JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Abstract

العديد من الأنواع البكتيرية تمتلك القدرة على نعلق على الأسطح واستعمار لهم في شكل أغشية رقيقة تدعى الأغشية الحيوية. الأغشية الحيوية التي تنمو في وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها هي ذات الصلة إلى العديد من العمليات الصناعية والبيئية مثل معالجة مياه الصرف الصحي وCO 2 عزل. كنا الزائفة المتألقة، بكتيريا الهوائية سلبية الغرام، للتحقيق في تشكيل بيوفيلم في جهاز ميكروفلويديك أن يقلد وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها. يتكون الجهاز ميكروفلويديك من مجموعة من المشاركات الصغرى، والتي كانت ملفقة باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة. بعد ذلك، تم تشكيل بيوفيلم التحقيق في هذه الأجهزة مع تدفق ونظهر تشكيل الأغشية الحيوية الخيطية المعروفة باسم اللافتات في الجهاز لدينا. وتقدم بروتوكولات مفصلة لتصنيع وتجميع الأجهزة ميكروفلويديك هنا جنبا إلى جنب مع بروتوكولات ثقافة البكتيرية. وتعرض أيضا إجراءات تفصيلية للتجريب مع الجهاز ميكروفلويديك جنبا إلى جنب مع ممثلالنتائج.

Introduction

في الآونة الأخيرة، أثبتنا البكتيرية ديناميات تشكيل بيوفيلم في جهاز ميكروفلويديك الذي يحاكي وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها 1. الأغشية الحيوية البكتيرية هي أساسا مستعمرات البكتيريا السطحية التي يتم تجميعها من المواد البوليمرية المغطى خارج الخلية (EPS) 2-4. يمكن لهذه الأفلام رقيقة من البكتيريا تشكل تقريبا في كل كوة يمكن تصورها تتراوح بين الأسطح الملساء إلى موطن أكثر تعقيدا من وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها. Valiei وآخرون. 1 تستخدم جهاز ميكروفلويديك مع مجموعة من الأعمدة الصغيرة لمحاكاة هيكل وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها ودرس تشكيل بيوفيلم في هذا الجهاز بوصفها وظيفة من معدل تدفق السوائل. ووجد الباحثون أنه في نظام تدفق معين، بدأت الأغشية الحيوية الخيطية المعروفة باسم اللافتات في الظهور بين ركائز مختلفة. يمكن المربوطة اللافتات في واحد أو كلا الطرفين على الأسطح الصلبة، ولكن تم تعليق بقية هيكل في السائل. يبدأ تشكيل غاسل عادة بعد طبقة الأولى من بيوفيلم شكلت وشكلهأيون يمكن أن تملي التطور الطويل الأمد للبيوفيلم في مثل هذه الموائل المعقدة. في الآونة الأخيرة، حققت العديد من الباحثين ديناميات تشكيل غاسل. أظهرت يزدي وآخرون. 5 أن اللافتات التي يمكن أن تشكل في دوامة التدفقات القادمة من فقاعة تتأرجح. في تجربة أخرى، حققت رسكوني وآخرون. 6 تأثير قناة انحناء والهندسة القناة على تشكيل اللافتات. ووجد الباحثون أن اللافتات التي يمكن أن تشكل في الفروع المنحنية من microchannels، ويرتبط غاسل التشكل إلى الحركة. وقد أثبتت الأبحاث الحديثة أن اللافتات التي يمكن أن يكون لها تداعيات واسعة في مختلف السيناريوهات الطبيعية والاصطناعية لأنها يمكن أن تكون بمثابة السلائف إلى تشكيل الهياكل الناضجة في واجهات مسامية، يؤدي إلى انتشار بيوفيلم السريع والكارثي في ​​النظم الطبية الحيوية، وأيضا أن يسبب flow- كبيرة التفاعلات هيكل، الخ 1،7-9.

اللافتات بيوفيلم غالبا ما تشكل طالموائل ن معقدة مثل وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها. فهم نمو بيوفيلم في بيئة وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها وثيق الصلة إلى العديد من العمليات البيئية والصناعية مثل معالجة مياه الصرف الصحي البيولوجية 10، الحفاظ جيدا تتحمل النزاهة في حالات مثل CO 2 القبض على 11 ويسد المسام في التربة 12. يمكن مراقبة تشكيل بيوفيلم في مثل هذه الموائل المعقدة غالبا ما تكون صعبة نظرا لغموض وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها. في مثل هذه الحالات، يمكن أن تستند على microfluidics المنابر الإعلامية التي يسهل اختراقها يثبت مفيد للغاية لأنها تسمح في الوقت الحقيقي والرصد في الموقع. ميزة أخرى من على microfluidics هو القدرة على بناء المفاعلات الحيوية متعددة على منصة الحيوية ميكروفلويديك واحدة في وقت واحد والسماح للرصد و / أو دمج أجهزة الاستشعار على الانترنت. المرونة اللازمة لتنفيذ التجارب المعملية متعددة في جهاز واحد، والقدرة على جمع البيانات الهامة ذات الصلة لأغراض التحليل الإحصائي الدقيق هو المهم متقدمantage نظم ميكروفلويديك 13،14.

في سياق المناقشة الواردة أعلاه، فإن فهم ديناميات تشكيل غاسل في بيئة وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها يكون مفيدا للعديد من التطبيقات. في هذه الدراسة، ونحن نطور بروتوكول للتحقيق في تشكيل غاسل في الجهاز الذي يحاكي وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها. تصنيع منصة ميكروفلويديك، يتم وصف الخطوات اللازمة لزراعة الخلايا والتجريب. في تجاربنا، كان يعمل النوع البري سلالة بكتيرية من المتألقة الزائفة. P. المتألقة، وجدت بشكل طبيعي في التربة، ويلعب دورا رئيسيا في الحفاظ على البيئة التربة 15. ان سلالة البكتيرية المستخدمة تم راثيا للتعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) جوهري.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

أداء البروتوكولات التجريبية هنا بالترتيب الموضح أدناه. وتناقش بروتوكولات التصنيع الدقيق لخلق منصة ميكروفلويديك في الخطوة 1. الخطوة 2 يصف بروتوكول ثقافة البكتيرية (الشكل 2)، والخطوة 3 تتعلق في التجمع من الإعداد التجريبية (الشكل 3). وأخيرا، يتم وصف الخطوة التجريبية الفعلية في الخطوة 4.

1. رقاقة الإجراءات تلفيق

يجب اتباع إجراءات السلامة المناسبة للعمليات المبينة أدناه: ملاحظة. استشارة ضابط السلامة المؤسسي لمزيد من التفاصيل.

  1. تصميم قناع مع البرمجيات المناسبة (على سبيل المثال، L-تحرير). تصميم قناة يتكون من قناة الصغرى الرئيسية في العرض 625 ميكرون. المنطقة الوسطى للقناة تحتوي على مجموعة من المشاركات الدقيقة 50 ميكرون في القطر، وبصرف النظر متباعدة 25 ميكرومتر (راجع ملفات إضافي).
  2. طباعة هذا التصميم على الزجاج (5 "س 5" زجاج الصودا الجير)، والتي يبلغ سمكها 0.09 "والمغلفة من قبل ما يقرب من 70 نانومتر طبقة سميكة من الكروم (الكروم)، وذلك باستخدام اخفاء من أجل إعداد قناع صورة. استخدام AZ400K المطور لمدة 1 دقيقة، ثم حفر طبقة الكروم باستخدام الكروم منمش لمدة 1 دقيقة استخدام الأسيتون لتجريد المقاومة وتنظيفه مع حل سمكة البيرانا البارد. (H 2 SO 4 و H 2 O 2 في نسبة 3: 1).
  3. ضوئيه
    1. تنظيف معيار رقاقة 4 "السيليكون كيميائيا مع حل سمكة البيرانا لمدة 20 دقيقة.
    2. شطف الرقاقة بالماء DI وجففها.
    3. حرارة الرقاقة على طبق ساخن (200 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة).
    4. معطف مع رقاقة السيليكون مقاومة للضوء. هنا، كان AZ4620 مقاومة للضوء المغلفة إيجابية تدور على رقاقة السيليكون في 2،000 دورة في الدقيقة لمدة 25 ثانية للحصول على 12.5 ميكرون طبقة سميكة.
    5. إزالة جميع المذيب بواسطة الخبز لينة من الرقاقة على طبق ساخن من قبل العائمة الرقاقة لمدة 90 ثانية على تدفق النيتروجين عند 100 درجة مئوية. ثم، ويبقيه في فراغ في تيانه نفس درجة الحرارة لمدة 60 ثانية.
    6. وضع رقاقة في صندوق مظلم لمدة 24 ساعة للجفاف.
    7. فضح الرقاقة للأشعة فوق البنفسجية من أجل نقل نمط مصممة لمقاومة للضوء.
    8. تزج الرقاقة في حل المطور مقاومة للضوء (AZ400K) لمدة 240 ثانية. ثم، وشطف الرقاقة مع ايزوبروبيل وجففها عن طريق وضع في تيار من غاز النيتروجين.
  4. ICP-DRIE (إضافة بالحث البلازما - رد الفعل العميق ايون النقش) عملية
    1. تطبيق DRIE الحفر. اختيار عمق حفر المناسب وفقا لعمق النهائي المطلوب للجهاز (50 ميكرومتر في هذا التحقيق). مقاومة للضوء يعمل كطبقة اخفاء أثناء هذه العملية.
    2. إزالة مقاوم الضوء المتبقية مع الأسيتون وتنظيف رقاقة.
  5. PDMS (polydimethylsiloxane) صب
    1. استخدام trichloromethylsilane (TCMS) لsilanizing القالب الرئيسي السيليكون. صب 2 أو 3 قطرات من trichloromethylsilane في قارورة ووضعها في مجفف بجانبالسيليكون القالب الرئيسي. السماح 2-3 ساعة لعملية silanizing لإكمال.
    2. في وعاء منفصل، يخلط قاعدة سيليكون Sylgard 184 مع وكيل المعالجة بواسطة نسبة وزن 10: 1 لإعداد PDMS. ديغا في PDMS قبل إخضاعها لشروط فراغ (حوالي 2 ساعة).
    3. وضع القالب الرئيسي السيليكون في حامل. ثم، صب PDMS على القالب الرئيسي السيليكون لتشكيل ختم PDMS. ضمان أن لا تشكل فقاعات في PDMS أثناء هذه العملية.
    4. علاج PDMS لمدة 2 ساعة عند 80 درجة مئوية.
    5. تقشر ختم PDMS من القالب الرئيسي. ثم، وقطع ختم PDMS في الرقائق منفصلة. وأخيرا، استخدام القطع الأساسية لحفر ثقوب لمدخل (ق) ومخرج (ق).
  6. الترابط من PDMS إلى زجاج
    1. كشف الغطاء زلة وختم PDMS إلى البلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية. ختم السندات PDMS إلى انزلاق الغطاء.
    2. لتحقيق ختم الصحيح بين الطابع PDMS وانزلاق الغطاء، يصلب الجهاز من خلال وضعه في الفرن على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.

2. البكتيرية الثقافة

ملاحظة: بروتوكولات السليمة للسلامة الأحيائية يجب اتباعها لخطوات 2-4. استشارة ضابط السلامة المؤسسي لمزيد من التفاصيل.

  1. إعداد لوحات أجار LB
    1. إضافة 20 جرام لوريا، Bertani (LB) أجار (ميلر) مساحيق و 500 مل من الماء عالى النقاء إلى 1 لتر القارورة. يحرك المزيج حتى يذوب المسحوق.
    2. تعقيم بواسطة التعقيم في 15 رطل، و 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    3. تسمح القارورة ليبرد إلى 50-55 درجة مئوية على مقاعد البدلاء أو في حمام مائي في غطاء محرك السيارة سلامة الأحيائية.
    4. إضافة التتراسكلين المضادات الحيوية لتحقيق تركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل. مزيج جيد من قبل يحوم.
    5. صب الخليط في لوحات. ملء كل لوحة حتى 1/2 - 2/3 بالكامل.
    6. فقاعات الهواء اللهب لفترة وجيزة لموسيقى البوب ​​لهم إذا كانوا تشكيل. فقاعات الهواء المتجمدة هي صعبة لنشر ثقافة البكتيرية انتهى.
    7. السماح لوحات لتبرد في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
    8. عندما تكون باردة،وضع لوحات مرة أخرى في جعبتهم، وختم الكيس، والتسمية (المضادات الحيوية والتاريخ)، وتخزينها في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: تغطية الأسهم لوحات مع رقائق القصدير، وضوء يعطل كثير من المضادات الحيوية.
  2. LB تحضير مرق
    1. إضافة 20 جرام لوريا، Bertani (LB) مرق (ميلر) ومساحيق 1 لتر من الماء عالى النقاء إلى القارورة. يحرك المزيج حتى يذوب المسحوق.
    2. تعقيم بواسطة التعقيم في 15 رطل، و 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    3. تسمح القارورة ليبرد إلى 50-55 درجة مئوية على مقاعد البدلاء أو في حمام مائي في غطاء محرك السيارة سلامة الأحيائية.
    4. إضافة التتراسيكلين المضادات الحيوية لتحقيق تركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل. مزيج جيد من قبل يحوم.
    5. عندما تبرد، ضع زجاجة المسمى في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: تغطية زجاجة مع رقائق القصدير، وضوء يعطل كثير من المضادات الحيوية.
  3. البكتيريا الثقافة على لوحة LB أجار (يستخدم هذا البروتوكول الزائفة المتألقة)
    1. تأخذ الأسهم البكتيرية من الفريزر (-80 °، C) ووضعه على الجليد.
    2. وضع -80 ° C الأسهم البكتيرية ولوحة أجار LB داخل غطاء السلامة الأحيائية.
    3. خط السلالة البكتيرية على لوحة أجار LB في نمط متعرج. تغطية لوحة آغار واحتضان ذلك في 30 درجة مئوية خلال الليل. أخيرا، تخزين وحة في الثلاجة على 4 درجات مئوية.
  4. إعداد الحل الجرثومي (S1)
    1. صب 50 مل سائل الإعلام مرق LB إلى قارورة تعقيمها. تنفيذ هذه العملية داخل غطاء السلامة الأحيائية.
    2. نقل مستعمرة بكتيرية واحدة من لوحة أجار LB إلى قارورة. وينبغي أيضا تنفيذ هذه العملية داخل غطاء السلامة الأحيائية.
    3. وضع القارورة في حاضنة شاكر عند 30 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة لوقت كاف (4 ساعة).
  5. تحضير محلول مخفف البكتيرية (S2)
    1. صب 5 مل مرق LB وسائل الإعلام في أنبوب بلاستيكي معقمة.
    2. تمييع S1 عن طريق خلط مع وسائل الاعلام مرق LB. ثم، دوامة الحل. تمييع الحل تحقيق البصرية المطلوبةالكثافة ال (OD قياس في 600 نانومتر = 0.1).
      ملاحظة: التجارب بيوفيلم توظف عادة القيم OD في هذا الجوار.

3. إعداد الإعداد التجريبية

  1. باستخدام الملقط ربط أنابيب بلاستيكية مرنة (0.20 "ID) في مدخل (ق) ومخرج (ق) من رقاقة. والمداخل والمخارج تم حفر مسبقا في الجزء PDMS من رقاقة (الخطوة 1.5.5). في هذا التحقيق وتتألف من اثنين من رقاقة مداخل ومخرج واحد.
  2. ملء حقنة (s) مع الحل البكتيري (حل S2) وإزالة كافة فقاعات في حقنة (ق).
  3. ربط طرف الحقنة (ق) (30 G 0.5 "إبرة حادة) في أنبوب مدخل (ق)، ثم ربط أنبوب منفذ (ق) إلى حاوية النفايات.

4. تشغيل التجربة

  1. ربط حقنة (ق) إلى طرف الحقنة (ق).
  2. مكان الحقنة والإصلاح (ق) على ضخ حقنة. ثم وضع رقاقة تحت المجهر الضوئي مع العدسات الهدف من ديزيريهإد التكبير (على سبيل المثال، 40X). تغطية رقاقة مع جهاز غرفة الخلايا الحية إلى الحفاظ على بيئة درجة حرارة ثابتة للنمو البكتيري (30 درجة مئوية لمدة P. المتألقة).
  3. ضبط مضخة إلى مستوى معدل التدفق المطلوب (ويقول 10 ميكرولتر / ساعة) والشروع في ضخ السوائل.
  4. مرة واحدة يتم إدخال البكتيريا في غرفة، وبدأت أيضا تشكيل بيوفيلم. تشكيل بيوفيلم والنضج تحدث عادة خلال فترة عدة ساعات أو حتى أيام. مراقبة والتقاط صور للنمو بيوفيلم من خلال المجهر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

باستخدام بروتوكول التصنيع الدقيق المذكورة أعلاه، تم إنشاء جهاز ميكروفلويديك PDMS أساس الشكل 1 يظهر المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) وصور من PDMS الجهاز. يبين الشكل 1A قسم مدخل الجهاز. يتم إنشاء مدخل مثل شوكة لمعادلة الضغط عبر رئيس الجهاز. أظهر المزيد من التص...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

أثبتنا جهاز ميكروفلويديك البسيط الذي يحاكي وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها لدراسة تطوير بيوفيلم في الموائل المعقدة. هناك العديد من الخطوات الهامة التي تملي نتائج التجارب. وتشمل هندسة الجهاز. في حين أن هندسة آخر يمكن أن تختلف وكاف مسام الفضاء لافتات لتشكيل ضروري. وع...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Professor Howard Ceri from the Biological Sciences Department of the University of Calgary for providing bacterial strains. A. Kumar acknowledges support from NSERC. T. Thundat acknowledges financial support from the Canada Excellence Research Chair (CERC) program. The authors would also like to acknowledge help from Ms. Zahra Nikakhtari for help with videography.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Flourescent MicroscopeNikon
LB agarFisherBP1425-500suspend 40 g in 1 L of purified water
LB brothFisherBP1427-500suspend 20 g in 1 L of purified water
Biosafety hoodMicrozone corporation
Petri dishFisher875712sterile 100 mm x 15 mm polystyrene Petri dish
Incubator shakerNew Brunswick ScientificExcella E24 incubator shaker series
50 ml sterilized centrifuge tubeCorning430828Polypropylene RNase-/DNase-free
Tetracycline free baseMP Biomedicals10301250 μg/ml
SYLGARD 184 siliconeDow Corning Corporation68037-59-2Elastomer Base and curing agent
Positive photoresist (AZ4620)
Plastic tubeCole-Parmer

References

  1. Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).
  2. Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  3. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
  4. Wong, G. C. L., O’Toole, G. A. All together now: Integrating biofilm research across disciplines. MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).
  5. Yazdi, S., Ardekani, A. M. Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow. Biomicrofluidics. 6, 044114(2012).
  6. Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers. J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).
  7. Drescher, K., Shen, Y., Bassler, B. L., Stone, H. A. Biofilm streamers cause catastrophic disruption of flow with consequences for environmental and medical systems. P Natl Acad Sci USA. 110, 4345-4350 (2013).
  8. Marty, A., Roques, C., Causserand, C., Bacchin, P. Formation of bacterial streamers during filtration in microfluidic systems. Biofouling. 28, 551-562 (2012).
  9. Taherzadeh, D., et al. Computational Study of the Drag and Oscillatory Movement of Biofilm Streamers in Fast Flows. Biotechnol Bioeng. 105, 600-610 (2010).
  10. Vrouwenvelder, J. S., et al. Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems. Water Res. 44, 689-702 (2010).
  11. Mitchell, A. C., et al. Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2. International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).
  12. Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. Modeling of biological clogging in unsaturated porous media. J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).
  13. Kumar, A., et al. Microscale confinement features can affect biofilm formation. Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).
  14. Neethirajan, S., et al. Encylopedia of Nanotechnology. Bhushan, B., et al. , Springer. (2012).
  15. Barathi, S., Vasudevan, N. Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil. Environ Int. 26, 413-416 (2001).
  16. Das, S., Kumar, A. Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets. arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).
  17. Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. Commonality of elastic relaxation times in biofilms. Phys Rev Lett. 93, (2004).
  18. Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications. Lab Chip. 8, 689-693 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

90 microfluidics microfluidics

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved