طريقة مبتكرة من الدواء إلى عدة الزرد (<em&gt; دانيو rerio</em&gt;) والكمي لسحب

Summary

A novel method for reducing variability when exposing fish to drugs is explained. Fish exposed to various patterns of ethanol exposure were found to have altered anxiety levels during withdrawal in a light/dark scototaxic assay.

Abstract

Anxiety testing in zebrafish is often studied in combination with the application of pharmacological substances. In these studies, fish are routinely netted and transported between home aquaria and dosing tanks. In order to enhance the ease of compound administration, a novel method for transferring fish between tanks for drug administration was developed. Inserts that are designed for spawning were used to transfer groups of fish into the drug solution, allowing accurate dosing of all fish in the group. This increases the precision and efficiency of dosing, which becomes very important in long schedules of repeated drug administration. We implemented this procedure for use in a study examining the behavior of zebrafish in the light/dark test after administering ethanol with differing 21 day schedules. In fish exposed to daily-moderate amounts of alcohol there was a significant difference in location preference after 2 days of withdrawal when compared to the control group. However, a significant difference in location preference in a group exposed to weekly-binge administration was not observed.

This protocol can be generalized for use with all types of compounds that are water-soluble and may be used in any situation when the behavior of fish during or after long schedules of drug administration is being examined. The light/dark test is also a valuable method of assessing withdrawal-induced changes in anxiety.

Introduction

الزرد (دانيو rerio) هو نوع مكتملة العظام الصغيرة الناشئة في الهند الذي هو كائن نموذجا مفيدا للالسلوكي ⁽¹⁾ والبحوث الطبية ^2،3. كما تستخدم عادة في الزرد اختبار المواد الدوائية المختلفة من أجل تميز تأثيرها على السلوك. وقد تم استخدام الجرعات وجداول إدارة المخدرات المختلفة للتحقيق في سلوك الزرد بعد إدارة المركبات مثل المنشطات ^{4، 5} مزيلات القلق والإيثانول ^6-8.

وقد حققت لدينا مختبر آثار اختلاف جداول إدارة الإيثانول على القلق الزرد وتنقل في التحقق جيدا الضوء / الظلام فحص ^{9، 20،} كما يشار إلى الفحص scototaxic. وقد تم تطوير طريقة جديدة لإدارة الإيثانول لزيادة الكفاءة لالمتكررة، والإدارة اليومية على مدى فترة طويلة من الوقت (21 يوما) ⁶ . كانت الأساليب المستخدمة من قبل العملية، ومع ذلك، سعينا إلى تطوير طريقة التي خفضت المعاوضة، مع تكاليف الوقت المرتبط به، وسمحت في وقت واحد، والإدارة توقيتها بالضبط من المخدرات من اهتمام أعداد كبيرة من الأسماك. في البحث باستخدام الايثانول التقليدي، واحرز الزرد ونقل من خزان لآخر تحتوي على خليط مناسب من الايثانول والماء ^10-12. في حين أن هذا الأسلوب هو مقبول على نطاق واسع، المعاوضة الزرد قد يزيد من تقلب في الوقت اللازم لإدخال وإزالة الأسماك من محلول الدواء. وبالتالي فإن التعرض المحدد لمجمع الفائدة قد تختلف على مدار تجربة تنطوي على جرعات متكررة. وهناك طريقة تقلل مصادر الخطأ الناجمة عن التقلبات في أوقات النقل وبالتالي مرغوب فيه. مع أسلوبنا ونحن قادرون على نقل كافة الأسماك في وقت واحد، مما أدى إلى متطابقة الوقت الجرعات في كل الأسماك. بعد التعرض الإيثانول (الموصوفة هنا)، الزرد يمكن اختبارها في أي العدد. dR من المقايسات السلوكية، بما فيها تلك التي تقيم القلق. الجرعات مجموعات من الأسماك باستخدام طريقة جديدة لديها الاستخدامات العملية تتجاوز قدرة على تكرار بدقة وتوحيد الجرعات بين المواضيع وعبر مجموعات من الأسماك. ظهور البرمجيات الجديدة التي تسمح لتتبع الأسماك متعددة في وقت واحد قد يرى الباحثون الاستفادة من الأساليب لضمان تكرارها والدقة في تجاربهم. وبالنظر إلى الانتشار الواسع لاستخدام الزرد باعتباره النموذج الحي لعلم الأعصاب السلوكي، وهذه الطريقة تزيد من الكفاءة والتطبيق العملي في الدراسات الدوائية المستقبلية.

في النموذج الحالي، كان يعمل جدول الجرعات المتكررة التي تعكس حوالي جداول الشرب الإنسان. تم تعيين الأسماك بشكل عشوائي إلى ثلاث مجموعات: السيطرة، يوميا المعتدلة، أو أسبوعي، بنهم. كان جدول الجرعات 21 يوما في المدة، واختياره لأنه تجاوز كثيرا مرات التعرض في الدراسات السابقة ^7. تلقت الأسماك السيطرة الصفر جنة الموجودات والمطلوباتالحول، تلقت السمك يوميا معتدلة 0.2٪ كحول مرة واحدة في اليوم الواحد، وتلقى الأسماك أسبوعيا، حفلة 1.4٪ كحول مرة واحدة في الأسبوع. وقد استخدمت هذه المهمة الخفيفة / مظلمة لتقييم القلق 2 بعد أيام من الانسحاب. هذا اختبار بسيط نسبيا لإدارة والذي يستخدم ساحة مستطيلة فيها الجدران على جانب واحد هي بيضاء وعلى الجانب الآخر هي الداكنة ^9. الزرد الكبار يفضلون بقوة الجانب المظلم من الساحة في ظل ظروف سيطرة ^6،9،13. يتم تعريف تزايد القلق من الناحية العملية كما مزيدا من الوقت يقضيه في منطقة مظلمة، وانخفضت يمكن افتراض القلق عندما تنفق الأسماك أكثر نسبيا الوقت الذي يقضيه في المنطقة الخفيفة. مع برنامج حركة تتبع، والمتغيرات الإعلامية الأخرى ويمكن أيضا أن يكون كميا، بما في ذلك متوسط ​​السرعة، والجمود، التعرجات، ومنطقة التحولات ^14.

طريقة الجرعات تطويرها في المختبر لدينا يمكن أن تنطبق على أي البحثية التي تدار المركبات القابلة للذوبان في الماء لzebrafi واحد أو أكثرش. ويجري حاليا اختبار العديد من وكلاء الدوائية الأخرى التي قد تستفيد من هذه المنهجية في الزرد. وتشمل مركبات اخضعت للاختبار عادة النيكوتين، الكلورديازيبوكسيد، بوسبيرون، وسكوبولامين، والتي حلت بطريقة مماثلة لالايثانول. عن طريق خلط كمية مناسبة من المواد الكيميائية في المياه. وبالتالي فإن النطاق العام من هذا الإجراء هو أوسع من ذلك بكثير، وليس مقصورا على الايثانول. وعلاوة على ذلك، وبعد الجرعات مع المخدرات لأيام متعددة، فإن المهمة الخفيفة / السوداء هي واحدة فقط من العديد من الاختبارات السلوكية التي يمكن استخدامها. بعد تناوله المخدرات أو أثناء الانسحاب، المقايسات الشعبية الأخرى التي يمكن استخدامها تشمل الغوص اختبار خزان ¹⁵ رواية واختبارات السلوك الاجتماعي مثل shoaling ^16. فإن الإجراء التالي الخطوط العريضة وسيلة فعالة لنقل مرارا مجموعات من الأسماك أو الأسماك الفردية في الحلول التي تحتوي على مركب دوائي من الفائدة. بالإضافة إلى ذلك، فإن عملية الاختبار القلق مع ضوء اختبار / الظلامفي مجموعات من الأسماك الذين هم في الانسحاب بعد تعرضهم لجداول طويلة من إدارة الكحول سيتم وصفها.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وتمت الموافقة على جميع الإجراءات والاختبارات السلوكية للأبحاث الحيوان أخلاقيات مجلس الجامعة MacEwan بموجب البروتوكول رقم 06-11-12، الذي هو في الامتثال مع المجلس الكندي للرعاية الحيوان المبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام حيوانات التجارب.

1. إعداد خزانات الجرعات، حلول، وإدارة الجدول الزمني

1. إعداد جدول زمني إدارة مثل تلك الحيوانات لا مداوي في نفس البيئة، وخلال نفس الوقت من اليوم لتجنب أي يفند من الوقت أو يتحامل للمؤثرات البصرية.
2. الحصول على أكبر عدد ممكن متطابقة، 1.5 L، واضحة خزانات البولي بروبلين وضع البيض كما الضرورية لعدد من الأحجام المجموعة. استخدام مجموعات من 8 الأسماك في الخزان، والذي يسمح لل2 مجموعات من الأسماك لفحصها يوميا في وقت لاحق في الإجراء (راجع الخطوة 3). استخدام واحد خزان وخزان واحد لكل مجموعة جرعات (2X عدد مجموعات).
   1. وضع 400 ميكرون إدراج وضع البيض في جميع الدبابات القابضة. Fسوء خزانات المياه مع الموائل أو المياه بالتناضح العكسي في درجة الحرارة الصحيحة (لالزرد، 25-28 ° C) يسكنون التي تنسجم مع الأسماك في درجة الحرارة عادة في.
      ملاحظة: يمكن أن يكون هناك تفاعلات كيميائية غير مرغوب فيها بين بعض العقاقير والمكونات الكيميائية للمياه البيئة مخزنة. في هذه الحالة، استخدام المياه التناضح العكسي مخزنة مع أملاح حوض السمك الحد الأدنى أو لا لإدارة المخدرات، وكذلك لمجموعات المراقبة.
   2. تأكد من أن الدبابات في بيئة محايدة لتجنب الأسماك تكييف للمؤثرات البصرية الخارجية خلال الجرعات.
3. تحضير محلول الدواء. تخلط كمية مناسبة من الدواء مع الماء الموائل في أحواض التبويض. تحضير محلول الإيثانول بنسبة 0.2٪ خلال الجمع بين 3 مل من الايثانول درجة عالية (95٪ من الإيثانول غير التشويه والتحريف) مع 1497 مل من الماء. تحضير محلول الإيثانول بنسبة 1.4٪ خلال الجمع بين 21 مل من الايثانول مع 1479 مل من الماء.

2. المعاوضة الأسماك وإتhanol إدارة الإجراءات

1. صافي بعناية الأسماك من الدبابات بيئتها ونقل إلى خزان المناسب الذي يحتوي على إدراج وضع البيض. من الناحية المثالية، بيت السمك في إدراج وضع البيض للقضاء على المعاوضة تماما.
2. مع كل الأسماك في خزانات كل منهما، ورفع بلطف وضع البيض تضاف من خزان ووضعه في خزان محلول الدواء المناسب (الشكل 1A).
   1. تسجيل الوقت الجرعات على النحو المطلوب. استخدام 30 دقيقة في محلول الإيثانول لهذا الإجراء هو موضح هنا.
   2. إذا أمكن ذلك، لدينا مساعدين مساعدة في نقل جميع المجموعات التجريبية إلى حل المخدرات في وقت واحد لضمان دقة الوقت الجرعات. بدلا من ذلك، ونقل مجموعة واحدة في وقت وتتبع مجموعات الفردية الجرعات مرات (الشكل 1A).
3. في نهاية الفترة الجرعات المطلوبة، وإزالة الأسماك من حل الإيثانول عن طريق رفع بعناية إدراج وضع البيضمن محلول الدواء ووضع بلطف مرة أخرى إلى خزان.
4. شبكة بلطف السمك في خزانات ووضعها مرة أخرى إلى موائلها حتى وقت الجرعة القادمة المقررة، أو مكان وضع البيض تضاف مرة أخرى إلى خزان للقضاء على المعاوضة.
5. كما ذكر سابقا، إن أمكن في إطار معايير المعدات الإسكان الحيوان، بيت الحيوانات في الدبابة نفسها وإدراج وضع البيض الذي يتم استخدام خزان. هذا سيقضي على المعاوضة تماما أثناء إجراء الإدارة.

3. اختبار السلوكي

1. الحصول على الضوء / الظلام الساحة 9.5 سم بنسبة 55 سم طويلة وعميقة 9.5 سم مع أرضية للماء الأبيض (الشكل 1B). يضعوا الأبيض والأسود للماء ورقة غير عاكسة على الجدران الداخلية للحلبة باستخدام فيلكرو، مع نصف الساحة مغطاة باللون الأبيض وغطت نصف باللون الأسود. ملء الساحة إلى عمق 5 سم بالماء الموائل في درجة حرارة 25-28 درجة مئوية. الصيانةعين درجة الحرارة هذه طوال الاختبار.
2. Minimalize المحفزات البصرية الخارجية من خلال بناء سياج ثلاثة جوانب البيضاء للساحة أن يقع فيه. تأكد منطقة الاختبار قد نشر الإضاءة العلوية التي لا تسبب انعكاسات على سطح الماء، ولكن هو مشرق لتتبع حركة البرمجيات، أو آخر بما فيه الكفاية -hoc الكمي اليدوي من صور الفيديو.
3. وضع الساحة في العلبة ووضع تسجيل وتحليل حركة المعلمات من تتبع سلوك البرامج. تعيين المدة محاكمة ل5-15 دقائق، اعتمادا على سؤال البحث.
   ملاحظة: هنا، كنا 5 دقائق.
4. نقل مجموعة من الأسماك لفحصها إلى منطقة الأبحاث في خزان الموائل ووضعها خارج العلبة الساحة. يتأقلم السمك لمدة 10 دقيقة.
5. صافي بلطف السمك من مجموعة ومكان المناسبة في مركز النور / الساحة المظلمة، ويجري التأكد من الافراج عن الأسماك عند وضعها بشكل مواز لمحور طويل من الساحة لآفومعرف يتحامل الأسماك إلى منطقة الضوء أو الظلام.
6. تبدأ السلوك التسجيل فورا بعد إصدارها الحيوان. مشاهدة اي مشاكل البرامج مع تتبع الأسماك أو القفز أو تجميد الأسماك. وتناوب على الساحة 180 درجة بعد أن تم اختبارها نصف من المواضيع لمنع أي يفند بسبب التحيزات الناجمة عن الموجه نهاية الساحة نحو نهاية مفتوحة من العلبة.
7. بعد المحاكمة قد انتهت، صافي بلطف وإزالة الأسماك من الساحة إلى خزان أو صهريج الموائل.

4. تحليل

1. دراسة الوقت المستغرق في ضوء مقابل المناطق المظلمة. لكل مجموعة ولكل الأسماك والحصول على الوقت النسبي الذي يقضيه في مناطق الضوء والظلام وتحليلها باستخدام عينة واحدة ر -test (أو وقعت اختبار Wilcoxon رتبة لبيانات اللامعلمية، الفرق من (نصف الوقت محاكمة الإجمالي) 150 ثانية) لتحديد ما إذا كانت مجموعات يفضلون بشكل كبير مجال واحد على الآخر.
2. مقارنة الأفضليات، حساب prefeمؤشر rence بطرح الوقت الذي يقضيه في المنطقة الخفيفة من الوقت الذي يقضيه في منطقة مظلمة ومقارنة الاختلافات بين المجموعات. تي الاختبارات يمكن استخدامها للمقارنة بين مجموعتين. مقارنة مجموعات متعددة مع تحليل التباين في اتجاه واحد باستخدام اختبار آخر HSD خاصة توكي حيث من الضروري (أو كروسكال-اليس اختبار مع المقارنة متعددة دان اللاحق لاختبار البيانات اللامعلمية).
3. مقارنة سرعة، عدد من التحولات منطقة، التعرجات، والجمود عبر مجموعات. استخدام تحليل التباين في اتجاه واحد باستخدام اختبار آخر HSD خاصة توكي حيث من الضروري (أو كروسكال-اليس اختبار مع المقارنة متعددة دان اللاحق لاختبار البيانات اللامعلمية).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

للحفاظ على الدقة والتحكم في الدراسات الدوائية مع الزرد من المهم أن الوقت مدة من إدارة الإيثانول باستمرار وبدقة على النحو المبين أعلاه. لدينا إجراءات يمكن أن تزيد من سهولة وسرعة إجراء الجرعات. أسفرت الإدارة من الايثانول إما على-حفلة أسبوعية أو يومية، الجدول الزمني ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد اعتمدت الدراسات السابقة التي تنطوي على إدارة المخدرات في الزرد ببساطة على المعاوضة الأسماك لنقلها من خزان منزلهم في حل المخدرات ^12،16. المعاوضة ليست دائما متسقة وغالبا ما يستغرق وقتا أطول مما كان متوقعا نظرا للاستجابة الهروب من الزرد، والذي تقلب فردي كبير. ط...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Three shelf benchtop housing system	Aquatic Habitats	N/A
1.5 L Spawning tank w/400 μm baffle	Aquatic Habitats	N/A
Pure Grain Ethanol	Luxco, INC	N/A
Ethovision XT Motion tracking software	Noldus Information Technology
Pipette	Eppendorf Canada
Light/Dark Arena	Custom		Construct as per procedure description. 9.5 cm wide, 9.5 cm deep, 55 cm long.