Infravermelho Próximo (NIR) Luz aumenta a expressão de um marcador da função mitocondrial no mouse Vestibular Sensorial Epithelium

Resumo

A disfunção mitocondrial é uma característica da senescência celular. Este trabalho usa não-invasivo do infravermelho próximo (NIR) de tratamento para melhorar a função mitocondrial no rato epitélio sensorial vestibular de envelhecimento.

Resumo

Estratégias para atenuar o declínio na função equilíbrio com o aumento da idade são predominantemente focado em terapias físicas, incluindo tarefas de equilíbrio e exercícios. No entanto, estas abordagens não abordam as causas subjacentes do declínio do equilíbrio. Usando ratos, o impacto da luz de infravermelho próximo (NIR) sobre o metabolismo de células do epitélio sensitivo vestibular foi avaliada. Os dados coletados mostram que essa intervenção simples e segura pode proteger essas células vulneráveis ​​dos efeitos deletérios do envelhecimento natural. ARNm foi extraído a partir do epitélio sensitivo vestibular periférico isolado (ampulares crista, e mácula utricular) e posteriormente transcrita para uma biblioteca de ADNc. Esta biblioteca foi então sondadas para a expressão de antioxidante ubíqua (SOD-1). A expressão do gene antioxidante foi então usado para quantificar o metabolismo celular. Usando entrega transcraniana de Nir em jovens (4 semanas) e mais velhos (8-9 meses), ratos, e um regime de tratamento breve (90 seg / dia para 5 days), este trabalho sugere NIR sozinho pode ser suficiente para melhorar a função mitocondrial no epitélio sensitivo vestibular. Uma vez que existem atualmente não há métodos disponíveis, acessíveis e não-invasivos de terapia para melhorar a função das células ciliadas vestibular, a aplicação de radiação NIR externa fornece uma estratégia potencial para neutralizar o impacto do envelhecimento sobre o metabolismo celular inthe epitélio sensorial vestibular.

Introdução

O declínio da performance de equilíbrio e quedas subsequentes são comuns, e, infelizmente, muitas vezes definem características de envelhecimento natural ^1. O impacto desse declínio pode ser tanto física e social, e reduz significativamente a qualidade de vida das pessoas mais velhas. Em resposta, terapias físicas e reabilitação têm sido o foco da investigação sobre as quedas, mas não têm sido associadas com redução consistente na prevalência de quedas repetidas. Ao mesmo tempo, o trabalho investiga as mudanças no sistema vestibular periférico ou central (o sistema responsável por manter o equilíbrio) é escassa, e potenciais estratégias terapêuticas dirigidas a esses sistemas e as causas subjacentes de desequilíbrio limitado.

Trabalhos recentes sobre doenças neurodegenerativas associadas com a idade relacionada com a idade, incluindo degeneração macular ^2-4, modelos da doença de Alzheimer, ^5-8 e ^9-12 doença de Parkinson têm mostrado efeitos neuroprotectores de simple aplicação não invasiva do infravermelho próximo (NIR) luz. Além disso, no sistema vestibular, NIR foi usada para aumentar a actividade dos neurónios aferentes primários vestibulares in vitro ^13. Embora o mecanismo de NIR luz não é bem compreendido, a maioria dos estudos que usam NIR sugeriram que estimula NIR mitocôndrias complexo IV (citocromo c oxidase) ^14-17 para facilitar o metabolismo celular. No epitélio sensorial vestibular da placa subcuticular do tipo células ciliadas I é denso em mitocôndrias ¹⁸ e, como tal, pode representar um local de ação para o tratamento terapêutico NIR.

Aqui, uma breve regime de tratamento, não-invasivo de transcraniana aplicado NIR que podem ser utilizadas para medir o metabolismo celular (e implicitamente, a função mitocondrial) no rato epitélio sensorial vestibular é descrito. Também é discutida a preparação de um epitélio sensorial vestibular e é mostrado que o NIR aumenta a expressão de um ubiquitonos anti-oxidante (superóxido dismutase 1) no epitélio sensorial - anteriormente mostrado ser importante para a sobrevivência de células do cabelo cóclea ^19.

Protocolo

Declaração de Ética: Todos os procedimentos descritos a seguir foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Sydney animal.

1. Animais

NOTA: 1 e 8-9 meses de idade camundongos (C57 / BL6) foram obtidos a partir do Centro de Recursos Animal (Perth, Austrália). Os ratinhos foram alojados no mecanismo Bosch Roedor na Universidade de Sydney.

1. Casa ratos em gaiolas-padrão do mouse em um ciclo claro / escuro de 12/12 horas de luz com acesso a comida e água ad libitum.
2. Camundongos Divida em cada faixa etária em infravermelho próximo (NIR), tratados, ou sham grupos tratados (controle) para comparação.

2. Infravermelho Próximo (NIR) Irradiação e Tratamento Sham

1. Raspar a pele na região da cabeça e pescoço do mouse com um barbeador elétrico, tanto quanto possível para evitar a rebrota rápida de cabelo antes da realização do regime de tratamento. A fim de manter o status de livre de patógenos dos ratos, use 70% de etanolpara limpar instrumentos entre animais para maquiagem e desinfetante F10 veterinário entre animais de gaiolas separadas. Faça isto 2-3 dias antes do início do tratamento para que os animais não estão sobre-tratadas.
2. Conter rato com a extremidade proximal da cauda e permitir que ele relaxe na palma de uma mão ou de bancada, de modo a minimizar o stress, que pode levar a resultados falsos.
3. Segure o NIR (670 nm) LED (light emitting diode) dispositivo de 1-2 cm de distância da área exposta (raspada) e ligar o aparelho durante 90 segundos (Figura 1A).
   NOTA: A mudança de temperatura como resultado de exposição de 90 segundos foi medida como <0,2 ° C em 100 ml de água.
4. Repita os passos de 2,2-2,3 para o grupo de tratamento simulado de animais, mas deixar o aparelho desligado (Figura 1B).
5. Repita os passos de 2,2-2,3 para o grupo de tratamento Nir-bloqueado de animais, mas cubra o aparelho com papel alumínio.
6. Repita os passos 2,2-2,5 diariamente às approximate 24 intervalos de RH durante 5 dias consecutivos.
7. Extraia o epitélio vestibular sensorial (3 cristas e uma mácula utricular) de ambas as orelhas no quinto dia pós-tratamento (ver secção 3 abaixo).

3. Extracção de tecido ²⁰

1. Preparar 300 ml de um fluido cerebrospinal artificial (ACSF) à base de glicerol que consistem em (em mM): 26 _de NaHCO3, 11 de glucose, 250 glicerol, 2,5 de KCl, 1,2 de NaH ₂ PO _4, 1,2 de _MgCl2, 2,5 e CaCl _2. Antes da adição de _CaCl2, gás a solução com carbogénio (95% O ₂ e 5% CO ₂₎ para estabelecer um pH de 7,4 e evitar a precipitação do cálcio (turvação). Arrefeça a solução num congelador a -80 ° C durante 45 minutos de modo que uma pasta de gelo é formada.
2. Prepare o tampão de lise isolamento do RNA em microtubos parafuso superior marcados (pára o popping de tampas quando as alterações de pressão tubo entre congelamento e descongelamento em nitrogênio líquido), de acordocom as instruções do fabricante ou práticas de laboratório habituais. Já nitrogênio líquido pronto em um frasco de Dewar de alumínio.
   NOTA: Use roupas de proteção e eyeware ao manusear nitrogênio líquido. Certifique-se de que o nitrogênio líquido é usado em um quarto bem ventilado como o volume da sua forma de gás é aproximadamente 700 vezes maior do que a sua forma líquida e pode causar asfixia.
3. Profundamente anestesiar os ratos com cetamina (400 mg / kg) através de uma injecção intra-peritoneal. Permitir que o reflexo posterior de membros para desaparecer completamente como indicação de que os ratos são totalmente anestesiado.
4. Decapitar ratos com tesoura de aço inoxidável afiadas e fazer uma incisão ao longo da pele sagital do crânio usando uma lâmina de barbear (arredondado # 22). Neste momento e em toda as etapas 3,5-3,9, manter a calota craniana, cérebro e aparelho vestibular subjacente o mais fresco possível pela aplicação regular de ACSF gelada sobre o tecido.
5. Usando o braço pontas de tesouras padrão standard fazer uma small incisão no crânio no Lambda e cortar ao longo da sutura sagital.
6. Deslize suavemente um braço de um fórceps rasas debaixo do osso parietal mantendo a lâmina tão próximo quanto possível da superfície inferior do osso sem arrastar o cérebro. Seguros e afastar o osso parietal lateral e posterior do osso occipital até que o cérebro está exposto.
7. Use uma pequena espátula de aço inoxidável e levante o cérebro de distância do anterior e fossa craniana média para expor o nervo vestibular (CN VIII). Transecto o nervo para evitar tensão desnecessária sobre os axônios aferentes primários que inervam diretamente as células ciliadas vestibulares.
8. Remover o cérebro in toto após transecção do CN VIII.
9. Observe o labirinto ósseo contendo a cóclea e os órgãos vestibulares periféricas da fossa craniana média. Faça duas pequenas incisões ao lado de cada labirinto ósseo e extirpar toda a estrutura, mantendo o canal semicircular anterior e puxando mais tardealiado.
10. Mergulhar imediatamente labirintos excisadas em um prato de dissecação contendo solução ACSF gelado (como descrito no passo 3.1), enquanto que irriga continuamente com carbogéneo.
11. Sob um microscópio estereoscópico, mantenha pressionado o labirinto pela cóclea e fixá-lo ao fundo do prato com uma pinça.
    1. Use uma pinça reta fina para riscar uma pequena abertura no osso acima do canal semicircular (SSC) ampulla anterior.
    2. Gentilmente ampliar esta abertura, alcançando imediatamente abaixo do osso e sacudindo para fora ampulífuga. Tenha cuidado aqui para não empurrar pinça na abertura e danificar o labirinto membranoso frágil abaixo. Continuar dessa maneira até que o utrículo, anterior e ampolas laterais estão todos expostos. Se possível remover a ampola posterior também.
12. Usando uma pinça fina, levantar delicadamente o utrículo e ampolas de distância do labirinto ósseo até que estejam completamente isolada. Sempre que possível, mantê-lospor seus canais semicirculares associados para evitar danos ao epitélio sensorial. Em alguns casos, a parte proximal da conduta membranoso semicircular pode ter de ser cortado com tesoura de íris para libertar as ampolas a partir do osso.
13. Firmemente compreender os órgãos vestibulares entre a ponta de uma pinça e lugar para o tampão de lise preparado anteriormente na etapa 3.2. Agite suavemente a pinça em torno do tampão para garantir órgãos vestibulares têm destacado a pinça. Confira este for o caso, trazendo a pinça, ao microscópio estereoscópico.
    1. Parafuso na tampa de microtúbulos e congelar a amostra em nitrogênio líquido imediatamente.

4. Extracção de ARN e RT-PCR

1. Siga métodos padrão de RNA mensageiro (mRNA) extracção de acordo com as instruções do fabricante ou protocolos de laboratório preferenciais.
   NOTA: Um kit comercial que utilizou ARN de suporte para ajudar a isolar pequenos rendimentos de ARNm foi utilizada nesteprotocolo. Volumes de eluição inferiores podem ser utilizados para aumentar as concentrações finais de ARNm.
   NOTA: Negativo controles "não enzima" (CNE) e controles "nenhum modelo de DNA" (NTC) também deve ser concluído para garantir a validade dos efeitos observados.
2. Aplicar os métodos padrão de transcrição reversa do ARNm de ADN complementar (ADNc) e amplificação de genes alvo ^21-23.

Resultados

Para comparar o impacto do tratamento NIR em jovens (4 semanas) e mais velhos (8-9 meses), camundongos medimos a expressão de antioxidante superóxido dismutase 1 (SOD-1) em jovens (n ​​= 16) e mais velhos (n = 20) os ratos que foram tratados Nir, tratamento simulado, ou NIR-bloqueados. A Figura 2 mostra um aumento significativo na normalizada SOD-1 expressão β-actina de mais de 2 vezes em jovens tratados com NIR animais jovens em comparação com os animais tratados de forma simulada (p <0,01...

Discussão

Os resultados representativos descritos aqui mostram que a entrega breve transcraniana de luz NIR (90 seg / dia durante 5 dias) é suficiente para elevar os níveis de expressão de antioxidantes em ratos mais velhos quando comparados com os ratos tratados por simulação. Enquanto calor emitido poderia representar uma fonte de mitocondrial e / ou ativação neuronal, como relatado para vestibular rato aferentes ²⁴ - nossa medição do calor emitido pelo NIR LED dispositivo foi <0,2 ° C durante 90 segundo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Quantum WARP 10	Quantum Devices	2070N030-A
Screw top microtubules	Quality Scientific Plastics	520-GRD-Q
Ketamine	Parnell, Alexandria Australia
Standard Pattern Scissors	FST	14001-12
Carbon steel Surgical Blades #22	Livingstone	SBLDCL 22
Friedman-Pearson Rongeurs	FST	16221-14
Stereo microscope	Leica Microsystems	A60S
Dumont #5 SF Forceps	FST	11252-00
Isolate II RNA Micro Kit	Bioline	BIO-52075