複数のゼブラフィッシュへの医薬品の新規方法（<em&gt;ゼブラフィッシュ</em&gt;）と撤退の定量

要約

A novel method for reducing variability when exposing fish to drugs is explained. Fish exposed to various patterns of ethanol exposure were found to have altered anxiety levels during withdrawal in a light/dark scototaxic assay.

要約

Anxiety testing in zebrafish is often studied in combination with the application of pharmacological substances. In these studies, fish are routinely netted and transported between home aquaria and dosing tanks. In order to enhance the ease of compound administration, a novel method for transferring fish between tanks for drug administration was developed. Inserts that are designed for spawning were used to transfer groups of fish into the drug solution, allowing accurate dosing of all fish in the group. This increases the precision and efficiency of dosing, which becomes very important in long schedules of repeated drug administration. We implemented this procedure for use in a study examining the behavior of zebrafish in the light/dark test after administering ethanol with differing 21 day schedules. In fish exposed to daily-moderate amounts of alcohol there was a significant difference in location preference after 2 days of withdrawal when compared to the control group. However, a significant difference in location preference in a group exposed to weekly-binge administration was not observed.

This protocol can be generalized for use with all types of compounds that are water-soluble and may be used in any situation when the behavior of fish during or after long schedules of drug administration is being examined. The light/dark test is also a valuable method of assessing withdrawal-induced changes in anxiety.

概要

ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ）は 、行動¹および医学研究^2,3ための有用なモデル生物であるインド発の小さな硬骨魚種である。ゼブラフィッシュは、一般に行動への影響を特徴付けるために、様々な薬理学的物質の試験において使用されている。薬物投与の様々な投与量およびスケジュールは、覚せい剤^4、抗不安⁵およびエタノール^6-8のような化合物の投与後のゼブラフィッシュの挙動を調査するために使用されてきた。

私たちの研究室はまた、一般scototaxicアッセイと呼ばれる、よく検証ダーク/ライトアッセイ^9、20にゼブラフィッシュ不安や歩行にエタノール投与の異なるスケジュールの影響を調査しました。エタノール投与の新しい方法は^、6時間の長い期間（21日間）にわたって反復、毎日の投与のための効率を高めるために開発されたまで。以前に使用された方法は実用的であったが、我々は、その関連する時間コストは、ネッティングを低減する方法を開発しようと、魚の大量の目的とする薬物の同時、正確に時限投与を可能にした。エタノールを用いた従来の研究では、ゼブラフィッシュは、1つのタンクからエタノールと水^10~12の適切な混合物を含む別に相殺され、転送される。この方法は広く受け入れられているが、ゼブラフィッシュを相殺すること導入し、薬物溶液から魚を除去するために要する時間のばらつきを増大させることができる。そのため、目的の化合物への正確な露出は反復投与を伴う実験の過程にわたって変化し得る。輸送時間の変動に起因する誤差の発生源を減少させる方法がが望ましい。私たちの方法では、我々はそれぞれの魚で同一の投与時間で、その結果、同時にすべての魚を移動することができます。 （ここで説明）エタノール曝露後、ゼブラフィッシュは、任意のnumbeにおいて試験することができる不安を評価するものも含めて行動アッセイ、のrを。新しいメソッドを使用して、魚のグループを投与すると、正確に被験者間や魚のグループ間での投与を複製し、標準化する能力を超え、実用用途があります。一度に複数の魚の追跡を可能にする新しいソフトウェアの出現は、研究者が実験に複製能と精度を確保するために、私たちの方法を利用することがあります。行動神経科学のためのモデル生物としてゼブラフィッシュの普及を考えると、この方法では、将来の薬理学的研究における効率性と実用性が向上します。

現在のパラダイムでは、反復投与スケジュールは、およそ人間の飲用スケジュールを反映していることを採用した。コントロール、毎日の中等度、または毎週-どんちゃん騒ぎ：魚を無作為に3つの群に割り当てた。投与スケジュールは、それが大幅に過去の研究⁷に露光時間を超えたため選ばれ、期間は21日であった。対照魚はゼロALCOを受けHOL、毎日の中等度の魚は1日1回、0.2％アルコールを受け、毎週-どんちゃん騒ぎの魚は、1週間に1回1.4％アルコールを受け取った。明/暗タスクが離脱の2日後に不安を評価した。これは、一方の側の壁が白色であり、他の側に⁹暗いする矩形アリーナを使用している管理するための比較的簡単な試験である。アダルトゼブラフィッシュは、ロバスト制御条件の下で^6,9,13アリーナのダークサイドを好む。不安の増大は、運用上、暗いゾーンで過ごしたかなり多くの時間として定義され、魚が光ゾーンで過ごした、比較的多くの時間を費やしている時に不安を想定することができます減少する。モーショントラッキングソフトウェアを使用すると、他の有益な変数も平均速度、不動、蛇行を含め、定量することができる、そしてゾーンは^14に移行^します。

我々の研究室で開発された投与方法は、水溶性化合物は、1つ以上のzebrafiに投与される任意の研究に適用することができるSH。この方法論から利益を得ることができる他の多くの薬理学的薬剤は、現在、ゼブラフィッシュで検証されています。一般的に試験された化合物は、エタノールと同様の方法で溶解させ、ニコチン、クロルジアゼポキシド、ブスピロン、およびスコポラミンが挙げられる。水に化学物質の適切な量を混合することによって。したがって、この手順の一般的な範囲ははるかに広いとエタノールに限定されるものではない。さらに、複数の日のための薬物を投与した後、明/暗タスクを使用することができる多くの行動試験の1つにすぎません。薬物投与後、または引き抜きの間、利用できる他の一般的なアッセイは新しいタンクダイビングテスト¹⁵など^16の浅水として社会的行動のテストが含まれています。次の手順を繰り返し、目的の薬理学的な化合物を含む溶液に魚や個々の魚のグループを転送する効率的な方法を概説します。さらに、明/暗テストとテスト不安のプロセスアルコール投与の長いスケジュールにさらさ​​れた後に撤退している魚のグループに説明する。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

すべての手順および行動試験は、実験動物の管理と使用のための動物ケアのガイドラインについては、カナダ人評議会に準拠しているプロトコル番号06-11-12、下マキュワン大学の動物実験倫理委員会によって承認された。

1.投与タンク、ソリューション、および投与スケジュールを準備

1. 動物は視覚刺激に時間やバイアスのいずれ交絡を避けるために、同じ環境で、一日の同じ時間の間に投与されるような投与スケジュールを準備します。
2. グループサイズの数に対して必要な限り多くの同一、1.5 L、明確なポリプロピレン産卵タンクを入手します。魚の2つのグループを可能にし、タンクあたり8魚の使用グループは手順で後述日あたりテストされる（ ステップ3を参照）。 1保持タンクやグループごとに1つの投与タンク（グループの2倍合計数）を使用します。
   1. すべての保持タンクに400μmの産卵インサートを置きます。 F病気生息水でタンクまたは温度魚と一致している（ゼブラフィッシュのため、25〜28℃）、正しい温度で逆浸透水は、通常に収容されている。
      注：一部の薬剤および緩衝生息水の化学成分間の望ましくない化学的相互作用が存在し得る。この状況では、逆浸透薬物投与のための最小または全く水槽塩で緩衝水、ならびに対照群のために使用する。
   2. タンクは、投薬時に外部視覚刺激にコンディショニングの魚を避けるために、中立的な環境であることを確認します。
3. 薬液を準備します。産卵タンクで生息地の水と適切な量の薬剤を混ぜる。水1497ミリリットルでハイグレードのエタノール（95％非変性エタノール）の3ミリリットルを組み合わせることにより、0.2％エタノール溶液を調製します。水1479ミリリットルとエタノール21ミリリットルを組み合わせることにより、1.4％エタノール溶液を調製します。

2.ネッティング魚、そしてEthanol管理手順

1. 慎重にネット生息タンクから魚や産卵挿入物を含む適切な保持タンクに移す。理想的には、産卵中の家の魚は完全にネッティングを排除するために挿入します。
2. それぞれの保持タンク内のすべての魚と、優しく保持タンクの外に挿入し、適切な薬液タンク（ 図1A）にそれを置いて産卵を持ち上げる。
   1. 必要に応じて、投与時間を記録します。ここで説明する手順のためのエタノール溶液に30分を使用してください。
   2. 可能な場合、アシスタントは、正確な投薬時間を確保すると同時に薬液を全ての実験群の転送を支援している。代替的に、一度に1つのグループを転送し、個々のグループの投薬回数（ 図1A）を追跡する。
3. 必要な投与期間の終わりに、慎重に産卵インサートを持ち上げることにより、エタノール溶液から魚を外す薬液のうち、背面保持タンクに優しく置く。
4. 優しくネット保持タンク内の魚や次回のスケジュール、投与時まで戻って自分の生息地にそれらを配置するか、産卵を配置ネッティングを排除するために戻って保持タンクに挿入します。
5. 動物の住宅設備機器、住宅貯蔵タンクとして使用されているものと同じタンクと産卵インサートにおける動物のパラメータの範囲内で以前に、可能な場合に述べたように。これは投与手順の間に完全にネッティングがなくなります。

3.行動試験

1. 長い55センチメートルと白の防水床（ 図1B）との深い9.5センチメートル9.5センチ幅の明/暗アリーナを取得します。黒で覆われた白と半分に覆われたアリーナの半分で、マジックテープを使用して、アリーナの内壁に白と黒の防水無反射紙を貼る。 25-28℃の温度で、生息地の水で5cmの深さにアリーナを埋める。通販テスト全体でこの温度をAINの。
2. アリーナ内に位置されるためには、白三面囲いを構築することにより、外部視覚刺激をMinimalize。テストエリアが水面上に反射を起こさない頭上の照明を拡散持って、まだ十分に運動追跡ソフトウェア、またはポストのために明るいあることを確認してくださいビデオ画像から-hoc手動定量。
3. エンクロージャにアリーナを置き、行動追跡ソフトウェアの記録と運動解析パラメータを設定します。研究課題に応じて、5〜15分までの試用期間を設定します。
   注：ここでは、5分を使用していました。
4. 魚の群が生息タンク内の研究領域にテスト​​される輸送し、アリーナエンクロージャの外に配置します。 10分間の魚を順応さ。
5. 明/暗アリーナの中央に該当するグループと場所から静かにネット魚は、AVOするアリーナの長軸に平行に配置されたとき、魚を解放することを確認され光や暗いゾーンに魚をバイアスするID。
6. 動物が解放された直後に記録動作を開始します。魚を追跡または魚のジャンプや凍結のための任意のソフトウェアの問題を監視します。被験者の半数に起因アリーナの端が筐体の開口端に向かって配向されているから生じる偏見にどんな交絡を防ぐためにテストされた後に、アリーナを180°回転させます。
7. 裁判の後、終了優しくネットと保持タンクや生息地のタンクにアリーナから魚を削除しています。

4.分析

1. ダークゾーンに対する光の中で費やされた時間を調べます。グループごとに、それぞれの魚、光と闇のゾーンで過ごした相対的な時間を得て、1 標本t -test使用して分析する（またはウィルコクソンをノンパラメトリックデータのための順位検定を締結し、総試行時間の（半分）150秒との違い）グループは大幅に他の上の1つの領域を好むかどうかを判断する。
2. 環境設定を比較するには、prefeを計算暗いゾーンで過ごした時間からの光帯に過ごし、群間の差を比較する時間を減算することによりrenceインデックス。 のt-試験は、2つのグループを比較するために使用され得る。 TukeyのHSDポストホックテスト、必要な場合（ノンパラメトリックデータ用またはクラスカル·ワリス検定Dunnの多重比較ポストホック付きテスト）を利用した一元配置分散分析で複数のグループを比較してください。
3. 速度、ゾーン遷移の数、蛇行、およびグループ間で不動の比較。 TukeyのHSDポストホック検定を用いた一元配置分散分析を使用して、必要に応じて（Dunnの多重比較、ノンパラメトリックデータのための事後検定又はクラスカル·ワリス検定）。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

上記のようにゼブラフィッシュと薬理学的研究の精度および制御を維持するためには、一貫して正確にエタノール投与の持続時間が重要である。我々の手順では、投与手順の容易性とスループットを向上させることができる。毎週-過食や毎日の中等度のスケジュールのいずれかに対するエタノールの投与は、対照と比較して、明/暗テストで測定し、変化した不安レベルをもたらした。二日?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

ゼブラフィッシュにおける薬剤投与を伴う以前の研究では、単純に薬物溶液^12,16に自宅タンクからそれらを輸送するために魚をネッティングに頼ってきた。ネッティングは常に一貫していないとしばしばかなりの個体差があるゼブラフィッシュの逃避応答に予想よりも時間がかかります。伝統的な転送方法は、有用ではあるが、魚が水の外に費やす合計時間を減少させるだけでなく、...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Three shelf benchtop housing system	Aquatic Habitats	N/A
1.5 L Spawning tank w/400 μm baffle	Aquatic Habitats	N/A
Pure Grain Ethanol	Luxco, INC	N/A
Ethovision XT Motion tracking software	Noldus Information Technology
Pipette	Eppendorf Canada
Light/Dark Arena	Custom		Construct as per procedure description. 9.5 cm wide, 9.5 cm deep, 55 cm long.