי ⁹ של morpholinos העמסה-מתויג יחד עם מגיב transfection Endo-פורטר ^10. פעם אחת בחדר, את תערובת morpholino-Endo-פורטר מתפשטת במהירות ברחבי הזחל דרך כלי הדם ונכנסה רקמות שהיו בלתי אפשרי בעבר להתמקד. שיטת הזרקה זו עשויה להיות שונה כדי למקד גנים ברקמות ספציפיות וייתכן בהחלט ניתן ליישם במודלים של בעלי חיים אחרים, כי כרגע אין לי שיטות גנטיות הפוכה כדי לעכב את תפקוד גן. לכן, היא מציעה שיטה מהירה וקלה עם הפוטנציאל לשימוש מגוון רחב ללמוד באופן מיידי את תפקוד גן במהלך הומאוסטזיס כללי איבר והתחדשות בשלבי זחל.

Protocol

1. הכנת מחטי הזכוכית (איור 1)

1. השתמש בנימי זכוכית בקוטר 0.75 מ"מ להכין מחטי הזרקה (איור 1 א).
2. הנח את נימי הזכוכית לתוך חולץ מחט ולמשוך את המחט עם הפרמטר הבא: ערך מחזור חימום: 463; משיכת ערך מחזור: 230; מהירות: 150 אלפיות השניים; זמן: 150 אלפיות שני (איור 1).
3. לשבור את זכוכית משך נימים עם פינצטה שען כדי לייצר מחט בקוטר 20 מיקרומטר תחת stereoscope עם עינית מיקרומטר.
4. השתמש מחרטה עם גלגל מסתובב גומי רטוב כדי לחדד את המחט ולייצר 20 מיקרומטר הטיה (1C דמויות ו1D). הערה: שארפ, מחטים משופעות לשפר את הקלות של כניסה לתוך החדר ובכך למזער את הנזק לרקמות ולאפשר לשרירים המחוררים כדי לחתום מחדש לאחר הסרת המחט (איורים 1E-G).

2. Preparע פתרון morpholino

1. הכן את מניית morpholino ידי המסת morpholino lyophilized ב1x פוספט שנאגר מלוח (PBS) לריכוז סופי של 7.5 מ"מ. [ראה את הוראות יצרן לפרטים (טבלת חומרים)].
2. הכן את פתרון הזרקת morpholino על ידי ערבוב של פתרון מניות morpholino 2.5 μl (7.5 מ"מ) עם פתרון 2.8 μl Endo-פורטר המניה (1 מ"מ) (ראה טבלת חומרים) לריכוז סופי של 3.5 morpholino מ"מ ו0.5 מ"מ Endo-פורטר.

3. הכנת הזרקת morpholino (איור 2)

1. טען את מחט זכוכית המשופעת עם 5 μl של פתרון זה באמצעות micropipette עם קצה פיפטה microloader 10 μl.
2. הכנס את מחט הזכוכית לתוך מחזיק המחט של micromanipulator מחובר למשאבת פיק פנאומטי (איורים 2A-C).
3. הנח את בעל המחט ליד מיקרוסקופ כך מחט הצרכים רקכדי להתרגש בכיוון מישוריים אחד להכניס אותו לתוך חדר הלב של הזחל (איור 2 א).
4. כוון את הזווית לזריקות ב-45 °.
5. הגדר את ערכי microinjector כדלקמן: לחץ אחיזה: 20 פאונד לאינץ' המרובע (psi); לחץ פליטה: 15 psi; 100 מגוון אלפיות של gating, ערך תקופה של 1.9 (מתאים ל10.9 אלפית שני).
6. להמס agarose ב 1x PBS באמצעות מיקרוגל סטנדרטי לייצר 20 מיליליטר של 1.5% (w / v) ג'ל. יוצקים ג'ל נמס לתוך צלחת פטרי 10 סנטימטר. הנח צורת הזרקת מחורץ לagarose החם, כך שפעם אחת קשוח, agarose יהיה תלמים שבזחל המסוממים יוצב ¹¹ (2D דמויות ו2E).

4. זריקות (איור 3)

1. הרדימי זחל במי אקווריום 100 מיליליטר עם 20 tricaine מ"ג / ליטר (sulfonate L-אתיל-M-אמינו-נזואט מתאן), עד שהם יפסיקו להגיב למגע.
2. השתמש pipett פסטר מפלסטיקדואר להעביר בזהירות את הזחל מסומם לתוך חריץ של עובש agarose הרטוב, כך שהצד הגחוני פונה אל קיר agarose האנכי של הגרוב (איור 3 א).
3. מניחים את צלחת agarose תחת סטראו כך שהחדר הוא מול מן מחט הזריקה (איור 3 א).
4. מנמיכים את המחט להכניס אותו לתוך חדר הלב. הכנס את המחט רק 1-2 מיקרומטר לתוך החדר נזהר שלא להכניס את המחט עמוקה מדי (3B דמויות ו3 ג).
5. ברגע שהמחט מוחדרת, להזריק את פתרון morpholino לתוך החדר עם 4-6 קטניות, כל 3 NL אספקת של הפתרון, עם מחכה מרווחים כדי לאפשר סליקה של הלב (3D דמויות ו3E).
6. לאחר הזרקה, להוציא את המחט (במקביל למישור של הכנסה) ולאחר מכן להעביר בזהירות את הזחל בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק מלא בbac הבינוני E3k לתוך צלחת פטרי המכילה בינוני E3 טרי.
7. מניחים את המחט לתוך צלחת פטרי המכילה 1x PBS כדי למנוע הייבוש של המחט בעת העברת הזחל המוזרק.
8. חזור על שלבים 4.1-4.6 כל שעה 12-24 לתקופת הניסוי. הערה: חזרה על הזריקות מבטיחה הספיגה ותחזוקה של morpholino בתאים.

5. ניתוח של זריקות (איור 4)

1. להרדים את הדגים באקווריום של מים 100 מיליליטר עם 20 tricaine מ"ג / ליטר עד שהם יפסיקו להגיב למגע.
2. מניחים את הזחל רוחבי על 1.5% רטובים שטוחים (w / v) agarose צלחת מכוסה במדיום E3.
3. זחלי תמונה באמצעות סטראו עם brightfield ודימות פלואורסצנטי. הערה: כפי שהזחלים הם שקופים, morpholino מתויג והעמסת צריך להיות גלוי כמו ירוק ניאון בכלי דם בכל בעלי החיים באופן ישיר לאחר הזרקה. הקרינה זו תתפזר יותר לתוך רקמות vascularized ידי15 דקות (איורים 4 א-4C).

6. הערכת הרגנרציה תולדה

1. להעריך תמונות שנתפסו באמצעות תוכנת פיג'י תמונת J בחינם (http://fiji.sc/Fiji). לחקירת התחדשות, השתמש בכלי מעקב אונליין כדי לקבוע את הכמות של צמיחת התחדשות שחלה על שליטה וזחל הזריק morpholino.
2. לכייל תמונות, פתח את אחד קבצי תמונה המקוריים בפיג'י על ידי גרירה ושחרור של הקובץ לתוך חלון פיג'י הראשי.
3. כדי להגדיר את קנה המידה לכל התמונות הבאות, ללכת על "נתח" בתפריט הראשי.
4. בנפתח לחץ על תפריט "סולם הגדר".
5. בחלון זה, להפעיל את האפשרות "הגלובלית" על ידי לחיצה על תיבת הסימון.
6. עכשיו לפתוח את התמונה כדי למדוד את הכמות של צמיחת משובי שוב על ידי גרירה ושחרור (ראה שלב 6.1).
7. בחר באפשרות "בחירות חופשי" בסרגל הכלים.
8. מקיף את האזור כדי להימדד (Figures 4J-4L).
9. לחץ על Ctrl + M. הפעולה זו תפתח חלון חדש "תוצאות" המציג את ערכו של השטח מוקף בפיקסלים מרובעים.

תוצאות

המחט החדה, משופעת ההזרקה ממוקמת בקלות בחדר הלב של זחל דג הזברה כאשר ניגש dorsally (איור 3 א). הלב ממשיך לשאוב ונשמרת זרימת דם למרות נוכחותם של המחט (3B דמויות ו3 ג). זריקות להיזהר לא לשבש את המורפולוגיה של החדר או התכווצויות לב (איור 3D) למרות הזרקה של...

Discussion

ההזרקה תוך חדרי מספקת שיטת הערכה מהירה ואמינה לבדיקת תפקוד גן בשלבים מאוחר יותר של התפתחות או של הומאוסטזיס גוף מבלי להשפיע על תפקוד הגן בעובר. כדי להבטיח את ההצלחה של טכניקה זו, אחד צריכה להיות מודע לארבע נקודות קריטיות: 1) גודל מחט,) ייבוש 2 מ המחט, 3) צמצום נפח, ו4) זמן ח?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Morpholino with 3´fluorescein tag	Gene Tools Inc.	Customized	More information at www.gene-tools.com
Endo-Porter	Gene Tools Inc.		More information at www.gene-tools.com
Agarose	Serva	120623	For pouring plates to place the fish during injections and imaging
Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate)	Applichem		For anesthesia
E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSO4)			For larval husbandry
Petri Dishes	Sarstedt	821.472	For placing the fish during injections and imaging
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-3	For preparing injection needles
Microloader pipette tips	Eppendorf	5,242,956,003	For loading the needle
Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml)	Brand	747760/ 74775	For transfering larva
Flaming/Brown needle puller	Sutter		More information at www.sutter.com
Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5)	World Precision Instruments, Inc.	501985	To brake the needle before sharpening
Dissecting microscope	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	Part of the whole injection setup
Fluorescence camera	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	To image the fluorescence after injeciton
PicoNozzle kit (microinjector holder)	World Precision Instruments	5430-12	For microinjections
Pneumatic PicoPump (microinjector)	World Precision Instruments	SYS-PV820	For microinjections