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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

Zusammenfassung

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called “cancer stem cells” (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

Einleitung

There is increasing evidence that ovarian carcinomas are comprised of heterogeneous mixtures of cells and harbor so-called “cancer stem cells” (CSCs) responsible for disease initiation, maintenance and relapse after conventional cytotoxic therapies1-3. Therefore, the development of molecular strategies targeting ovarian CSCs is an important goal and promises to improve the therapy of ovarian cancer patients.

A pre-requisite for the understanding of the molecular features of CSCs is their reliable isolation from the non-CSCs. However, identification of ovarian CSCs appears challenging. While CD133 expression and aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity4,5 have been reported to mark ovarian CSCs, some data indicate that these markers are unstable6. Consistently, in ovarian cancer, other than for example in breast carcinoma7, expression of ALDH1 associates with favorable outcome8 and expression of the proposed stem cell marker CD44 variant has no prognostic value9. More recently, we have shown that expression of the embryonic stem cell protein SOX2 confers stemness to ovarian carcinoma cells10 and high SOX2 expression associates with clinically aggressive ovarian and breast carcinomas11,12. Therefore, in this report we use a lentiviral reporter construct containing a red fluorescence protein (RFP) whose expression is controlled by a SOX2 regulatory region, as a method to isolate putative ovarian CSCs.

By definition, CSCs can both self-renew and differentiate, giving rise to all tumor cell types. Putative CSC populations need to be analyzed in functional assays performed in vivo. For obvious reasons, in human cells such functional tests are confined to xenograft assays, comprising mostly transplantation of human tumor cells into immuno-compromised mice10,13.

An alternative in vitro method was offered by Brent Reynolds and Sam Weiss who firstly reported the so-called neurosphere assay as a surrogate assay evaluating stem potential in neural cells14. Dontu and colleagues later confirmed the use of this assay for evaluation of stem cell potential in breast cells15,16. Here, human mammary cells were plated in different numbers in serum-free medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), B-27 and heparin and cultured under non-adherent conditions for seven to ten days before sphere formation was scored by microscopy. Following this protocol with some adjustments in cell numbers, growth medium and supplements, several groups have explored in vitro stem cell potential from several cancer types such as breast17, brain18, pancreas19 and colon20 tumors. In ovarian carcinoma, we have recently reported feasibility of the spheres assay and compared its results to those collected in in vivo murine xenograft models10. We found that overexpression of the stem cell protein SOX2 enhanced both in vitro sphere formation as well as in vivo tumorigenicity of human ovarian carcinoma cells10. However, the frequency of sphere-initiating cells was higher than the frequency of tumor-initiating cells measured in vivo10 suggesting that either the sphere assay may lead to false positive results due to technical reasons or, alternatively, the in vivo assay may be inefficient and result in false negative results.

In this report, we analyze multi cell-based ovarian spheres assays in more detail, review the different protocols available in the literature and compare them to a single cell-based assay. We show that the single cell-based assay provides more accurate and reproducible results than multi cell-based assays, which can be highly influenced by the density of plated cells unless methylcellulose is added to the cultures to immobilize cells. However, also in single cell-based assays, in vitro sphere-initiating potential is observed at higher frequency than in vivo tumor-initiating potential.

Protokoll

1. Erzeugung von OVCAR-3 Human Ovarialkarzinomzellen Stabil mit Lentiviren Beinhaltet den SOX2 Regulatory Region Reporterkonstrukt Transduzierte

  1. Generieren lentivirale Partikel durch Transfizieren der HEK 293T-Verpackungszelllinie mit einem Reporter-Konstrukt Erkennen eines SOX2 regulatorische Region, wie beschrieben 10,21.
    HINWEIS: Die Reporter-Konstrukt weiterhin enthält eine Destabilisierung Domäne des ProteoTuner Schild-System vor dem tdTomato fluoreszierendes Protein. Shield1 bindet zur Destabilisierung Domäne wodurch das Proteasom, das Fluoreszenzprotein 22 abbauen zu verhindern.
  2. Transduzieren OVCAR-3-Zellen mit lentivirale Partikel über einen Zeitraum von 24 Stunden. Danach das Virusüberstand und die Zellen werden mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und in komplettem Medium (RPMI, ergänzt mit 10% FBS, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin).
  3. 48 Stunden später wurden 10 ug / ml puromycin wurden zu den Kulturen zugegeben und für 5 Tage gehalten, um die Auswahl richtig transduzierten Zellen zu ermöglichen.

2. Herstellung der Zellsortierung und Oberflächen

  1. Fügen Shield1 bei 1: 1.000-Verdünnung 24 Stunden vor der Zellsortierung. Verwenden stabil transduzierten OVCAR-3-Zellen ohne Shield1 Behandlung als negative Kontrollen (Figur 1). Absaugen Medien aus Kolben, waschen Sie die Zellen mit 1 × PBS und trypsinieren Zellen mit 0,05% Trypsin-EDTA für 3 min.
  2. Stoppen Trypsin unter Verwendung Vollmedium (siehe oben), zu zählen Zellzahlen Zentrifuge Zellen bei 300 · g bei RT (15 - 25 ° C) für 5 min.
  3. Dekantieren und resuspendieren Zellen vorsichtig in 0,5-1 ml sterilem PBS.
  4. Verwenden Sie 40 um Zellsieb Kappe Filter auf Einzelzellsuspension zu erhalten.
  5. Passen Zellzahl von 5 Millionen Zellen pro ml.
  6. Bereiten ultra low-Befestigungsplatten mit 96 Vertiefungen mit 100 & mgr; l Kugeln Medium (MEGM ergänzt mit Wachstumsfaktoren, Cytokine und Ergänzungen,B-27, Heparin-Natrium; oder DMEM / F12 mit Wachstumsfaktoren, Cytokine und Ergänzungen, B-27, Heparin-Natrium mit oder ohne Zugabe von 1% Methylcellulose ergänzt, siehe auch Tabelle 1). Gegebenenfalls Antibiotika, hinzugefügt werden zu dem Medium in einer Konzentration von 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin, um das Risiko einer möglichen Kontamination minimieren.
  7. Sortieren RFP + und RFP- Zellen in vorbereitete Platten mit 96 Vertiefungen von oben, 1 Zelle pro Vertiefung (Einzelzellbasis Kugeln Assay) und 100 Zellen pro Vertiefung (multi zellbasierten Assay Kugeln) sind. Führen Art auf handelsüblichen Zellsortierer (siehe Materialien) mit Einzelzellenmodus, Setup Sortieren: 100 μ Düse, Manteldruck 20 psi und Ertrags Maske 0, Reinheit Maske 32, Phasenmaske 16.
  8. Beurteilen Plattierungseffizienz von mikroskopisch scoring Vertiefungen mit Zellen (für die einzelnen Assays auf Zellbasis) und durch Zählen der Zellzahlen in einzelnen Vertiefungen (für die Mehr Assay auf Zellbasis, Figur 2 ).
  9. Zellen unter Standardbedingungen in Bereichen mittlerer inkubieren (Zusammensetzung siehe Schritt 2.6) bei 37 ° C und 5% CO 2. Ergänzung täglich bFGF (20 ng / ml) und EGF (20 ng / ml).
  10. Nach einer Woche zählen Anzahl von Schwellentumorsphären mit einem Standard-Mikroskop mit 10-facher Vergrößerung oder 4X und einem Fluoreszenzmikroskop zur Fluoreszenzsignal von der integrierten Reportersystem zu erkennen. Graf Kugeln mit einem Durchmesser von mehr als 100 um als "große" Kugeln und Kugeln mit einem Durchmesser von 50 bis 100 um, wie "klein" Kugeln (Abbildung 3). Achten Sie darauf, dass Sie echte Kugeln zu zählen und Cluster nicht zell.
    HINWEIS: In einzelnen Assays auf Zellbasis Kugelbildung ist einfacher zu mikroskopisch nach 10 (Vergleich 7) Tagen Kultur erzielen.
  11. Berechnen des Anteils der Kugel bildenden Zellen in RFP + bzw. RFP- Zellen in einzelnen Assays auf Zellbasis (eine Platte mit 96 Vertiefungen für jedes einzelne Experiment) oder Mehrfachzelle-baSED Kugeln Assays (Eine Vertiefung für jedes einzelne Experiment), wie von Shaw et al. 16
    HINWEIS: Anteil der Kugel bildenden Zellen (%) = (Anzahl der Kugeln) / (Zahl der ausgesäten Zellen) × 100

3. Serien Passagieren von Kugeln

  1. Platzieren Sie den Inhalt jedes Wells in einer geeigneten sterilen Röhrchen und zentrifugiert bei 300 g für 10 min bei RT. Bei mehrzellbasierten Assays Kugeln, sammeln gemeinsam die Kugeln von einem gut. Mit PBS und zentrifugieren 2 Minuten mehr 5 Mal - Waschen Sie die gut 3. Für einzelne zellbasierten Assays Kugeln, sammeln einzelnen Kugeln. Aufgrund der geringen Anzahl von Zellen, verwendet 1,5 ml Röhrchen für Zentrifugation und Waschschritten.
  2. Überstand abnehmen und das Pellet erneut in 200 & mgr; l von 0,05% Trypsin-EDTA.
  3. Um ein optimales Zelltrennung zu erreichen, Inkubation der Zellsuspension bei 37 ° C für 5 min in einem weichen Schüttler. Optimieren Trypsinierung Zeit für Ihre Zelllinie zu niedrigeren Zellsterberate: wenn keine großenSphären sichtbar verreiben vorsichtig mit einem 100 ul Pipettenspitze. Im Fall sind große Kugeln noch vorhanden, Inkubation mit Trypsin weitere 3 min und dann dem Verreiben Schritt. Bei Einzelzellbasierte Assays stellen Sie sicher, um die Zeit für eine optimale Zellausbeute von lebenden Zellen während der Trypsinierung Schritt optimieren.
  4. Um das Trypsin zu inaktivieren, 500 & mgr; l vollständiges Medium und Zentrifugation bei 300 g für 10 min, im Falle der Einzelzellassays Zentrifuge für weitere 2 min.
  5. Überstand entfernen und resuspendieren Zellen vorsichtig in Sphären Medium.
  6. Verwenden Sie eine 40 um Zellsieb Kappe Filter, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
  7. In dem Fall der Verwendung RFP + und RFP- Zellen in Mehrzellen bassed Assays beurteilt den Prozentsatz der fluoreszierenden Zellen in jeder Vertiefung nach Resuspendierung über Durchflusszytometer Analyse.
  8. Für serielle replating Tests von Einzelzellen, Samen 1-Zelle pro Vertiefung in eine neue Ultra-Low-Befestigung Platte mit 96 Vertiefungen hergestellt, wie oben beschrieben. Von einer einzelnen Kugel, Saatgut rund 20 Einzelbecken. Für replating Tests von Multi zellbasierten Primär Kugeln, von einem gut von primären Sphären erhalten Samenzellen in eine neue Platte mit 96 Vertiefungen und zählen Sie die Zellzahl am nächsten Tag durch Mikroskopie.
  9. Beurteilung der Anteil der Kugel bildenden Zellen in der Sekundärkugeln Tests unter Verwendung des in Schritt 2.11 beschriebenen Formel.

4. Ergebnis-Analyse

  1. Analysieren Ergebnisse von Experimenten in unabhängigen dreifach durchgeführt und mit zweiseitigen Student-t-Test, um normal verteilt Werte und ansonsten Mann-Whitney-Tests für die statistische Analyse zu untersuchen.

Ergebnisse

Bei herkömmlichen Sphären Assays fast 40% der RFP + OVCAR-3-Zellen gegenüber 20% der RFP- Zellen führte zu einer individuellen Tumorbereich in der primären Kügelchen Assay (4A). Darüber hinaus waren die Bereiche, die durch RFP + Zellen gebildet Größe als die RFP- Zellen größer ausgebildet.

Beim Betrieb in Tests auf Zellbasis überzogen, RFP + Zellen ebenfalls gebildet mehr Kugeln als RFP- Zellen bestätigt die obigen Ergebnisse. Allerdings gab es eine Tendenz zur ...

Diskussion

Spheres Kulturen sind eine weit verbreitete Methode, um zu untersuchen Krebsstammzellpotential und bereichern für stielartigen Zellen in einer breiten Palette von menschlichen Tumorzellen 15,25,26. Unter diesen Kulturbedingungen werden die Krebszellen, die Selbsterneuerung Fähigkeit fehlt voraussichtlich zu differenzieren und schließlich Zelltod. Obwohl sie zunächst bilden Zellhaufen oder auch Tumorsphären vor allem in der Grund Assays, sind sie nicht in der Lage, Kugel bildende Fähigkeit auf serielle r...

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Danksagungen

This study was supported by a grant from the Baden-Württemberg Stiftung (Adult Stem Cells Program II) awarded to C.L. We thank Dr. Martina Konantz for critical input and review of the manuscript. We thank Emmanuel Traunecker and Toni Krebs from the DBM FACS Facility (University Hospital Basel) for assistance with FACS sorting.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Material/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
low-Attachment-plate Corning3474
MEGMLonzaCC-3151
InsulinLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
HydrocortisonLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
EGFLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
EGFSigmaE9644end concentration: 20 ng/ml
FGFPeproTech100-18Bend concentration: 20 ng/ml
B-27Invitrogen/ Gibco17504-044end concentration: 1x
Heparin-Natrium-25000 IERatiopharmN68542.02dilution 1:1000
Pen/StrepGibco15140-122
FCS Gibco10500-064
RPMI 1640Gibco21875-034
Trypsin-EDTA Gibco25300-054
Dulbecco’s PBS (1x)Gibco14190-094
Shield1 Clontech632189dilution 1:1000
DMEM/F12Gibco21041-025
DMEM/F12 (powder)Gibco42400-010
Methyl celluloseSigmaM0387
Puromycin dihydrochlorideapplichemA2856
cell sorter BDAria III cell sorter 
FACS analyserBDaccuri c6 flow cytometer
microscopeOlympus IX50 Osiris

Referenzen

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