Protokoll für Biofilm Streamer Formation in einem Mikrofluidik-Gerät mit Micro-Säulen

Zusammenfassung

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Zusammenfassung

Verschiedene Bakterienarten besitzen die Fähigkeit, an Oberflächen anzubringen und zu kolonisieren sie in Form von dünnen Filmen als Biofilme bezeichnet. Biofilme, die in porösen Medien wachsen relevant sind mehrere Industrie-und Umweltprozesse, wie die Abwasserbehandlung und die CO _{2-Sequestrierung.} Wir verwendeten Pseudomonas fluorescens, ein gram-negatives Bakterium Aerobic, um die Biofilmbildung in einem mikrofluidischen Gerät, ahmt porösen Medien zu untersuchen. Mikrofluidik-Vorrichtung besteht aus einem Array von Mikrostellen, die unter Verwendung von Soft-Lithographie hergestellt wurden. Anschließend Biofilmbildung in diesen Geräten mit Fluss wurde untersucht, und wir zeigen die Bildung von Biofilmen als Fadenluftschlangen in unserem Gerät bekannt. Die detaillierten Protokolle für die Herstellung und Montage der Mikrofluidvorrichtung sind hier zusammen mit den Bakterienkulturprotokolle bereitgestellt. Detaillierte Verfahren für Experimente mit der mikrofluidischen Vorrichtung sind auch zusammen mit Vertreter vorgestelltErgebnisse.

Einleitung

Kürzlich haben wir gezeigt, bakterielle Biofilmbildung Dynamik in einem Mikrofluidik-Vorrichtung, die porösen Medien ¹ nachahmt. Bakterielle Biofilme sind im Wesentlichen Kolonien von Bakterien, die Oberfläche aggregiert von extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) ^2-4 eingeschlossen sind. Diese dünnen Schichten von Bakterien bilden können, in fast jede denkbare Nische, die von glatten Oberflächen auf die viel komplexer Lebensraum von porösen Medien. Valiei et al. ¹ verwendet eine Mikrofluidik-Vorrichtung mit einem Array von Mikrosäulen, um eine poröse Struktur zu simulieren und Medien untersucht Biofilmbildung bei dieser Vorrichtung als eine Funktion der Fluidströmungsrate. Sie fanden, dass in einer bestimmten Strömungsregime begann Faden Biofilme als Luftschlangen bekannt, zwischen verschiedenen Säulen entstehen. Schlangen können sich in einem angebunden werden, oder an beiden Enden an festen Oberflächen, aber der Rest der Struktur ist in Flüssigkeit suspendiert. Streamer Bildung beginnt in der Regel nach einer ersten Schicht von Biofilm gebildet hat sein Format undIonen können die langfristige Entwicklung der Biofilm in solchen komplexen Lebensräume diktieren. Vor kurzem haben mehrere Forscher die Dynamik der Streamer Bildung untersucht. Yazdi et al. ⁵ zeigte, dass die Luftschlangen können in Wirbelströme aus einer oszillierenden Blase Ursprung zu bilden. In einem anderen Experiment Rusconi et al. ⁶ untersucht die Wirkung der Kanalkrümmung und Kanalgeometrie auf die Bildung von Streamern. Sie fanden heraus, dass die Luftschlangen in gekrümmten Abschnitten von Mikrokanälen zu bilden, und Streamer Morphologie an Beweglichkeit zusammen. Neuere Forschungen haben gezeigt, dass Luftschlangen können weitreichende Auswirkungen in verschiedenen natürlichen und künstlichen Szenarien haben, wie sie als Vorläufer zur Bildung von reifen Strukturen in porösen Schnittstellen fungieren können, führen zu schnellen und katastrophalen Biofilm Proliferation in einer biomedizinischen Systemen und auch zu erheblichen Fluss Struktur-Wechselwirkungen, etc ^1,7-9.

Luftschlangen bilden Biofilm ich oftn komplexen Lebensräumen wie poröse Medien. Verständnis Biofilmwachstum in porösen Medien-Umgebung relevant zu mehreren ökologischen und industriellen Prozessen wie der biologischen Abwasserbehandlung ^10, die Aufrechterhaltung Bohrloch Integrität in Situationen, wie beispielsweise CO ₂ Erfassung ¹¹ und ein Verstopfen der Poren im Boden ^12. Beobachten Biofilmbildung in solchen komplexen Lebensräumen oft schwierig sein, aufgrund der Opazität des porösen Mediums. In solchen Situationen können Mikrofluidik basierend porösen Medien Plattformen sehr vorteilhaft erweisen, da sie in Echtzeit und in situ-Überwachung zu ermöglichen. Ein weiterer Vorteil der Mikrofluidik ist die Möglichkeit, mehrere Bioreaktoren auf einem Bio-Mikrofluidik-Plattform zu bauen und gleichzeitig ermöglichen die Online-Überwachung und / oder Einbau von Sensoren. Die Flexibilität, mehrere Laborversuche in einem Gerät und die Fähigkeit, signifikante relevanten Daten für eine präzise statistische Analyse zu sammeln implementieren ist ein wichtiger advantage von mikrofluidischen Systemen ^13,14.

In Zusammenhang mit der obigen Diskussion würde das Verständnis Streamer Bildung Dynamik in einem porösen Medium Umgebung vorteilhaft, mehrere Anwendungen. In dieser Studie, entwickeln wir das Protokoll für die Untersuchung von Streamer-Bildung in einem Gerät, das imitiert porösen Medien. Herstellung von mikrofluidischen Plattform, sind notwendige Schritte für die Zellkultur und Experimente beschrieben. In unseren Experimenten wurde die Wildtyp-Bakterienstamm Pseudomonas fluorescens beschäftigt. P. fluorescens, natürlich im Boden gefunden, spielt eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der Bodenökologie ^15. Der Bakterienstamm eingesetzt worden gentechnisch verändert, um das grün fluoreszierende Protein (GFP) exprimieren konstitutiv.

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Protokoll

Führen Sie die Versuchsprotokolle hier in der unten beschriebenen Reihenfolge. Mikro Protokolle zum Erzeugen der Mikrofluid-Plattform in Schritt 1. Schritt 2 beschrieben wird die Bakterienkultur Protokoll (2) und Schritt 3 betrifft die Anordnung der Versuchsaufbau (Figur 3). Schließlich wird die tatsächliche Versuchsschritt in Schritt 4 beschrieben.

1. Chipfertigungsverfahren

HINWEIS: Die richtige Sicherheitsverfahren muss für die unten beschriebenen Verfahren befolgt werden. Wenden Sie sich an den institutionellen Sicherheitsbeauftragten für Details.

1. Entwerfen Sie die Maske mit einer geeigneten Software (zB L-Edit). Der Kanal-Design besteht aus einem Hauptmikrokanal mit einer Breite von 625 um. Der zentrale Bereich des Kanals enthält ein Array von Mikrostellen 50 um Durchmesser, 25 um voneinander beabstandet sind (siehe Zusatzdateien).
2. Drucken Sie diesen Entwurf auf Glas (5 "x 5" Soda-Kalk-Glas), Die eine Dicke von 0,09 "hat und von etwa 70 nm dicke Schicht aus Chrom (Cr) beschichtet, mit Maskierung, um eine Fotomaske vorzubereiten. Verwenden AZ400K Entwickler für 1 min. Dann Ätzen der Cr-Schicht mit Cr-Ätzmittel für ca. 1 min mit Azeton Streifen der Resist und reinigen Sie es mit kaltem Piranha-Lösung. (H ₂ SO ₄ und H ₂ O ₂ in einem Verhältnis von 3: 1).
3. Photolithographie
   1. Reinigen Sie ein Standard-4 "Silizium-Wafer chemisch mit Piranha-Lösung für 20 min.
   2. Spülen Sie die Wafer mit DI-Wasser und trocknen.
   3. Heizen den Wafer auf einer heißen Platte (200 ° C für 15 min).
   4. Beschichtung der Silizium-Wafer mit Fotolack. Hier ist der positive Photoresist AZ4620 wurde auf einem Siliziumwafer für 25 Sekunden Spin-beschichtet bei 2000 UpM auf eine 12,5 um dicke Schicht zu erhalten.
   5. Entfernen des Lösungsmittels durch alle weichen Backen der Wafer auf einer heißen Platte durch Floaten der Wafer 90 s lang bei einem Stickstoffstrom bei 100 ° C aufweist. Dann halten Sie es im Vakuum bei ter dieselbe Temperatur für 60 Sekunden.
   6. Legen Sie die Wafer in einem dunklen Kasten für 24 Stunden zur Entwässerung.
   7. Setzen Sie das Wafer mit UV-Licht, um die entworfenen Muster auf den Fotolack übertragen.
   8. Tauchen Sie die Wafer in Photoresist-Entwicklerlösung (AZ400K) für 240 Sekunden. Dann spülen Sie die Wafer mit Isopropyl-Alkohol und trocknen Sie es, indem Sie in einem Strom von Stickstoffgas.
4. ICP-DRIE (Induktiv gekoppeltes Plasma - Deep Reactive Ion Etching) Prozess
   1. Gelten DRIE Ätzen. Wählen Sie die entsprechende Ätztiefe nach Endtiefe für Gerät erforderlich (50 um in dieser Untersuchung). Photoresist wirkt als Maskierungsschicht während dieses Prozesses.
   2. Das restliche Photolack mit Aceton und reinigen Sie den Wafer.
5. PDMS (Polydimethylsiloxan) Casting
   1. Verwenden Trichlormethylsilan (TCMS) für Silanisierung des Silizium Master-Form. Gießen Sie 2 oder 3 Tropfen Trichlormethylsilan in einem Fläschchen und legen Sie sie in einem Exsikkator neben demSilizium Master-Form. Lassen Sie 2-3 Stunden für die Silanisierung Vorgang abgeschlossen ist.
   2. In einem separaten Behälter, mischen die Sylgard 184 Silikonbasis mit Härter Gewichtsverhältnis von 10: 1 bis PDMS vorzubereiten. Entgasen PDMS, indem man es Bedingungen (etwa 2 h) Vakuum.
   3. Setzen Sie den Silizium Master-Form in einer Halterung. Dann gießen Sie die PDMS auf dem Silizium-Master-Form, um die PDMS-Stempel zu bilden. Sicherzustellen, dass keine Blasen in dem PDMS bilden bei diesem Vorgang.
   4. Heilen die PDMS für 2 Stunden bei 80 ° C.
   5. Ziehen Sie die PDMS-Stempel von der Master-Form. Dann schneiden die PDMS-Stempel in separate Mikrochips. Schließlich verwenden einen Schneidkern, um Löcher für den Einlass (en) und Steckdose (n) zu bohren.
6. Verklebung von PDMS zu Glass
   1. Setzen Sie das Deckglas und PDMS-Stempel Sauerstoffplasma für 30 Sekunden. Bond PDMS-Stempel auf das Deckglas.
   2. Um eine einwandfreie Abdichtung zwischen der PDMS-Stempel und dem Deckglas zu erreichen, zu tempern das Gerät, indem es in einem Ofen bei 70 ° C für 10 min.

2. Bakterienkultur

HINWEIS: Das richtige Biosicherheit Protokolle müssen für die Schritte 2-4 befolgt werden. Wenden Sie sich an den institutionellen Sicherheitsbeauftragten für Details.

1. Bereiten LB-Agar-Platten
   1. 20 g Luria-Bertani (LB)-Agar (Miller)-Pulver und 500 ml ultrareinem Wasser in einen 1-l-Kolben. Rühren, um das Pulver aufzulösen.
   2. Sterilisieren durch Autoklavieren bei 15 psi, 121 ° C für 15 min.
   3. Lässt man den Kolben auf 50-55 ° C auf einer Bank oder in einem Wasserbad in der Biosicherheit Haube abkühlen.
   4. Hinzufügen des Antibiotikums Tetracyclin bis zu einer Endkonzentration von 50 ug / ml zu erreichen. Gut mischen durch Verwirbelung.
   5. Gießen Sie die Mischung in Platten. Füllen Sie jede Platte bis 02.01 - 03.02 voll.
   6. Flamme Luftblasen kurz zu Pop, wenn sie zu bilden. Erstarrten Luftblasen sind schwer zu Bakterienkultur über zu verbreiten.
   7. Die Platten werden bei Raumtemperatur über Nacht abkühlen.
   8. Wenn sie cool sind,legte Platten wieder in ihre Hülle, den Beutel, Etikett (Antibiotikum und Datum), und bei 4 ° C.
      HINWEIS: Decken Sie das Lager von Platten mit Alufolie als Licht deaktiviert viele Antibiotika.
2. LB Broth Herstellung
   1. 20 g Luria Bertani (LB)-Medium (Miller) Pulver und 1 l Reinstwasser in einen Kolben. Rühren, um das Pulver aufzulösen.
   2. Sterilisieren durch Autoklavieren bei 15 psi, 121 ° C für 15 min.
   3. Ermöglichen Kolben auf 50-55 ° C auf einer Bank oder in einem Wasserbad in der Biosicherheit Haube abkühlen.
   4. Hinzufügen des Antibiotikums Tetracyclin bis zu einer Endkonzentration von 50 ug / ml zu erreichen. Gut mischen durch Verwirbelung.
   5. Wenn kühl, legen Sie die etikettierte Flasche bei 4 ° C.
      HINWEIS: Decken Sie die Flasche mit Alufolie als Licht deaktiviert viele Antibiotika.
3. Kulturbakterien auf einer LB-Agarplatte (Dieses Protokoll verwendet Pseudomonas fluorescens)
   1. Nehmen Sie die bakterielle Lager aus dem Gefrierschrank (-80 °, C) und legen Sie es auf Eis.
   2. Legen Sie die -80 ° C bakterielle Lager und eine LB-Agar-Platte in einem biologischen Sicherheits Kapuze.
   3. Streifen der Bakterienstamm auf eine LB-Agar-Platte in einem Zickzackmuster. Decken Sie die Agar-Platte und Inkubation bei 30 ° C es über Nacht. Schließlich speichern Sie die Platte im Kühlschrank bei 4 ° C.
4. Bereiten Sie die Bakterienlösung (S1)
   1. Gießen Sie 50 ml LB-Medium Medien zu einer autoklavierten Kolben. Führen Sie diesen Vorgang in einer biologischen Sicherheits Kapuze.
   2. Übertragen einer einzelnen Kolonie von der LB-Agar-Platte in den Kolben. Dieser Vorgang sollte auch in einem biologischen Sicherheitshaube durchgeführt werden.
   3. Setzen Sie den Kolben in einem Schüttelinkubator bei 30 ° C und 150 rpm für eine ausreichende Zeit (4 h).
5. Bereiten Sie die verdünnte Bakterienlösung (S2)
   1. Pour 5 ml LB-Brühe Medien in eine sterilisierte Kunststoffrohr.
   2. Verdünnen S1 durch Mischen mit LB-Brühe Medien. Dann, Vortex die Lösung. Verdünnen Sie die Lösung zu dem gewünschten Optikal Dichte (OD bei 600 nm = 0,1 gemessen).
      HINWEIS: Biofilm Experimenten typischerweise OD-Werte in diesem Bereich.

3. Bereiten Sie den Versuchsaufbau

1. Mit einer Pinzette verbinden flexiblen Kunststoffrohren (0,20 "ID) in den Einlaß (en) und Austrittsöffnung (en) des Mikrochips. Die Einlässe und Auslässe wurden zuvor in die PDMS Abschnitt der Mikrochip (Schritt 1.5.5) gebohrt. In dieser Untersuchung Der Mikrochip besteht aus zwei Eingängen und einem Ausgang.
2. Füllen Spritze (n) mit Bakterienlösung (S2-Lösung) und entfernen Sie alle Luftblasen in der Spritze (n).
3. Verbinden Spritze Spitze (n) (30 G 0,5 "stumpfe Nadel) in Einlassrohr (en). Dann schließen Austrittsrohr (en) in den Behälter zu verschwenden.

4. Führen Sie das Experiment

1. Die Spritze (s) an der Spitze der Spritze (s).
2. Ort und fix Spritze (s) auf die Spritzenpumpe. Dann legen Sie den Mikrochip unter einem optischen Mikroskop mit Objektiven von Desired Vergrößerung (zB 40x). Decken den Mikrochip mit einer lebenden Zelle Kammereinrichtung, um eine konstante Temperaturumgebung für das bakterielle Wachstum (30 ° C für P. fluorescens) aufrechtzuerhalten.
3. Stellen Sie die Pumpe auf den gewünschten Strömungsgeschwindigkeit der Pegel (zB 10 ul / h), und initiieren Flüssigkeitspump.
4. Wenn Bakterien in die Kammer eingeführt wird, wird auch die Biofilmbildung initiiert. Biofilmbildung und Reifung treten typischerweise über einen Zeitraum von mehreren Stunden oder sogar Tage. Beobachten und Bilder von Biofilmwachstum durch das Mikroskop.

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Ergebnisse

Unter Verwendung des oben erwähnten Mikro Protokoll wurde eine PDMS basierend mikrofluidischen Vorrichtung konstruiert. 1 zeigt die rasterelektronenmikroskopische (REM) Aufnahmen der PDMS-Gerät. 1A zeigt die Eingangsabschnitt der Vorrichtung. Ein gabelförmigen Eingang wird erstellt, um Druckkopf über das Gerät auszugleichen. Weitere REM-Aufnahmen zeigten auch, dass die Säulenwände fast senkrecht (Abbildung 1b). Die kultivierten Bakterienlösung (2)

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Diskussion

Wir haben gezeigt, einen einfachen Mikrofluidik-Gerät, das poröse Medien für das Studium Biofilmentwicklung in komplexen Lebensräumen nachahmt. Es gibt mehrere wichtige Schritte, die das Ergebnis der Experimente bestimmen. Sie enthalten Gerätegeometrie. Während die Post Geometrie variieren kann, ist ausreichend Platz für porenLuftSchlangen zu bilden notwendig. Darüber hinaus Valiei et al. ¹ haben gezeigt, dass Streamer Bildung nur in einer bestimmten Durchflussbereich auftritt. Bei Flussraten...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flourescent Microscope	Nikon
LB agar	Fisher	BP1425-500	suspend 40 g in 1 L of purified water
LB broth	Fisher	BP1427-500	suspend 20 g in 1 L of purified water
Biosafety hood	Microzone corporation
Petri dish	Fisher	875712	sterile 100 mm x 15 mm polystyrene Petri dish
Incubator shaker	New Brunswick Scientific		Excella E24 incubator shaker series
50 ml sterilized centrifuge tube	Corning	430828	Polypropylene RNase-/DNase-free
Tetracycline free base	MP Biomedicals	103012	50 μg/ml
SYLGARD 184 silicone	Dow Corning Corporation	68037-59-2	Elastomer Base and curing agent
Positive photoresist (AZ4620)
Plastic tube	Cole-Parmer