Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ضعف الميتوكوندريا هو السمة المميزة لالشيخوخة الخلوية. تستخدم هذه الورقة غير الغازية بالقرب من الأشعة تحت الحمراء (نير) العلاج لتحسين وظيفة الميتوكوندريا في الشيخوخة الماوس الدهليزي ظهارة حسية.

Abstract

استراتيجيات لتخفيف انخفاض في وظيفة التوازن مع زيادة العمر هي مركزة بشكل رئيسي على العلاجات الجسدية بما في ذلك المهام التوازن وممارسة الرياضة. ومع ذلك، هذه الأساليب لا تعالج الأسباب الكامنة وراء تراجع التوازن. باستخدام الفئران، تم تقييم تأثير ضوء الأشعة تحت الحمراء القريب (نير) على التمثيل الغذائي للخلايا في الظهارة الحسية الدهليزي. البيانات التي تم جمعها تبين أن هذا التدخل بسيطة وآمنة قد تحمي هذه الخلايا الضعيفة من الآثار الضارة للشيخوخة الطبيعية. تم استخراج مرنا من الطرفية ظهارة معزولة الدهليزي الحسية (الأمبولي عرف والبقعة القريبي) وكتب لاحقا في مكتبة [كدنا]. وبعد ذلك تم بحث هذه المكتبة للتعبير عن مضادات الأكسدة في كل مكان (SOD-1). وبعد ذلك تستخدم مضادات الأكسدة التعبير الجيني لتحديد الأيض الخلوي. عن طريق تسليم عبر الجمجمة من نير في الشباب (4 أسابيع) وكبار السن (8-9 أشهر) الفئران، ونظام المعالجة قصيرة (90 ثانية / يوم لمدة 5 دآيس)، يشير هذا العمل نير وحدها قد تكون كافية لتحسين وظيفة الميتوكوندريا في الظهارة الحسية الدهليزي. وبما أن هناك حاليا أي الطرق المتاحة بأسعار معقولة، وغير الغازية العلاج لتحسين الدهليزي وظيفة خلايا الشعر، وتطبيق الإشعاع نير الخارجي يوفر استراتيجية محتملة لمواجهة تأثير الشيخوخة على الأيض الخلوي تي إتش الظهارة الحسية الدهليزي.

Introduction

تراجع أداء التوازن والسقوط اللاحقة شائعة، وميزات للأسف في كثير من الأحيان تحديد الشيخوخة الطبيعية 1. تأثير هذا الانخفاض يمكن أن تكون المادي والاجتماعي، ويقلل بشكل ملحوظ نوعية الحياة لكبار السن. وردا على ذلك، كانت العلاجات الفيزيائية وإعادة تأهيل محور البحث في السقوط ولكن لم تترافق مع تخفيض ثابت في انتشار السقوط المتكرر. في نفس الوقت، والعمل يحقق تغييرات في نظام المحيطي أو المركزي الدهليزي (النظام مسؤول عن الحفاظ على التوازن) هي نادرة، والاستراتيجيات العلاجية المحتملة التي تستهدف هذه النظم والأسباب الكامنة وراء الخلل محدود.

وقد أظهرت الأعمال الأخيرة على اضطرابات الاعصاب المرتبط بالعمر بما في ذلك المتعلقة بالعمر تحلل البقعة الصفراء 2-4، ونماذج مرض الزهايمر 5-8، ومرض باركنسون 9-12 آثار اعصاب سيmple تطبيق غير الغازية القريب من الأشعة تحت الحمراء (نير) الضوء. وعلاوة على ذلك، في النظام الدهليزي، وقد استخدمت نير إلى زيادة نشاط الخلايا العصبية الدهليزي وارد الابتدائية في المختبر 13. ومع أن آلية نير ضوء ليست مفهومة جيدا، وقد اقترح معظم الدراسات باستخدام نير نير أن يحفز الميتوكوندريا IV المعقدة (ج السيتوكروم أوكسيديز) 14-17 لتسهيل عملية الأيض الخلوي. في الظهارة الحسية الدهليزي لوحة تحت البشرة من نوع خلايا I الشعر كثيفة في الميتوكوندريا 18 وعلى هذا النحو قد تمثل موقع العمل لتلقي العلاج نير العلاجية.

هنا، نظام العلاج وجيزة، غير الغازية من transcranially تطبيق نير التي يمكن استخدامها لقياس الأيض الخلوي (وضمنا، وظيفة الميتوكوندريا) في الماوس الدهليزي ظهارة حسية يوصف. ناقش أيضا هو إعداد الظهارة الحسية الدهليزي ويتبين أن نير يزيد من التعبير عن ubiquitoلنا مضادة للأكسدة (الفائق ديسموتاز 1) في الظهارة الحسية - أظهرت في وقت سابق إلى أن تكون مهمة لبقاء الخلية الشعر القوقعة 19.

Protocol

بيان الأخلاق: جميع الإجراءات المبينة أدناه تمت الموافقة من قبل جامعة سيدني جنة الأخلاقيات الحيوانية.

1. الحيوانات

ملاحظة: 1 و 8 - الفئران من العمر 9 أشهر (C57 / BL6) تم الحصول عليها من مركز الثروة الحيوانية (بيرث، أستراليا). وتم إيواء الفئران في مرفق بوش القوارض في جامعة سيدني.

  1. بيت الفئران في أقفاص الماوس القياسية على ضوء 12/12 ساعة / دورة الظلام مع الحصول على الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية.
  2. الفئران الفجوة في كل فئة عمرية في القريب الأشعة تحت الحمراء (نير) معاملة، أو صورية معاملة (مراقبة) مجموعات للمقارنة.

2. الأدنى الأشعة تحت الحمراء (نير) الإشعاع والعلاج الشام

  1. حلق الفراء على منطقة الرأس والرقبة من الفأرة مع الحلاقة الكهربائية قدر الإمكان لمنع إعادة نمو سريع للشعر قبل الانتهاء من نظام العلاج. من أجل الحفاظ على الوضع خالية من مسببات الأمراض من الفئران، واستخدام الايثانول 70٪لتنظيف أدوات الحلاقة بين الحيوانات ومطهر F10 البيطرية بين الحيوانات من أقفاص منفصلة. القيام بذلك 2 - 3 أيام قبل بداية العلاج حتى الحيوانات ليست أوفر التعامل معها.
  2. كبح الماوس من خلال عقد نهاية القريبة من الذيل والسماح لها للاسترخاء في راحة اليد أو مقعد واحد أعلى وذلك لتقليل التوتر التي يمكن أن تؤدي إلى نتائج خاطئة.
  3. عقد نير (670 نانومتر) LED (الصمام الثنائي الباعثة للضوء) جهاز 1 - 2 سم بعيدا عن يتعرض (حليق) منطقة والتبديل على الجهاز لمدة 90 ثانية (الشكل 1A).
    وقد تم قياس التغير في درجة الحرارة نتيجة للتعرض 90 ثانية ك <0.2 درجة مئوية في 100 مل من الماء: ملاحظة.
  4. كرر الخطوات من 2،2-2،3 لمجموعة العلاج صورية من الحيوانات ولكن ترك فيها تشغيل الجهاز (الشكل 1B).
  5. كرر الخطوات من 2،2-2،3 لمجموعة العلاج نير منعت من الحيوانات ولكن تغطي الجهاز مع رقائق الألومنيوم.
  6. كرر الخطوات من 2،2-2،5 يوميا في approximatه 24 فترات ساعة لمدة 5 أيام متتالية.
  7. استخراج ظهارة الدهليزي الحسية (3 أعراف و1 البقعة القريبي) من كلتا الأذنين في اليوم الخامس بعد المعالجة (انظر القسم 3 أدناه).

3. الأنسجة استخراج 20

  1. إعداد 300 مل من القائم الجلسرين السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) تتكون من (مم): 26 NaHCO 3، 11 الجلوكوز، 250 الجلسرين، و 2.5 بوكل، 1.2 ناه 2 PO 4، 1.2 MgCl 2، و 2.5 CaCl 2. قبل إضافة CaCl 2، والغاز الحل مع كربوجين (95٪ O 2 و 5٪ CO 2) لتأسيس الرقم الهيدروجيني من 7.4 وتجنب هطول الأمطار الكالسيوم (الغيوم). هدئ الحل في الفريزر -80 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة حتى يتم تشكيل الطين الجليد.
  2. إعداد العازلة تحلل عزل الحمض النووي الريبي في المسمى أعلى microtubes المسمار (توقف ظهرت من الأغطية عندما تغيرات الضغط أنبوب بين التجميد والذوبان في النيتروجين السائل) وفقالتعليمات الشركة المصنعة أو الممارسات المخبرية المعتادة. لدينا النيتروجين السائل جاهزة في قارورة ديوار الألومنيوم.
    ملاحظة: استخدام ملابس واقية وeyeware عند التعامل مع النيتروجين السائل. تأكد من أن النيتروجين السائل يستخدم في غرفة جيدة التهوية، حيث بلغ حجم شكل الغاز ما يقرب من 700 مرة من شكله السائل ويمكن أن يسبب الاختناق.
  3. بعمق تخدير الفئران مع الكيتامين (400 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن داخل البريتوني. السماح للالمنعكس القائمة الخلفية لتهدأ تماما كما يشير إلى أن الفئران هي تخدير كامل.
  4. قطع رأس الفئران مع حادة مقص الفولاذ المقاوم للصدأ وإجراء شق على طول الجلد سهمي من الجمجمة باستخدام شفرة حلاقة (تقريب رقم 22). عند هذه النقطة والخطوات جميع أنحاء 3،5-3،9، والحفاظ على قبو الجمجمة والدماغ، والجهاز الدهليزي الأساسي بارد ممكن عن طريق تطبيق المنتظم للACSF الجليد الباردة على الأنسجة.
  5. باستخدام ذراع أشار من مقص نمط القياسية جعل األصغرل شق في الجمجمة في امدا وقطع على طول الدرز السهمي.
  6. الشريحة بلطف ذراع واحدة من رينجرز الضحلة تحت العظم الجداري الحفاظ على شفرة أقرب وقت ممكن إلى السطح السفلي للعظم بدون سحب الدماغ. تأمين وسحب بعيدا العظم الجداري أفقيا وعظم القذالي الخلف حتى يتعرض الدماغ.
  7. استخدام صغيرة غير القابل للصدأ ملعقة الصلب ورفع الدماغ بعيدا عن الحفرة القحفية الأمامية والوسطى لفضح العصب الدهليزي القوقعي (CN الثامن). القطع العصب لمنع التوتر لا داعي لها على محاور عصبية وارد الأولية التي يعصب بشكل مباشر على خلايا الشعر الدهليزي.
  8. إزالة الدماغ جملة وتفصيلا بعد transection من CN الثامن.
  9. مراقبة متاهة العظمية التي تحتوي على القوقعة والأجهزة الطرفية الدهليزي في الحفرة القحفية الوسطى. جعل اثنين من الشقوق الصغيرة بجانب كل متاهة العظمية واستئصال هيكل كامل من خلال عقد نصف دائري القناة الأمامية وسحب في وقت لاحقحليف.
  10. تزج فورا المتاهات رفعه في طبق تشريح تحتوي على حل ACSF المثلج (كما هو موضح في الخطوة 3.1)، في حين perfusing باستمرار مع كربوجين.
  11. تحت stereomicroscope، باستمرار متاهة من القوقعة وضمان الحصول عليها إلى أسفل الطبق مع ملقط.
    1. استخدام ملقط غرامة مباشرة الى نقطة الصفر فتحة صغيرة في العظم فوق الأمامية القناة الهلالية (SSC) أمبولة.
    2. بلطف تكبير هذا الانفتاح من خلال الوصول مباشرة أسفل العظم والتحريك إلى الخارج بعيدا عن أمبولة. توخي الحذر هنا ليست دفع ملقط في افتتاح وتلف التيه الغشائي الهشة أدناه. الاستمرار في هذا الشكل حتى يتعرض قريبة، الأمامية والجانبية الأمبولات جميع. إذا كان ذلك ممكنا إزالة أمبولة الخلفي أيضا.
  12. باستخدام ملقط غرامة، ورفع بلطف قريبة والأمبولات بعيدا عن متاهة العظمية حتى يتم فصل أنها تماما. حيثما كان ذلك ممكنا، وعقد لهمعن طريق القنوات نصف دائري المرتبطة بها لتجنب إتلاف الظهارة الحسية. في بعض الحالات، والجزء القريب من القناة غشائي الهلالية قد تحتاج إلى قطع مع مقص القزحية للافراج عن الأمبولات من العظام.
  13. آمن فهم أجهزة الدهليزي بين غيض من الملقط ومكان في المخزن المؤقت تحلل أعدت في وقت سابق في الخطوة 3.2. دوامة بلطف ملقط حولها في المخزن المؤقت لضمان وفصل أجهزة الدهليزي من الملقط. تحقق هذا هو الحال من خلال جلب ملقط تحت stereomicroscope.
    1. المسمار على غطاء أنيبيب وتجميد العينة في النيتروجين السائل على الفور.

4. استخراج الحمض النووي الريبي وRT-PCR

  1. اتبع الطرق المعيارية الرنا المرسال (مرنا) استخراج وفقا لتعليمات الشركة الصانعة أو بروتوكولات مختبر المفضل.
    ملاحظة: هناك عدة التجارية التي تستخدم الرنا الناقل للمساعدة في عزل غلة صغيرة من مرنا واستخدم في هذاالبروتوكول. ويمكن استخدام كميات أقل شطف إلى زيادة تركيزات النهائي من مرنا.
    ملاحظة: السلبية الضوابط "لا إنزيم" (NECS) والضوابط "لا قالب DNA" (NTCS) يجب أيضا أن تكتمل لضمان صحة الآثار الملاحظة.
  2. تطبيق الطرق المعيارية لعكس النسخ من مرنا لDNA مكملة ([كدنا]) والتضخيم من الجينات المستهدفة 21-23.

النتائج

لمقارنة تأثير العلاج نير في الشباب (4 أسابيع) وكبار السن (8-9 أشهر) الفئران قمنا بقياس التعبير عن مضادات الأكسدة الفائق ديسموتاز 1 (SOD-1) في الشباب (ن = 16) وكبار السن (ن = 20) الفئران التي كانت نير المعالجة، وتعامل الشام، أو نير منعت-الشكل 2 يوضح زيادة كبيرة في β أكتين ت...

Discussion

نتائج تمثيلية الموصوفة هنا تشير إلى أن تسليم عبر الجمجمة وجيزة من نير ضوء (90 ثانية / يوم لمدة 5 أيام) كافية لرفع مستويات التعبير المضادة للأكسدة في الفئران الأكبر سنا بالمقارنة مع الفئران المعالجة الصورية. في حين الحرارة المنبعثة يمكن أن تمثل مصدرا للالميتوكوندريا و / ...

Disclosures

تعلن المؤلفين ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgements

الكتاب نود أن نعترف الدكتور بول دراسة Witting والسيدة جينيفيف فونغ على المساعدة التي قدموها مع استخراج مرنا وPCR، وغارنيت موديل قديم ومؤسسة رودني ويليامز التذكاري للحصول على الدعم.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Material/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
Quantum WARP 10Quantum Devices2070N030-A
Screw top microtubulesQuality Scientific Plastics520-GRD-Q
KetamineParnell, Alexandria Australia
Standard Pattern ScissorsFST14001-12
Carbon steel Surgical Blades #22LivingstoneSBLDCL 22
Friedman-Pearson RongeursFST16221-14
Stereo microscopeLeica MicrosystemsA60S
Dumont #5 SF ForcepsFST11252-00
Isolate II RNA Micro KitBiolineBIO-52075

References

  1. Agrawal, Y., Carey, J. P., Della Santina, ., C, C., Schubert, M. C., Minor, L. B. Disorders of balance and vestibular function in US adults: data from the National Health and Nutrition Examination Survey, 2001-2004. Archives of internal medicine. 169, 938-944 (2009).
  2. Bessho, K., et al. Effect of subthreshold infrared laser treatment for drusen regression on macular autofluorescence in patients with age-related macular degeneration. Retina. 25, 981-988 (2005).
  3. Olk, R. J., et al. Therapeutic benefits of infrared (810-nm) diode laser macular grid photocoagulation in prophylactic treatment of nonexudative age-related macular degeneration: two-year results of a randomized pilot study. Ophthalmology. 106, 2082-2090 (1999).
  4. Rodanant, N., et al. Predictors of drusen reduction after subthreshold infrared (810 nm) diode laser macular grid photocoagulation for nonexudative age-related macular degeneration. American journal of ophthalmology. 134, 577-585 (2002).
  5. De Taboada, L., et al. Transcranial laser therapy attenuates amyloid-beta peptide neuropathology in amyloid-beta protein precursor transgenic mice. Journal of Alzheimer's disease : JAD. 23, 521-535 (2011).
  6. Grillo, S. L., Duggett, N. A., Ennaceur, A., Chazot, P. L. Non-invasive infra-red therapy (1072 nm) reduces beta-amyloid protein levels in the brain of an Alzheimer's disease mouse model. TASTPM. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology. 123, 13-22 (2013).
  7. Purushothuman, S., Johnstone, D. M., Nandasena, C., Mitrofanis, J., Stone, J. Photobiomodulation with near infrared light mitigates Alzheimer's disease-related pathology in cerebral cortex - evidence from two transgenic mouse models. Alzheimer's researc., & therapy. 6, 2 (2014).
  8. Sommer, A. P., et al. 670 nm laser light and EGCG complementarily reduce amyloid-beta aggregates in human neuroblastoma cells: basis for treatment of Alzheimer's disease. Photomedicine and laser surgery. 30, 54-60 (2012).
  9. Moro, C., et al. Photobiomodulation preserves behaviour and midbrain dopaminergic cells from MPTP toxicity: evidence from two mouse strains. BMC neuroscience. 14, 40 (2013).
  10. Peoples, C., et al. Photobiomodulation enhances nigral dopaminergic cell survival in a chronic MPTP mouse model of Parkinson's disease. Parkinsonis., & related. 18, 469-476 (2012).
  11. Shaw, V. E., et al. Neuroprotection of midbrain dopaminergic cells in MPTP-treated mice after near-infrared light treatment. The Journal of comparative neurology. 518, 25-40 (2010).
  12. Ying, R., Liang, H. L., Whelan, H. T., Eells, J. T., Wong-Riley, M. T. Pretreatment with near-infrared light via light-emitting diode provides added benefit against rotenone- and MPP+-induced neurotoxicity. Brain research. 1243, 167-173 (2008).
  13. Rajguru, S. M., et al. Infrared photostimulation of the crista ampullaris. The Journal of physiology. 589, 1283-1294 (2011).
  14. Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
  15. Desmet, K. D., et al. Clinical and experimental applications of NIR-LED photobiomodulation. Photomedicine and laser surgery. 24, 121-128 (2006).
  16. Huang, Y. Y., Chen, A. C., Carroll, J. D., Hamblin, M. R. Biphasic dose response in low level light therapy. Dose-response : a publication of International Hormesis Society. 7, 358-383 (2009).
  17. Rojas, J. C., Gonzalez-Lima, F. Low-level light therapy of the eye and brain. Eye and brain. 3, 49-67 (2011).
  18. Vranceanu, F., et al. Striated organelle, a cytoskeletal structure positioned to modulate hair-cell transduction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4473-4478 (2012).
  19. Johnson, K. R., et al. Separate and combined effects of Sod1 and Cdh23 mutations on age-related hearing loss and cochlear pathology in C57BL/6J mice. Hearing research. 268, 85-92 (2010).
  20. Tung, V. W., Di Marco, S., Lim, R., Brichta, A. M., Camp, A. J. An isolated semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium for electrophysiology and high-resolution two-photon microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50471 (2013).
  21. Kirby, J., Menzies, F. M., Cookson, M. R., Bushby, K., Shaw, P. J. Differential gene expression in a cell culture model of SOD1-related familial motor neurone disease. Human molecular genetics. 11, 2061-2075 (2002).
  22. Parry, S. N., Ellis, N., Li, Z., Maitz, P., Witting, P. K. Myoglobin induces oxidative stress and decreases endocytosis and monolayer permissiveness in cultured kidney epithelial cells without affecting viability. Kidney and Blood Pressure Research. 31, 16-28 (2008).
  23. Saee-Rad, S., et al. Analysis of superoxide dismutase 1, dual-specificity phosphatase 1, and transforming growth factor, beta 1 genes expression in keratoconic and non-keratoconic corneas. Molecular vision. 19, 2501-2507 (2013).
  24. Albert, E. S., et al. TRPV4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
  25. Moro, C., et al. Photobiomodulation inside the brain: a novel method of applying near-infrared light intracranially and its impact on dopaminergic cell survival in MPTP-treated mice. Journal of neuroscience. 120, 670-683 (2014).
  26. Moreno, L. E., et al. Infrared neural stimulation: beam path in the guinea pig cochlea. Hearing research. 282, 289-302 (2011).
  27. Curthoys, I. S. A red thread as a guide in the vestibular labyrinth. The Journal of physiology. 589, 1241-1241 (2011).
  28. Chakrabarti, S., et al. Mitochondrial Dysfunction during Brain Aging: Role of Oxidative Stress and Modulation by Antioxidant Supplementation. Aging and disease. 2, 242-256 (2011).
  29. Petrosillo, G., De Benedictis, V., Ruggiero, F. M., Paradies, G. Decline in cytochrome c oxidase activity in rat-brain mitochondria with aging. Role of peroxidized cardiolipin and beneficial effect of melatonin. Journal of bioenergetics and biomembranes. 45, 431-440 (2013).
  30. Zhu, H., Sun, A., Zou, Y., Ge, J. Inducible metabolic adaptation promotes mesenchymal stem cell therapy for ischemia: a hypoxia-induced and glycogen-based energy prestorage strategy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34, 870-876 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

97

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved