Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

Abstract

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called “cancer stem cells” (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

Introduction

There is increasing evidence that ovarian carcinomas are comprised of heterogeneous mixtures of cells and harbor so-called “cancer stem cells” (CSCs) responsible for disease initiation, maintenance and relapse after conventional cytotoxic therapies1-3. Therefore, the development of molecular strategies targeting ovarian CSCs is an important goal and promises to improve the therapy of ovarian cancer patients.

A pre-requisite for the understanding of the molecular features of CSCs is their reliable isolation from the non-CSCs. However, identification of ovarian CSCs appears challenging. While CD133 expression and aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity4,5 have been reported to mark ovarian CSCs, some data indicate that these markers are unstable6. Consistently, in ovarian cancer, other than for example in breast carcinoma7, expression of ALDH1 associates with favorable outcome8 and expression of the proposed stem cell marker CD44 variant has no prognostic value9. More recently, we have shown that expression of the embryonic stem cell protein SOX2 confers stemness to ovarian carcinoma cells10 and high SOX2 expression associates with clinically aggressive ovarian and breast carcinomas11,12. Therefore, in this report we use a lentiviral reporter construct containing a red fluorescence protein (RFP) whose expression is controlled by a SOX2 regulatory region, as a method to isolate putative ovarian CSCs.

By definition, CSCs can both self-renew and differentiate, giving rise to all tumor cell types. Putative CSC populations need to be analyzed in functional assays performed in vivo. For obvious reasons, in human cells such functional tests are confined to xenograft assays, comprising mostly transplantation of human tumor cells into immuno-compromised mice10,13.

An alternative in vitro method was offered by Brent Reynolds and Sam Weiss who firstly reported the so-called neurosphere assay as a surrogate assay evaluating stem potential in neural cells14. Dontu and colleagues later confirmed the use of this assay for evaluation of stem cell potential in breast cells15,16. Here, human mammary cells were plated in different numbers in serum-free medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), B-27 and heparin and cultured under non-adherent conditions for seven to ten days before sphere formation was scored by microscopy. Following this protocol with some adjustments in cell numbers, growth medium and supplements, several groups have explored in vitro stem cell potential from several cancer types such as breast17, brain18, pancreas19 and colon20 tumors. In ovarian carcinoma, we have recently reported feasibility of the spheres assay and compared its results to those collected in in vivo murine xenograft models10. We found that overexpression of the stem cell protein SOX2 enhanced both in vitro sphere formation as well as in vivo tumorigenicity of human ovarian carcinoma cells10. However, the frequency of sphere-initiating cells was higher than the frequency of tumor-initiating cells measured in vivo10 suggesting that either the sphere assay may lead to false positive results due to technical reasons or, alternatively, the in vivo assay may be inefficient and result in false negative results.

In this report, we analyze multi cell-based ovarian spheres assays in more detail, review the different protocols available in the literature and compare them to a single cell-based assay. We show that the single cell-based assay provides more accurate and reproducible results than multi cell-based assays, which can be highly influenced by the density of plated cells unless methylcellulose is added to the cultures to immobilize cells. However, also in single cell-based assays, in vitro sphere-initiating potential is observed at higher frequency than in vivo tumor-initiating potential.

Protocol

1. توليد OVCAR-3 خلايا سرطان المبيض الإنسان Transduced ستابلي مع Lentiviruses احتواء مراسل تعبيد SOX2 منطقة تنظيم

  1. توليد جزيئات lentiviral عليها بنقل خط خلية 293T التعبئة والتغليف HEK مع بناء مراسل الاعتراف المنطقة التنظيمية SOX2 كما هو موضح 10،21.
    ملاحظة: المراسل بناء مزيد يحتوي على نطاق زعزعة استقرار نظام الدرع ProteoTuner قبل البروتين tdTomato مضان. Shield1 يربط إلى المجال زعزعة الاستقرار وبالتالي منع proteasome وأن تتحلل البروتين مضان 22.
  2. تنبيغ OVCAR-3 الخلايا مع جزيئات lentiviral على مدى فترة زمنية من 24 ساعة. بعد ذلك، إزالة طاف الفيروسي وغسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ومثقف في المتوسط ​​كاملة (RPMI تستكمل مع 10٪ FBS، و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين).
  3. بعد 48 ساعة، 10 ميكروغرام / مل بوروأضيفت mycin إلى الثقافات والحفاظ لمدة 5 أيام للسماح للاختيار من خلايا transduced بشكل صحيح.

2. إعداد الفرز خلية والتصفيحات

  1. إضافة Shield1 في 1: 1،000 التخفيف 24 ساعة قبل الفرز الخلية. استخدام transduced ستابلي OVCAR-3 خلايا بدون علاج Shield1 والضوابط السلبية (الشكل 1). وسائل الإعلام نضح من القارورة، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X ويعرض للتريبسين الخلايا مع 0.05٪ التربسين-EDTA لمدة 3 دقائق.
  2. وقف التربسين باستخدام المتوسطة كاملة (انظر أعلاه)، عد أعداد الخلايا، والخلايا الطرد المركزي في 300 x ج في RT (15-25 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.
  3. طاف صب وResuspend الخلايا بعناية في 0،5-1 مل PBS العقيمة.
  4. استخدام 40 ميكرون الغطاء مصفاة الخلية مرشح للحصول على تعليق وحيد الخلية.
  5. ضبط عدد الخلايا إلى 5 مليون خلية لكل مليلتر.
  6. إعداد-مرفق منخفض لوحات 96-جيدا جدا مع 100 ميكرولتر المجالات المتوسطة (MEGM تستكمل مع عوامل النمو، السيتوكينات، والمكملات الغذائية،B-27، heparine الصوديوم. أو DMEM / F12 تستكمل مع عوامل النمو، السيتوكينات، والمكملات الغذائية، B-27، heparine الصوديوم مع أو بدون إضافة 1٪ ميثيل، انظر أيضا الجدول 1). اختياريا إضافة المضادات الحيوية إلى متوسطة بتركيز 100 U / مل البنسلين و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين للحد من مخاطر التلوث ممكن.
  7. نوع طلب تقديم العروض + والخلايا RFP- إلى إعداد لوحات 96-جيدا من فوق (1)، خلية لكل بئر (وحيد خلية القاعدة مجالات الفحص) و 100 خلايا لكل بئر (متعدد المجالات خلية القاعدة فحص)، على التوالي. أداء فارز خلية نوع على المتاحة تجاريا (انظر المواد) باستخدام طريقة واحدة الخلية، وترتيب الإعداد: 100 μ فوهة، غمد ضغط 20 رطل، والعائد قناع 0، قناع نقاء 32، قناع المرحلة 16.
  8. تقييم كفاءة الطلاء بتسجيله مجهريا الآبار التي تحتوي على الخلايا (للمقايسة على أساس وحيد الخلية) وعن طريق عد الأرقام خلية في الآبار الفردية (للفحص متعددة القائم على الخلية؛ الشكل 2 ).
  9. احتضان الخلايا تحت الظروف القياسية في المجالات المتوسطة (للتكوين راجع الخطوة 2.6) عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. الملحق اليومي bFGF (20 نانوغرام / مل)، وEGF (20 نانوغرام / مل).
  10. بعد أسبوع واحد، عد الأرقام من المجالات الناشئة الورم باستخدام مجهر القياسية مع 4X أو 10X التكبير ومضان المجهر للكشف عن إشارة مضان من النظام مراسل متكامل. عدد المجالات التي يبلغ قطرها تتجاوز 100 ميكرون كما المجالات "كبيرة"، والمجالات التي يبلغ قطرها 50-100 ميكرون كما المجالات "صغيرة" (الشكل 3). تأكد من أن كنت تعول المجالات حقيقية وليست الخلية مجموعات.
    ملاحظة: في المقايسات القائم على خلية واحدة تشكيل المجال هو أسهل ليسجل مجهريا بعد 10 (مقابل 7) أيام من الثقافة.
  11. حساب نسبة الخلايا المكونة المجال في RFP + والخلايا RFP- على التوالي في المقايسات القائم على خلية واحدة (واحد لوحة 96-جيدا لكل تجربة فردية) أو متعددة الخلية بامجالات المقايسات سد (بئر واحدة لكل تجربة فردية) على النحو الذي عرضه شو وآخرون (16).
    ملاحظة: نسبة المجال تشكيل الخلايا (٪) = (عدد من المجالات) / (عدد الخلايا المصنف) × 100

3. الركض المسلسل من المجالات

  1. وضع محتوى كل بئر في أنبوب معقم مناسب وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. لخلية القاعدة متعددة المجالات المقايسات، وجمع معا المجالات من بئر واحد. يغسل جيدا 3-5 مرات مع برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي 2 دقيقة لفترة أطول. لالقائم على خلية واحدة المجالات المقايسات، وجمع المجالات الفردية. نظرا لانخفاض عدد الخلايا، استخدام 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي وغسل الخطوات.
  2. إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر من 0.05٪ التربسين-EDTA.
  3. من أجل تحقيق فصل الخلية الأمثل، واحتضان تعليق خلية عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في شاكر لينة. تحسين trypsinization الوقت لخط الخلية لانخفاض معدل موت الخلايا: إذا لم كبيرةمجالات هي يسحن مرئية بلطف باستخدام ماصة غيض 100 ميكرولتر. في حالة مجالات كبيرة لا تزال موجودة، واحتضان مع التربسين 3 دقائق أخرى ثم انتقل إلى الخطوة سحن. في حالة واحدة المقايسات خلية مقرها تأكد لتحسين العائد الوقت لخلية الأمثل للخلايا الحية خلال الخطوة trypsinization.
  4. لإبطال نشاط التربسين، إضافة 500 ميكرولتر المتوسطة كاملة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة، في حالة المقايسات خلية واحدة، الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة إضافية.
  5. إزالة الخلايا طاف و resuspend بعناية في المجالات المتوسطة.
  6. استخدام 40 ميكرون الغطاء مصفاة الخلية مرشح للحصول على تعليق وحيد الخلية.
  7. في حالة استخدام RFP + والخلايا RFP- في المقايسات bassed خلية متعددة، وتقييم نسبة الخلايا الفلورسنت في كل إعادة تعليق جيدا بعد عن طريق تدفق عداد الكريات التحليل.
  8. لفحوصات replating المسلسل من الخلايا واحد، والبذور 1 خلية لكل بئر في فائقة مرفق منخفض لوحة 96-جيدا جديدة أعدت على النحو المفصل أعلاه. من مجال واحد على حدة، البذور حوالي 20 بئرا الفردية. لفحوصات replating من خلية القاعدة الأجواء الأولية متعددة، وخلايا البذور التي تم الحصول عليها من بئر واحدة من المجالات الرئيسية في جديدة لوحة 96 جيدا والعد أعداد الخلايا اليوم التالي بواسطة المجهر.
  9. تقييم نسبة الخلايا المكونة المجال في المجالات الثانوية فحوصات باستخدام الصيغة هو موضح في الخطوة 2.11.

4. تحليل النتيجة

  1. تحليل النتائج من التجارب التي أجريت في يثلث مستقلة واستخدام الطلاب على الوجهين في اختبار t لتحليل القيم وزعت بشكل طبيعي وغير ذلك مان ويتني-اختبارات التحليل الإحصائي.

النتائج

في المجالات المقايسات التقليدية، وقدم ما يقرب من 40٪ من RFP + OVCAR-3 خلايا مقابل 20٪ من خلايا RFP- الارتفاع إلى مجال الأورام الفردية في المجالات الأساسي فحص (الشكل 4A). وعلاوة على ذلك، كانت المجالات التي شكلتها RFP + خلايا أكبر حجما من تلك التي شكلتها خلايا RFP-.

Discussion

المجالات الثقافات هي طريقة تستخدم على نطاق واسع لفحص سرطان الخلايا الجذعية إمكانيات وإثراء للخلايا الجذعية التي تشبه في مجموعة واسعة من الخلايا السرطانية البشرية 15،25،26. في ظل هذه الظروف والثقافة، ومن المتوقع أن يفرق والخضوع في النهاية موت الخلايا الخلايا الس...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was supported by a grant from the Baden-Württemberg Stiftung (Adult Stem Cells Program II) awarded to C.L. We thank Dr. Martina Konantz for critical input and review of the manuscript. We thank Emmanuel Traunecker and Toni Krebs from the DBM FACS Facility (University Hospital Basel) for assistance with FACS sorting.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Material/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
low-Attachment-plate Corning3474
MEGMLonzaCC-3151
InsulinLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
HydrocortisonLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
EGFLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
EGFSigmaE9644end concentration: 20 ng/ml
FGFPeproTech100-18Bend concentration: 20 ng/ml
B-27Invitrogen/ Gibco17504-044end concentration: 1x
Heparin-Natrium-25000 IERatiopharmN68542.02dilution 1:1000
Pen/StrepGibco15140-122
FCS Gibco10500-064
RPMI 1640Gibco21875-034
Trypsin-EDTA Gibco25300-054
Dulbecco’s PBS (1x)Gibco14190-094
Shield1 Clontech632189dilution 1:1000
DMEM/F12Gibco21041-025
DMEM/F12 (powder)Gibco42400-010
Methyl celluloseSigmaM0387
Puromycin dihydrochlorideapplichemA2856
cell sorter BDAria III cell sorter 
FACS analyserBDaccuri c6 flow cytometer
microscopeOlympus IX50 Osiris

References

  1. Pardal, R., Clarke, M. F., Morrison, S. J. Applying the principles of stem-cell biology to cancer. Nat Rev Cancer. 3 (12), 895-902 (2003).
  2. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
  3. Ahmed, N., Abubaker, K., Findlay, J. K. Ovarian cancer stem cells: Molecular concepts and relevance as therapeutic targets. Mol Aspects Med. 39, 110-125 (2014).
  4. Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71 (11), 3991-4001 (2011).
  5. Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130 (1), 29-39 (2012).
  6. Stewart, J. M., et al. Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (16), 6468-6473 (2011).
  7. Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
  8. Chang, B., et al. ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers. Mod Pathol. 22 (6), 817-823 (2009).
  9. Cannistra, S. A., et al. CD44 variant expression is a common feature of epithelial ovarian cancer: lack of association with standard prognostic factors. J Clin Oncol. 13 (8), 1912-1921 (1995).
  10. Bareiss, P. M., et al. SOX2 expression associates with stem cell state in human ovarian carcinoma. Cancer Res. 73 (17), 5544-5555 (2013).
  11. Pham, D. L., et al. SOX2 expression and prognostic significance in ovarian carcinoma. Int J Gynecol Pathol. 32 (4), 358-367 (2013).
  12. Lengerke, C., et al. Expression of the embryonic stem cell marker SOX2 in early-stage breast carcinoma. BMC Cancer. 11, 42 (2011).
  13. Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
  14. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
  15. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  16. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  17. Leis, O., et al. Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells. Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).
  18. Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
  19. Wang, Y. J., Bailey, J. M., Rovira, M., Leach, S. D. Sphere-forming assays for assessment of benign and malignant pancreatic stem cells. Methods Mol Biol. 980, 281-290 (2013).
  20. Li, Y. F., Xiao, B., Tu, S. F., Wang, Y. Y., Zhang, X. L. Cultivation and identification of colon cancer stem cell-derived spheres from the Colo205 cell line. Braz J Med Biol Res. 45 (3), 197-204 (2012).
  21. Wu, F., et al. Identification of two novel phenotypically distinct breast cancer cell subsets based on Sox2 transcription activity. Cell Signal. 24 (11), 1989-1998 (2012).
  22. Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
  23. Kawase, Y., Yanagi, Y., Takato, T., Fujimoto, M., Okochi, H. Characterization of multipotent adult stem cells from the skin: transforming growth factor-beta (TGF-beta) facilitates cell growth. Exp Cell Res. 295 (1), 194-203 (2004).
  24. Walia, V., et al. Loss of breast epithelial marker hCLCA2 promotes epithelial-to-mesenchymal transition and indicates higher risk of metastasis. Oncogene. 31 (17), 2237-2246 (2012).
  25. Leung, E. L., et al. Non-small cell lung cancer cells expressing CD44 are enriched for stem cell-like properties. PLoS One. 5 (11), e14062 (2010).
  26. Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16281-16286 (2009).
  27. Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42 (9), 593-602 (2010).
  28. Wang, H., Zhang, Y., Du, Y. Ovarian and breast cancer spheres are similar in transcriptomic features and sensitive to fenretinide). Biomed Res Int. 2013, 510905 (2013).
  29. Du, Y. R., et al. Effects and mechanisms of anti-CD44 monoclonal antibody A3D8 on proliferation and apoptosis of sphere-forming cells with stemness from human ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer. 23 (8), 1367-1375 (2013).
  30. Xiang, T., et al. Interleukin-17 produced by tumor microenvironment promotes self-renewal of CD133 cancer stem-like cells in ovarian cancer. Oncogene. , (2013).
  31. Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems. Oncol Rep. 23 (5), 1277-1284 (2010).
  32. Soritau, O., et al. Enhanced chemoresistance and tumor sphere formation as a laboratory model for peritoneal micrometastasis in epithelial ovarian cancer. Rom J Morphol Embryol. 51 (2), 259-264 (2010).
  33. Shi, M. F., et al. Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line. Cell Mol Life Sci. 67 (22), 3915-3925 (2010).
  34. Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68 (11), 4311-4320 (2008).
  35. Liang, D., et al. The hypoxic microenvironment upgrades stem-like properties of ovarian cancer cells. BMC Cancer. 12, 201 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

95 SOX2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved