Протокол биопленки Streamer формирования в микрожидкостных устройств с Micro-столбов

Резюме

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Аннотация

Несколько видов бактерий обладают способностью придаем поверхностей и колонизировать их в виде тонких пленок, называемых биопленок. Биопленки, которые растут в пористых средах актуальны для нескольких промышленных и экологических процессов, таких как очистка сточных вод и CO ₂ секвестра. Мы использовали Pseudomonas Шогезсепз, грамотрицательная аэробная бактерия, исследовать образование биопленки в микрофлюидном устройства, которое имитирует пористых средах. Микрожидкостных устройство состоит из массива микро-сообщений, которые были изготовлены с использованием софт-литографии. Впоследствии, образование биопленки в этих устройствах с потоком была исследована и мы демонстрируем формирование нитевидных биопленок, известных как растяжки в нашем устройстве. Подробные протоколы для изготовления и сборки микрожидкостных устройств предусмотрены здесь наряду с бактериальными протоколов культуры. Подробные процедуры экспериментов с микрожидкостных устройств также представлены наряду с представителемРезультаты.

Введение

Недавно мы показали динамику бактериальные биопленки в микрофлюидном устройства, который имитирует пористых средах ^1. Бактериальные биопленки, по существу колонии на поверхности бактерий, которые объединены заключены по внеклеточных полимерных веществ (EPS) ^2-4. Эти тонкие пленки бактерий могут образовываться в практически все мыслимые ниши, начиная от гладких поверхностей с гораздо более сложной среде обитания пористых сред. Valiei и соавт. ¹ используется микрожидком устройство с множеством микро-колоннами, чтобы имитировать пористую структуру носителя и изучены образования биопленки в этом устройстве в зависимости от скорости потока жидкости. Они обнаружили, что в определенном режиме потока, нитевидные биопленки известные как растяжки стали появляться между различными колоннами. Ответвления могут быть привязаны на одном или обоих концах твердых поверхностей, но остальная часть структуры суспендируют в жидкости. Streamer образование, как правило, начинается после начального слой биопленки сформировал и его форматион может диктовать долгосрочного развития биопленки в таких сложных мест обитания. В последнее время некоторые исследователи исследовали динамику формирования стримера. Язди и др. ⁵ показали, что растяжки могут образовывать в вихревых потоков, происходящих из колеблющегося пузырька. В другом эксперименте, Рускони др. ⁶ исследовано влияние кривизны канала и геометрии канала на формирование стримеров. Они обнаружили, что растяжки могут образовываться в изогнутых участках микроканалов, а стримерного морфологии связано с подвижностью. Недавние исследования показали, что растяжки могут иметь далеко идущие последствия в различных естественных и искусственных сценариев, поскольку они могут действовать в качестве предшественников формирования зрелых структур в пористых интерфейсов, привести к быстрому и катастрофическому распространению биопленки в биомедицинских систем, а также нанести существенный проточного Структура взаимодействия и т.д. ^1,7-9.

Биопленки растяжки часто форма Iн сложные места обитания, такие как пористых средах. Понимание рост биопленки в пористой среде СМИ имеет отношение к нескольким экологических и производственных процессов, таких как биологической очистки сточных вод ^10, поддержание ствола скважины целостность в таких ситуациях, как улавливания СО ₂ ¹¹ и забивания пор в почве ^12. Наблюдая образование биопленки в таких сложных мест обитания часто может быть сложной задачей в связи с непрозрачностью пористых средах. В таких ситуациях, Microfluidics основе пористых средства массовой информации, может оказаться чрезвычайно выгодным, так как они позволяют в режиме реального времени и в мониторинге месте. Еще одно преимущество микрофлюидики является возможность построить несколько биореакторов на одном био-Микрожидкостных платформе и одновременно обеспечить оперативного мониторинга и / или включения датчиков. Гибкость, чтобы реализовать несколько лабораторных экспериментов в одном устройстве и возможность получать значительные соответствующие данные для точного статистического анализа является важным Advantage из микрофлюидных систем ^13,14.

В контексте сказанного выше, динамика понимание формирования стримеров в пористой среде медиа бы полезно несколько приложений. В этом исследовании, мы разрабатываем протокол за расследование образование косы в устройстве, которое имитирует пористые среды. Изготовление микрожидкостных платформы, необходимые шаги для культуры и экспериментов клетки описаны. В наших экспериментах был использован дикий тип Бактериальный штамм Pseudomonas Fluorescens. П. Fluorescens, нашел в почве, играет ключевую роль в поддержании экологии почв ^15. Бактериальный штамм занятых были генетически сконструированы для экспрессии зеленый флуоресцентный белок (GFP) конститутивно.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Выполните экспериментальных протоколов здесь в порядке, описанном ниже. Протоколы микротехнологий для создания микрожидкостных платформы обсуждаются в шаге 1 Шаг 2 описывает бактериальной протокол культуры (рис 2), и Шаг 3 относится к сборке экспериментальной установки (рисунок 3). Наконец, фактический экспериментальный шаг описан в пункте 4.

1 Чип Порядок изготовления

ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное процедуры безопасности необходимо выполнять для процессов, описанных ниже. Обратитесь к институциональной офицера безопасности для деталей.

1. Дизайн маску с соответствующим программным обеспечением (например, L-Edit). Конструкция канала состоит из главного микро-канал с шириной 625 мкм. Центральная область канала содержит массив микро-сообщений 50 мкм в диаметре, расположены 25 мкм друг от друга (Смотрите дополнительные файлы).
2. Распечатать эту конструкцию на стекле (5 "х 5" натрий-кальций-стекло), Который имеет толщину 0,09 "и покрыта примерно на 70 нм толстым слоем хрома (Cr), с помощью маскировки, чтобы подготовить фотошаблон. Использование AZ400K разработчиком в течение 1 мин. Затем, травление слой Cr с использованием травителя Cr около 1 мин Используйте ацетон обирать сопротивляться и очистить его с холодным раствором пираньи. (H ₂ SO ₄ и H ₂ O ₂ в соотношении 3: 1).
3. Фотолитографии
   1. Очистите стандартный 4 "кремниевой пластины химически с пираньи решение в течение 20 мин.
   2. Промыть пластины с дистиллированной водой и высушить его.
   3. Нагреть пластины на горячей плите (200 ° С в течение 15 мин).
   4. Пальто кремниевой пластины с фоторезиста. Здесь положительный фоторезист AZ4620 был спин-покрытием на кремниевой пластине при 2000 оборотах в минуту в течение 25 сек, чтобы получить толстый слой 12,5 мкм.
   5. Удалить весь растворитель мягкой выпечки пластины на горячей плите путем размещения пластины в течение 90 сек на потоке азота при 100 ° С. Тогда, держать его в вакууме при ТОн же температуре в течение 60 сек.
   6. Поместите пластину в темном поле в течение 24 часов для обезвоживания.
   7. Expose пластину УФ-излучения для того, чтобы передать картины, разработанные для фоторезиста.
   8. Погрузите пластины в раствор фоторезиста разработчиков (AZ400K) для 240 сек. Затем промыть пластины с изопропиловым спиртом и сушат, поместив в потоке газообразного азота.
4. ICP-DRIE (индуктивно-связанной плазмой - Deep Реактивное ионное травление) Процесс
   1. Применить DRIE травления. Выберите подходящий глубину травления в соответствии с конечной глубины, необходимой для устройства (50 мкм в данном исследовании). Фоторезист действует в качестве маскирующего слоя во время этого процесса.
   2. Удалите остатки фоторезиста с ацетоном и очистить пластины.
5. PDMS (полидиметилсилоксана) Литье
   1. Используйте trichloromethylsilane (TCMS) для silanizing мастер кремния формы. Залить 2 или 3 капли trichloromethylsilane в пузырек и поместите его в эксикаторе рядомкремния мастер формы. Разрешить 2-3 ч для процесс silanizing, чтобы закончить.
   2. В отдельном контейнере, смешать силиконовую базу Sylgard 184 с помощью отвердителя весовом соотношении 10: 1 для приготовления PDMS. Дегазации PDMS, подвергая его условиях вакуума (около 2 ч).
   3. Поставьте кремния мастер формы в держателе. Тогда, залить PDMS на главном кремния формы, чтобы сформировать PDMS штамп. Убедитесь, что пузырьки не образуют в PDMS в ходе этого процесса.
   4. Вылечить PDMS течение 2 ч при 80 ° С.
   5. Снимите штампа PDMS от мастера плесени. Тогда, вырезать PDMS штамп в отдельных микросхем. И, наконец, использовать режущую ядро ​​для сверления отверстий для впуска (ы) и выходе (ы).
6. Склеивание PDMS до стекла
   1. Expose покровное и PDMS штамп в кислородной плазме в течение 30 сек. Бонд PDMS штамп в покровным.
   2. Для достижения надлежащего уплотнения между PDMS штамп и покровным стеклом, отжига устройство, поместив ее в печи при 70 ° С в течение 10 мин.

2 бактериальная культура

ПРИМЕЧАНИЕ: Собственные протоколы биобезопасности должен следовать за шаги 2-4. Обратитесь к институциональной офицера безопасности для деталей.

1. Подготовка чашек с агаром LB
   1. Добавить 20 г Лурии-Бертани (LB), агар (Miller) порошки и 500 мл сверхчистой воды в 1-литровую колбу. Движение, чтобы растворить порошок.
   2. Стерилизация в автоклаве при 15 фунтов на квадратный дюйм, 121 ° С в течение 15 мин.
   3. Разрешить колбу остыть до 50-55 ° С на скамейке или на водяной бане в капюшоне биобезопасности.
   4. Добавьте Тетрациклин антибиотик, чтобы достичь конечной концентрации 50 мкг / мл. Все хорошо перемешать, вращая.
   5. Вылейте смесь в пластинах. Заполните каждую тарелку по 1/2 - 2/3 полной.
   6. Кратко пламени пузырьки воздуха, чтобы совать их, если они образуют. Затвердевшие пузырьки воздуха трудно распространить бактериальную культуру более.
   7. Разрешить пластины остыть при комнатной температуре в течение ночи.
   8. Когда они здорово,положить тарелки обратно в рукаве, печать мешок, метку (антибиотик и дату), и хранить при температуре 4 ° С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Покройте запас пластин с фольгой, как свет дезактивирует многие антибиотики.
2. LB Отвар Подготовка
   1. Добавить 20 г Лурия-Bertani (LB) бульон (Miller) порошки и 1 л воды высшей степени очистки на колбу. Движение, чтобы растворить порошок.
   2. Стерилизация в автоклаве при 15 фунтов на квадратный дюйм, 121 ° С в течение 15 мин.
   3. Разрешить колбу остыть до 50-55 ° С на скамейке или на водяной бане в капюшоне биобезопасности.
   4. Добавьте тетрациклин антибиотик, чтобы достичь конечной концентрации 50 мкг / мл. Все хорошо перемешать, вращая.
   5. Когда остынет, поместите надписью бутылку при 4 ° С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Покройте бутылку с фольгой, как свет дезактивирует многие антибиотики.
3. Культура Бактерии на LB агаром (использует Этот протокол Pseudomonas Шогезсепз)
   1. Возьмите бактериальной запас из морозильника (-80 °; C) и поместите его на льду.
   2. Поместите -80 ° C бактериальный бульон и агар пластины LB внутри капюшоном биобезопасности.
   3. Подряд бактериальный штамм на чашке с агаром LB, в виде ломаной линии. Накройте агаром и инкубировать ее при 30 ° С в течение ночи. И, наконец, хранить пластины в холодильнике при 4 ° С.
4. Подготовьте бактериального раствора (S1)
   1. Налейте 50 мл LB бульон СМИ к автоклавного колбу. Выполните эту операцию внутри капюшоном биобезопасности.
   2. Передача одну бактериальную колонию с чашки с агаром LB в колбу. Эта операция также должна быть выполнена внутри капюшоном биобезопасности.
   3. Поставьте колбу в шейкер-инкубатор при 30 ° С и 150 оборотов в минуту для адекватного времени (4 ч).
5. Подготовьте разбавленной бактериального раствора (S2)
   1. Налейте 5 мл LB бульон СМИ в стерилизованную пластиковой трубки.
   2. Развести S1 путем смешивания с LB бульоне СМИ. Тогда, вихрь решение. Развести раствор достичь желаемого оптикааль плотность (OD при 600 нм = 0,1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: биопленки эксперименты обычно используют значения ОП в этом районе.

3 Подготовьте Setup Экспериментальная

1. С помощью пинцета подключить гибкие пластиковые трубки (0,20 "ID) в входе (входах) и выходе (ы) микрочипа. Входы и выходы были ранее пробуренных в PDMS части микрочипа (шаг 1.5.5). В этом исследовании , микрочип состоит из двух входов и один выход.
2. Заполните шприц (ы) с бактериальной раствор (раствор S2) и удалить все пузырьки в шприце (ы).
3. Подключите шприц наконечник (ы) (30 G 0,5 "тупые иглы) в впускной трубы (ы). Затем подключите выходную трубку (ы), чтобы тратить контейнер.

4 Запустите эксперимент

1. Подключение шприц (ей) наконечника (ы) шприца.
2. Место и исправление шприц (ы) на шприцевой насос. Затем поместите микрочип под оптическим микроскопом с объективов желаниред увеличение (например, 40X). Накройте микрочип с живой клетки камеры устройства для поддержания постоянной температуры окружающей среды для роста бактерий (30 ° C для Р. Шогезсепз).
3. Установите насос на уровне лучшего расхода (скажем 10 мкл / час) и инициировать перекачку жидкости.
4. После того, как бактерии вводятся в камеру, образование биопленки также инициирован. Формирование биопленок и созревание обычно происходит в течение нескольких часов или даже дней. Наблюдать и получать изображения роста биопленки через микроскоп.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Используя упомянутую выше протокол микроструктур, на основе PDMS микрожидкостных устройство было построено. Рисунок 1 показывает сканирующего электронного микроскопа (SEM) образы PDMS устройство. 1а представлены вступительный раздел устройства. Вилка-как вход создается ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мы продемонстрировали простой микрожидкостных устройств, который имитирует пористых средах для изучения развития биопленки в сложных средах обитания. Есть несколько важных шагов, которые диктуют итоги экспериментов. Они включают в себя геометрию устройства. В то время как геометрия ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flourescent Microscope	Nikon
LB agar	Fisher	BP1425-500	suspend 40 g in 1 L of purified water
LB broth	Fisher	BP1427-500	suspend 20 g in 1 L of purified water
Biosafety hood	Microzone corporation
Petri dish	Fisher	875712	sterile 100 mm x 15 mm polystyrene Petri dish
Incubator shaker	New Brunswick Scientific		Excella E24 incubator shaker series
50 ml sterilized centrifuge tube	Corning	430828	Polypropylene RNase-/DNase-free
Tetracycline free base	MP Biomedicals	103012	50 μg/ml
SYLGARD 184 silicone	Dow Corning Corporation	68037-59-2	Elastomer Base and curing agent
Positive photoresist (AZ4620)
Plastic tube	Cole-Parmer