Proche infrarouge (NIR) Lumière augmente l'expression d'un marqueur de mitochondrial Fonction chez la souris vestibulaire sensoriel épithélium

Résumé

Dysfonction mitochondriale est une caractéristique de la sénescence cellulaire. Ce document utilise le proche infrarouge (NIR) traitement non-invasif pour améliorer la fonction mitochondriale chez la souris épithélium vestibulaire sensoriel vieillissement.

Résumé

Stratégies d'atténuation déclin de la fonction de balance avec l'âge sont principalement ciblée sur les thérapies physiques y compris les tâches de l'équilibre et de l'exercice. Cependant, ces approches ne traitent pas les causes sous-jacentes du déclin de l'équilibre. En utilisant des souris, l'impact de la lumière proche infrarouge (NIR) sur le métabolisme des cellules de l'épithélium vestibulaire sensoriel a été évaluée. Les données recueillies montrent que cette intervention simple et sûr peut protéger ces cellules vulnérables contre les effets délétères du vieillissement naturel. L'ARNm a été extrait à partir de l'épithélium sensoriel vestibulaire périphérique isolé (crête ampullaire et macule utriculaire) et ensuite transcrite en une banque d'ADNc. Cette banque a été ensuite sondée pour l'expression ubiquiste d'antioxydant (SOD-1). L'expression du gène antioxydant a ensuite été utilisé pour quantifier le métabolisme cellulaire. Utilisation de la livraison transcrânienne de NIR chez les jeunes (4 semaines) et plus âgés (8-9 mois) des souris, et un régime de traitement brève (90 secondes / jour pendant 5 joursays), ce travail suggère Nir peut suffire à améliorer la fonction mitochondriale dans l'épithélium vestibulaire sensoriel. Comme il n'y a pas de méthodes disponibles, abordables et non invasives de la thérapie pour améliorer la fonction des cellules ciliées vestibulaires, l'application d'un rayonnement NIR externe fournit une stratégie potentielle pour contrer l'impact du vieillissement sur le métabolisme cellulaire INTHE épithélium vestibulaire sensoriel.

Introduction

Baisse du rendement de l'équilibre et chutes ultérieures sont communs, et les caractéristiques définissant malheureusement souvent de vieillissement naturel ^1. L'impact de cette baisse peut être à la fois physique et social, et réduit considérablement la qualité de vie des personnes âgées. En réponse, les thérapies physiques et de réhabilitation ont fait l'objet de la recherche sur les chutes, mais ne ont pas été associés à une réduction constante de la prévalence des chutes répétées. Dans le même temps, le travail d'instruction des changements dans le système vestibulaire périphérique ou central (le système chargé de maintenir l'équilibre) est rare, et les stratégies thérapeutiques potentielles ciblant ces systèmes et les causes sous-jacentes du déséquilibre limitée.

Des travaux récents sur les troubles neurodégénératifs liés à l'âge, y compris liée à l'âge, la dégénérescence maculaire ^2-4 modèles de la maladie d'Alzheimer ^5-8, et la maladie de Parkinson ^9-12 ont montré des effets neuroprotecteurs de simple application non invasive du proche infrarouge (NIR) de lumière. En outre, dans le système vestibulaire, NIR a été utilisé pour augmenter l'activité des neurones afférents primaires vestibulaires ¹³ in vitro. Bien que le mécanisme de la lumière NIR ne est pas bien compris, la plupart des études par NIR ont suggéré que Nir stimule les mitochondries complexe IV (cytochrome c oxydase) ^14-17 pour faciliter le métabolisme cellulaire. Dans l'épithélium vestibulaire sensoriel la plaque sous-cutanée de cellules Je cheveux de type est dense dans les mitochondries ¹⁸ et en tant que telle peut représenter un site d'action pour le traitement Nir thérapeutique.

Ici, un bref régime de traitement non invasif des transcranially appliqué Nir qui peut être utilisé pour mesurer le métabolisme cellulaire (et par voie de conséquence, la fonction mitochondriale) dans l'épithélium vestibulaire sensoriel de la souris est décrit. En outre examiné est une préparation de l'épithélium sensoriel vestibulaire et il est montré que NIR augmente l'expression d'un ubiquitonous antioxydant (superoxyde dismutase 1) dans l'épithélium sensoriel - précédemment révélé important pour les cheveux de la survie cellulaire ¹⁹ cochlée.

Protocole

Déclaration éthique: Toutes les procédures décrites ci-dessous ont été approuvés par l'Université du comité d'éthique animale Sydney.

1. Les animaux

NOTE: 1 et 8-9 mois, vieux souris (C57 / BL6) ont été obtenues auprès du Centre des ressources animales (Perth, Australie). Les souris ont été logés dans la facilité Bosch rongeurs à l'Université de Sydney.

1. Maison souris dans des cages standard de la souris sur un 12/12 h cycle lumière / obscurité avec accès à la nourriture et de l'eau ad libitum.
2. Divisez souris dans chaque groupe d'âge dans le proche infrarouge (NIR) traités, ou fictive des groupes (de contrôle) traités à titre de comparaison.

2. proche infrarouge (NIR) irradiation et le traitement Sham

1. Rasez la fourrure sur la région de la tête et du cou de la souris avec un rasoir électrique aussi étroitement que possible pour éviter la repousse rapide des cheveux avant la fin du régime de traitement. Afin de maintenir le statut exempt d'agents pathogènes des souris, utiliser 70% d'éthanolpour nettoyer les instruments de rasage entre les animaux et du désinfectant F10 vétérinaire entre les animaux des cages séparées. Pour ce faire, deux à trois jours avant le début du traitement pour que les animaux ne sont pas trop manipulé.
2. Retenez la souris en maintenant l'extrémité proximale de la queue et lui permettre de se détendre dans la paume d'une main dessus ou un banc de manière à minimiser le stress qui pourrait conduire à des résultats erronés.
3. Tenez le NIR (670 nm) LED (diode électroluminescente) périphérique 1-2 cm de la surface exposée (rasé) et allumer l'appareil pendant 90 secondes (figure 1A).
   REMARQUE: le changement de température à la suite de l'exposition de 90 secondes a été mesurée comme étant <0,2 ° C dans 100 ml d'eau.
4. Répétez les étapes 2.2 à 2.3 pour le groupe d'animaux de traitement de l'imposture, mais laisser l'appareil éteint (figure 1B).
5. Répétez les étapes 2.2 à 2.3 pour le groupe de traitement Nir bloqué des animaux, mais couvre l'appareil avec du papier d'aluminium.
6. Répétez les étapes 2.2 à 2.5 tous les jours à approximate intervalles de 24 heures pendant 5 jours consécutifs.
7. Extraire l'épithélium vestibulaire sensoriel (3 crêtes et une macula utriculaire) des deux oreilles sur le post-traitement cinquième jour (voir la section 3 ci-dessous).

3. Extraction de tissus ²⁰

1. Préparer 300 ml d'une base de glycérol liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) consistant en (en mM): 26 NaHCO _3, 11 le glucose, le glycerol 250, KCl 2,5, 1,2 NaH ₂ PO _4, 1,2 MgCl _2, CaCl ₂ et 2,5. Avant l'addition de CaCl _2, le gaz de la solution avec du carbogène (95% O ₂ et 5% CO ₂₎ pour établir un pH de 7,4 et éviter la précipitation de calcium (turbidité). Refroidir la solution dans un congélateur à -80 ° C pendant 45 minutes de sorte qu'un coulis de glace est formée.
2. Préparer le tampon de lyse d'isolement d'ARN dans des microtubes meilleurs vis marqués (arrête l'éclatement de couvercles lorsque les changements de pression du tube entre gel et dégel dans l'azote liquide) selonaux instructions du fabricant ou les pratiques de laboratoire habituelles. Avoir l'azote liquide prêt dans un flacon en aluminium de Dewar.
   REMARQUE: Utiliser des vêtements de protection et eyeware lors de la manipulation de l'azote liquide. Assurez-vous que l'azote liquide est utilisé dans une pièce bien aérée que le volume de sa forme de gaz est d'environ 700 fois supérieur à celui de sa forme liquide et peut causer l'asphyxie.
3. Profondément anesthésier les souris avec la kétamine (400 mg / kg) par une injection intra-péritonéale. Laisser le réflexe des membres postérieurs se calmer complètement comme une indication que les souris sont pleinement anesthésiés.
4. Décapiter souris avec des ciseaux pointus en acier inoxydable et faire une incision le long de la peau sagittale du crâne à l'aide d'une lame de rasoir (arrondi # 22). À ce stade et les étapes tout au long de 3.5 à 3.9, gardez la voûte crânienne, le cerveau et appareil vestibulaire sous-jacente aussi frais que possible par l'application régulière de la glace-froid ACSF sur le tissu.
5. En utilisant le bras de ciseaux pointus de modèle standard faire un small incision dans le crâne au Lambda et couper le long de la suture sagittale.
6. Glisser doucement un bras de rongeurs peu profondes sous l'os pariétal maintien de la lame le plus près possible de la surface inférieure de l'os sans glisser le cerveau. Fixez et retirez l'os pariétal latéralement et l'os occipital en arrière jusqu'à ce que le cerveau est exposé.
7. Utilisez une petite spatule en acier inoxydable et soulevez le cerveau loin de la partie antérieure et fosse cérébrale moyenne pour exposer le nerf vestibulaire (CN VIII). Transect le nerf pour éviter des tensions inutiles sur les axones afférents primaires qui innervent directement les cellules ciliées vestibulaires.
8. Retirer le cerveau in toto après transection du CN VIII.
9. Observez le labyrinthe osseux contenant la cochlée et les organes vestibulaires périphériques dans la fosse cérébrale moyenne. Faire deux petites incisions à côté de chaque labyrinthe osseux et exciser toute la structure en tenant le canal semi-circulaire antérieure et en tirant plus tardallié.
10. Immerger immédiatement labyrinthes excisées dans un plat contenant dissection solution ACSF glacée (comme décrit dans l'étape 3.1) tout en perfusion continue avec carbogène.
11. Sous un stéréomicroscope, maintenez le labyrinthe par la cochlée et le fixer au fond du plat avec une pince.
    1. Utilisez une pince droite fines rayer une petite ouverture dans l'os au-dessus du canal semi-circulaire (SSC) ampoule antérieure.
    2. Agrandir doucement cette ouverture en atteignant immédiatement sous l'os et pichenette vers l'extérieur de l'ampoule. Soyez prudent ici pour ne pas pousser pince dans l'ouverture et endommager le labyrinthe membraneux fragile ci-dessous. Continuez de cette façon jusqu'à ce que le utricule, antérieure et latérale ampoules sont tous exposés. Si possible enlever l'ampoule postérieure aussi.
12. En utilisant des pinces fines, soulevez doucement le utricule et ampoules loin du labyrinthe osseux jusqu'à ce qu'ils soient complètement détachés. Lorsque cela est possible, les tenirpar leurs canaux semi-circulaires associés pour éviter d'endommager l'épithélium sensoriel. Dans certains cas, la partie proximale du canal semi-circulaire membraneuse peut être nécessaire de couper avec des ciseaux iris pour libérer les ampoules de l'os.
13. Saisir fermement les organes vestibulaires entre la pointe de pince et le lieu dans le tampon de lyse préparé plus tôt dans l'étape 3.2. Remuer doucement la pince autour dans le tampon pour assurer organes vestibulaires ont détaché de la pince. Voir ce est le cas en amenant les pinces au microscope stéréoscopique.
    1. Visser sur le couvercle de microtubules et de geler l'échantillon dans de l'azote liquide immédiatement.

4. Extraction de l'ARN et RT-PCR

1. Suivre les méthodes standard de l'ARN messager (ARNm) extraction selon les instructions du fabricant ou les protocoles de laboratoire préférés.
   REMARQUE: Un kit commercial qui a utilisé ARN porteurs pour aider à isoler de petits rendements de l'ARNm a été utilisé dans ceprotocole. Volumes d'élution plus basses peuvent être utilisées pour augmenter les concentrations finales de l'ARNm.
   NOTE: Négatif contrôles "pas d'enzymes" (CNE) et des contrôles "pas de modèle d'ADN» (NTC) doivent également être remplies pour assurer la validité des effets observés.
2. Appliquer les méthodes standard de la transcription inverse de l'ARNm en ADN complémentaire (ADNc) et l'amplification de gènes cibles ^{de 21 à 23.}

Résultats

Pour comparer l'impact du traitement NIR chez les jeunes (4 semaines) et plus âgés (8-9 mois) des souris, nous avons mesuré l'expression d'antioxydant superoxyde dismutase 1 (SOD-1) chez les jeunes (n = 16) et plus (n = 20) souris qui étaient Nir-traitée, sham-traitée, ou NIR bloqué. Figure 2 montre une augmentation significative de la β-actine normalisée SOD-1 expression de plus de 2 fois chez les jeunes Nir-animaux traités par rapport aux jeunes animaux sham (p <0,01) et les j...

Discussion

Les résultats représentatifs décrits ici montrent que brève prestation transcrânienne de la lumière NIR (90 sec / jour pendant 5 jours) est suffisant pour élever les niveaux d'expression antioxydant chez les souris âgées par rapport aux souris sham. Alors que la chaleur émise pourrait représenter une source de mitochondrial et / ou l'activation neuronale, tels que déclarés pour vestibulaire de rat afférences ²⁴ - notre mesure de la chaleur émise par le NIR LED dispositif était <0,2 ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Quantum WARP 10	Quantum Devices	2070N030-A
Screw top microtubules	Quality Scientific Plastics	520-GRD-Q
Ketamine	Parnell, Alexandria Australia
Standard Pattern Scissors	FST	14001-12
Carbon steel Surgical Blades #22	Livingstone	SBLDCL 22
Friedman-Pearson Rongeurs	FST	16221-14
Stereo microscope	Leica Microsystems	A60S
Dumont #5 SF Forceps	FST	11252-00
Isolate II RNA Micro Kit	Bioline	BIO-52075