Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

Abstract

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called “cancer stem cells” (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

Introduction

There is increasing evidence that ovarian carcinomas are comprised of heterogeneous mixtures of cells and harbor so-called “cancer stem cells” (CSCs) responsible for disease initiation, maintenance and relapse after conventional cytotoxic therapies1-3. Therefore, the development of molecular strategies targeting ovarian CSCs is an important goal and promises to improve the therapy of ovarian cancer patients.

A pre-requisite for the understanding of the molecular features of CSCs is their reliable isolation from the non-CSCs. However, identification of ovarian CSCs appears challenging. While CD133 expression and aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity4,5 have been reported to mark ovarian CSCs, some data indicate that these markers are unstable6. Consistently, in ovarian cancer, other than for example in breast carcinoma7, expression of ALDH1 associates with favorable outcome8 and expression of the proposed stem cell marker CD44 variant has no prognostic value9. More recently, we have shown that expression of the embryonic stem cell protein SOX2 confers stemness to ovarian carcinoma cells10 and high SOX2 expression associates with clinically aggressive ovarian and breast carcinomas11,12. Therefore, in this report we use a lentiviral reporter construct containing a red fluorescence protein (RFP) whose expression is controlled by a SOX2 regulatory region, as a method to isolate putative ovarian CSCs.

By definition, CSCs can both self-renew and differentiate, giving rise to all tumor cell types. Putative CSC populations need to be analyzed in functional assays performed in vivo. For obvious reasons, in human cells such functional tests are confined to xenograft assays, comprising mostly transplantation of human tumor cells into immuno-compromised mice10,13.

An alternative in vitro method was offered by Brent Reynolds and Sam Weiss who firstly reported the so-called neurosphere assay as a surrogate assay evaluating stem potential in neural cells14. Dontu and colleagues later confirmed the use of this assay for evaluation of stem cell potential in breast cells15,16. Here, human mammary cells were plated in different numbers in serum-free medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), B-27 and heparin and cultured under non-adherent conditions for seven to ten days before sphere formation was scored by microscopy. Following this protocol with some adjustments in cell numbers, growth medium and supplements, several groups have explored in vitro stem cell potential from several cancer types such as breast17, brain18, pancreas19 and colon20 tumors. In ovarian carcinoma, we have recently reported feasibility of the spheres assay and compared its results to those collected in in vivo murine xenograft models10. We found that overexpression of the stem cell protein SOX2 enhanced both in vitro sphere formation as well as in vivo tumorigenicity of human ovarian carcinoma cells10. However, the frequency of sphere-initiating cells was higher than the frequency of tumor-initiating cells measured in vivo10 suggesting that either the sphere assay may lead to false positive results due to technical reasons or, alternatively, the in vivo assay may be inefficient and result in false negative results.

In this report, we analyze multi cell-based ovarian spheres assays in more detail, review the different protocols available in the literature and compare them to a single cell-based assay. We show that the single cell-based assay provides more accurate and reproducible results than multi cell-based assays, which can be highly influenced by the density of plated cells unless methylcellulose is added to the cultures to immobilize cells. However, also in single cell-based assays, in vitro sphere-initiating potential is observed at higher frequency than in vivo tumor-initiating potential.

Protocol

1. דור של תאי השחלה אדם OVCAR-3 Carcinoma transduced ביציבות עם Lentiviruses מכיל לבנות כתב Sox2 התקינה האזור

  1. ליצור חלקיקי lentiviral על ידי transfecting קו תא 293T-אריזת HEK עם לבנות כתב הכרת אזור רגולציה Sox2 כ10,21 תיארו.
    הערה: הכתב לבנות עוד מכיל תחום יציבות של מערכת חומת ProteoTuner לפני חלבון פלואורסצנטי tdTomato. Shield1 נקשר לתחום היציבות ובכך למנוע פרוטאזום להשפיל חלבון פלואורסצנטי 22.
  2. Transduce OVCAR-3 תאים עם חלקיקי lentiviral על פני תקופה של 24 שעות זמן. לאחר מכן, להסיר את supernatant ויראלי ולשטוף את התאים עם ופר פוספט (PBS) ותרבית בינונית שלם (RPMI בתוספת 10% FBS, 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין).
  3. 48 שעות מאוחר יותר, 10 מיקרוגרם / מיליליטר פורmycin נוספו לתרבויות ונשמר במשך 5 ימים, כדי לאפשר בחירה של תאי transduced כראוי.

2. הכנת Cell המיון והציפוי

  1. להוסיף Shield1 ב 1: 1000 שעות דילול 24 לפני מיון תא. השתמש OVCAR-3 תאי transduced ביציבות ללא טיפול Shield1 כפקדים שליליים (איור 1). תקשורת לשאוב מבקבוק, לשטוף תאים עם 1x PBS וtrypsinize תאים עם 0.05% טריפסין- EDTA במשך 3 דקות.
  2. להפסיק טריפסין באמצעות מדיום מלא (ראה לעיל), לספור מספרי תא, תאי צנטריפוגות ב 300 XG ב RT (15 - 25 מעלות צלזיוס) במשך 5 דקות.
  3. למזוג supernatant ותאי resuspend בזהירות ב 0.5 - PBS סטרילי 1 מיליליטר.
  4. השתמש במסנן כובע מסננת תא 40 מיקרומטר להשיג השעיה תא בודד.
  5. התאם ספירת תאים 5 מיליון תאים לכל מיליליטר.
  6. הכן 96-גם צלחות נמוכות מצורפים אולטרה עם 100 μl הישות הזכרית והנקביות בינוניים (MEGM בתוספת גורמי גדילה, ציטוקינים, ותוספי מזון,B-27, heparine-נתרן; או DMEM / F12 בתוספת גורמי גדילה, ציטוקינים, ותוספי מזון, B-27, heparine-נתרן, עם או בלי תוספת של 1% methylcellulose, ראה גם לוח 1). לחלופין להוסיף אנטיביוטיקה למדיום בריכוז של 100 U פניצילין מיליליטר / 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין כדי למזער את הסיכון לזיהום אפשרי.
  7. מיין + RFP ותאי RFP- ל96-גם צלחות שהוכנו מלמעלה, תא 1 בכל טוב (assay מבוסס תאים בודדים תחומים) וכל גם 100 תאים (assay תחומים מבוססי תאים רב), בהתאמה. בצע סדרן תא מין על זמין מסחרי (ראה חומרים) שימוש במצב תא בודד, מיין התקנה: 100 μ זרבובית, לחץ נדן 20 psi, ומסכת תשואת 0, מסכת טוהר 32, מסכת שלב 16.
  8. להעריך את היעילות על ידי ציפוי מיקרוסקופי הבקיע בארות המכילות תאים (עבור assay מבוסס התאים הבודד) ועל ידי ספירת מספר תאים בבארות בודדות (לassay מבוסס תאים הרב; איור 2 ).
  9. דגירה תאים בתנאים סטנדרטיים בתחומים בינוניים (להרכב ראה שלב 2.6) על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. להשלים bFGF היומי (20 ng / ml) וEGF (מיליליטר / 20 ng).
  10. אחרי שבוע אחד, לספור מספרים של מתעוררים תחומי גידול באמצעות מיקרוסקופ רגיל עם הגדלה 4X או 10X ומיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות אותות הקרינה ממערכת הכתב המשולבת. רוזן התחומים בקוטר העולה על כתחומים "גדולים" 100 מיקרומטר, ותחומים בקוטר 100 - 50 כתחומים "קטנים" מיקרומטר (איור 3). להיות בטוח שאתה לספור תחומים אמיתיים ולא תא אשכולות.
    הערה: במבחנים מבוססי תאים בודדים היווצרות כדור קלה יותר להבקיע מיקרוסקופי לאחר 10 (לעומת 7) ימים של התרבות.
  11. חשב את חלקם של תאי יוצרי כדור ב+ RFP ותאי בהתאמה RFP- במבחנים מבוססי תאים בודדים (96-גם צלחת אחת לכל ניסוי בודד) או תא-ba הרבמבחני SED תחומים (טוב אחד עבור כל ניסוי בודד) כפי שהוצג על ידי et al שו. 16
    הערה: חלקם של תאי תחום יצירה (%) = (מספר תחומים) / (מספר תאי זרע) x 100

3. Passaging הסידורי של Spheres

  1. הנח את התוכן של כל אחד גם בצינור סטרילי מתאים וצנטריפוגות ב XG 300 עבור 10 דקות ב RT. עבור מבחני מבוססי תאים רב התחומים, לאסוף יחד את התחומים מאחד גם. לשטוף היטב 3-5 פעמים עם PBS ו צנטריפוגות 2 דקות יותר. עבור מבחני מבוססי תאים בודדים תחומים, לאסוף כדורים בודדים. לאור המספרים הנמוכים של תאים, להשתמש צינורות 1.5 מיליליטר לצעדי צנטריפוגה וכביסה.
  2. הסר supernatant וגלול גלול ב200 μl של 0.05% טריפסין- EDTA.
  3. על מנת להשיג הפרדת תא אופטימלית, דגירה ההשעיה התא ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בייקרו רך. לייעל trypsinization זמן לקו הסלולרי שלך לשיעור מוות של תאים תחתון: אם לא גדולהתחומים הוא triturate הגלוי בעדינות באמצעות קצה פיפטה 100 μl. במקרה תחומים גדולים עדיין קיימים, דגירה עם טריפסין עוד 3 דקות ולאחר מכן להמשיך לשלב טחינה דקה. במקרה של יחיד מבחני מבוססי תאים לוודא כדי לייעל את הזמן לתשואת תא אופטימלי של תאי חיים במהלך שלב trypsinization.
  4. כדי להשבית טריפסין, להוסיף 500 μl בינוני ו צנטריפוגות מלאים ב XG 300 במשך 10 דקות, במקרה של מבחני תא בודדים, צנטריפוגות במשך 2 דקות נוספות.
  5. הסרת תאי supernatant ו resuspend בזהירות במדיום תחומים.
  6. שימוש במסנן כובע מסננת תא 40 מיקרומטר לקבל השעיה תא בודד.
  7. במקרה של שימוש ב+ RFP ותאי RFP- במבחנים-bassed תא רב, להעריך את אחוז תאי ניאון בכל אחד גם לאחר resuspension באמצעות cytometer זרימת הניתוח.
  8. עבור מבחני סידוריים replating של תאים בודדים, זרע תא 1 לכל גם לתוך צלחת אולטרה חדשה נמוכה מצורף 96-גם הכינו כמפורט לעיל. מכדור אחד בודד, זרע כ 20 בארות בודדות. עבור מבחני replating תחומים עיקריים המבוסס על תאים רב, תאי זרע המתקבלים מכן אחד מתחומים עיקריים לצלחת 96-היטב חדשה ולספור את מספר התאים למחרת על ידי מיקרוסקופ.
  9. להעריך את חלקם של תאי יוצרי כדור במבחני תחומים משניים באמצעות הנוסחא המתוארת בשלב 2.11.

ניתוח 4. תוצאה

  1. לנתח את התוצאות מניסויים שבוצעו בtriplicates העצמאי ולהשתמש במבחן t דו-צדדי לנתח ערכים מתפלגים נורמלי ואחר Mann-Whitney-בדיקות לניתוח סטטיסטי.

תוצאות

במבחני התחומים קונבנציונליים, כמעט 40% מRFP + OVCAR-3 תאים לעומת 20% מתאי RFP- הולידו תחום גידול בודד בassay תחומים העיקרי (איור 4 א). יתר על כן, תחומים שהוקמו על ידי RFP + תאים היו גדולים יותר בגודל יותר מאלה שהוקמו על ידי תאי RFP-.

כאשר מצו?...

Discussion

תרבויות תחומים הן שיטה נפוצה לassay תא גזע סרטני פוטנציאלי ולהעשיר לתאי גזע כמו-במגוון רחב של תאים סרטניים אנושיים 15,25,26. בתנאים אלה התרבות, תאי סרטן שאין יכולת התחדשות עצמית צפויים לבדל וסופו של דבר לעבור מוות של תאים. למרות שהם עשויים בתחילה יוצרים צבירי תאים או ?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was supported by a grant from the Baden-Württemberg Stiftung (Adult Stem Cells Program II) awarded to C.L. We thank Dr. Martina Konantz for critical input and review of the manuscript. We thank Emmanuel Traunecker and Toni Krebs from the DBM FACS Facility (University Hospital Basel) for assistance with FACS sorting.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Material/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
low-Attachment-plate Corning3474
MEGMLonzaCC-3151
InsulinLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
HydrocortisonLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
EGFLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
EGFSigmaE9644end concentration: 20 ng/ml
FGFPeproTech100-18Bend concentration: 20 ng/ml
B-27Invitrogen/ Gibco17504-044end concentration: 1x
Heparin-Natrium-25000 IERatiopharmN68542.02dilution 1:1000
Pen/StrepGibco15140-122
FCS Gibco10500-064
RPMI 1640Gibco21875-034
Trypsin-EDTA Gibco25300-054
Dulbecco’s PBS (1x)Gibco14190-094
Shield1 Clontech632189dilution 1:1000
DMEM/F12Gibco21041-025
DMEM/F12 (powder)Gibco42400-010
Methyl celluloseSigmaM0387
Puromycin dihydrochlorideapplichemA2856
cell sorter BDAria III cell sorter 
FACS analyserBDaccuri c6 flow cytometer
microscopeOlympus IX50 Osiris

References

  1. Pardal, R., Clarke, M. F., Morrison, S. J. Applying the principles of stem-cell biology to cancer. Nat Rev Cancer. 3 (12), 895-902 (2003).
  2. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
  3. Ahmed, N., Abubaker, K., Findlay, J. K. Ovarian cancer stem cells: Molecular concepts and relevance as therapeutic targets. Mol Aspects Med. 39, 110-125 (2014).
  4. Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71 (11), 3991-4001 (2011).
  5. Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130 (1), 29-39 (2012).
  6. Stewart, J. M., et al. Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (16), 6468-6473 (2011).
  7. Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
  8. Chang, B., et al. ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers. Mod Pathol. 22 (6), 817-823 (2009).
  9. Cannistra, S. A., et al. CD44 variant expression is a common feature of epithelial ovarian cancer: lack of association with standard prognostic factors. J Clin Oncol. 13 (8), 1912-1921 (1995).
  10. Bareiss, P. M., et al. SOX2 expression associates with stem cell state in human ovarian carcinoma. Cancer Res. 73 (17), 5544-5555 (2013).
  11. Pham, D. L., et al. SOX2 expression and prognostic significance in ovarian carcinoma. Int J Gynecol Pathol. 32 (4), 358-367 (2013).
  12. Lengerke, C., et al. Expression of the embryonic stem cell marker SOX2 in early-stage breast carcinoma. BMC Cancer. 11, 42 (2011).
  13. Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
  14. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
  15. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  16. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  17. Leis, O., et al. Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells. Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).
  18. Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
  19. Wang, Y. J., Bailey, J. M., Rovira, M., Leach, S. D. Sphere-forming assays for assessment of benign and malignant pancreatic stem cells. Methods Mol Biol. 980, 281-290 (2013).
  20. Li, Y. F., Xiao, B., Tu, S. F., Wang, Y. Y., Zhang, X. L. Cultivation and identification of colon cancer stem cell-derived spheres from the Colo205 cell line. Braz J Med Biol Res. 45 (3), 197-204 (2012).
  21. Wu, F., et al. Identification of two novel phenotypically distinct breast cancer cell subsets based on Sox2 transcription activity. Cell Signal. 24 (11), 1989-1998 (2012).
  22. Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
  23. Kawase, Y., Yanagi, Y., Takato, T., Fujimoto, M., Okochi, H. Characterization of multipotent adult stem cells from the skin: transforming growth factor-beta (TGF-beta) facilitates cell growth. Exp Cell Res. 295 (1), 194-203 (2004).
  24. Walia, V., et al. Loss of breast epithelial marker hCLCA2 promotes epithelial-to-mesenchymal transition and indicates higher risk of metastasis. Oncogene. 31 (17), 2237-2246 (2012).
  25. Leung, E. L., et al. Non-small cell lung cancer cells expressing CD44 are enriched for stem cell-like properties. PLoS One. 5 (11), e14062 (2010).
  26. Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16281-16286 (2009).
  27. Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42 (9), 593-602 (2010).
  28. Wang, H., Zhang, Y., Du, Y. Ovarian and breast cancer spheres are similar in transcriptomic features and sensitive to fenretinide). Biomed Res Int. 2013, 510905 (2013).
  29. Du, Y. R., et al. Effects and mechanisms of anti-CD44 monoclonal antibody A3D8 on proliferation and apoptosis of sphere-forming cells with stemness from human ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer. 23 (8), 1367-1375 (2013).
  30. Xiang, T., et al. Interleukin-17 produced by tumor microenvironment promotes self-renewal of CD133 cancer stem-like cells in ovarian cancer. Oncogene. , (2013).
  31. Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems. Oncol Rep. 23 (5), 1277-1284 (2010).
  32. Soritau, O., et al. Enhanced chemoresistance and tumor sphere formation as a laboratory model for peritoneal micrometastasis in epithelial ovarian cancer. Rom J Morphol Embryol. 51 (2), 259-264 (2010).
  33. Shi, M. F., et al. Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line. Cell Mol Life Sci. 67 (22), 3915-3925 (2010).
  34. Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68 (11), 4311-4320 (2008).
  35. Liang, D., et al. The hypoxic microenvironment upgrades stem-like properties of ovarian cancer cells. BMC Cancer. 12, 201 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

95assaySox2Assay

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved