التصور المباشر من الفئران الظهرية القوقعة نواة لOptogenetic تحفيز من المسار السمعي

Summary

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

Abstract

وقد تم إلى حد كبير هبط التحقيق في استخدام بوساطة فيروس نقل الجينات لاعتقال أو عكس فقدان السمع إلى النظام السمعي المحيطي. وقد درست قليل من الدراسات نقل الجينات إلى النظام السمعي المركزي. النواة الظهرية قوقعة (DCN) من الدماغ، الذي يحتوي على الخلايا العصبية من الدرجة الثانية من المسار السمعي، هو موقع محتمل لنقل الجينات. في هذا البروتوكول، ويتجلى تقنية لالتعرض المباشر والحد الأقصى من DCN الفئران عن طريق نهج الحفرة الخلفية. هذا النهج يسمح لأي عملية جراحية حادة أو البقاء على قيد الحياة. وبعد رؤية مباشرة للDCN، مجموعة من التجارب ممكنة، بما في ذلك حقن opsins في نواة القوقعة والتحفيز لاحق من الألياف البصرية بالإضافة إلى ضوء الليزر الأزرق. التجارب الفسيولوجيا العصبية الأخرى، مثل التحفيز الكهربائي واقتفاء أثر حاقن العصبية هي أيضا مجدية. إن مستوى visualizaنشوئها ومدة التحفيز جعل تحقيقه هذا النهج ينطبق على مجموعة واسعة من التجارب.

Introduction

Virus-mediated gene transfer to reverse hearing loss has largely been focused on the peripheral auditory system.¹ Targeting the cochlea, investigators have examined a host of delivery routes, including osmotic minipump infusion², vector-transgene complex-soaked Gelfoam®² or gelatin sponge³, direct microinjection⁴; numerous gene transfer vectors, including adeno-associated viral vectors^5,6, lentiviral vectors⁷, and cationic liposomes²; and the dissemination of gene transfer vectors beyond the target tissue². Most recently, adeno-associated virus (AAV)-1 has been introduced in the cochlea in order to treat deafness in mice due to loss of vesicular glutamate transporter-3.⁸ Further, the application of optogenetics in peripheral auditory system has recently been described.⁹

Few studies, however, have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem contain second order neurons of the auditory pathway. While gene transfer techniques in the cochlear nucleus (CN) may be utilized for a host of investigations, gene transfer of opsins, light-sensitive proteins, to the DCN may also be utilized to enable optogenetics-based experimental techniques. Following virus-mediated gene transfer delivery of an opsin, such as channelrhodopsin-2 (ChR2), the neurons of the DCN becomes sensitive to light stimuli. Optogenetic gene transfer has been previously attempted in several brainstem regions, including the rat retrotrapezoid nucleus, mouse locus coeruleus, monkey superior colliculus, and mouse ventral tegmental area.^10-14

Recently, investigators have examined the use of optogenetics in the DCN.^15,16 The DCN is the location of placement of auditory brainstem implants in humans, making it an attractive part of the auditory system to study for translational studies on auditory neuroprostheses. However, given the location of the DCN, surgical exposure is challenging. The technique described herein provides a protocol for maximal exposure of the DCN via posterior fossa approach to enable viral vector gene transfer and optogenetics-based experiments in a murine model. Previous studies used stereotactic microinjection into the DCN with channelrhodopsin-2.¹⁶ Stereotaxic injections, however, are potentially less accurate than injections made by direct visualization, especially in a nucleus as small and deep along the brainstem as the DCN. Transgenic mice expressing tissue specific proteins in the CN are also an attractive option and would obviate the need for gene transfer. Our protocol for exposure of the DCN would also work in transgenic mice as the DCN would need to be directly exposed for optical stimulation. This technique for surgical exposure of the DCN is adapted from previous protocols involving recordings from the auditory nerve and cochlear nucleus in mice and rat models.^15,17-20

The overall goal of the protocol is to provide direct exposure to the CN to allow for gene transfer techniques. More specifically, the approach is compatible with both acute and survival surgery and the preparation can be repeated in the same animal for subsequent neurophysiological testing. The direct exposure of the DCN protocol has implications for optogenetics- and virus-mediated gene transfer-based experimentation in other nuclei of the brainstem.

Protocol

ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الإجراءات التجريبية وفقا للجنة رعاية الحيوان واستخدام ماساتشوستس العين والأذن مستوصف ومدرسة هارفارد الطبية، والتي تتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان الوطنية، بما في ذلك سياسة الصحة العامة خدمة للرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية، و دليل ILAR، وقانون رعاية الحيوان. الإجراءات التجريبية المذكورة أدناه التعرض التفاصيل من DCN الأيسر. استخدام الأدوات المعقمة أثناء أداء الجراحة البقاء على قيد الحياة.

1. حج القحف الابتدائية والظهرية القوقعة نواة التعرض

1. خدر
   1. تخدير ماوس، الذين تتراوح أعمارهم بين 8-12 أسابيع، وزنها 18-24 غ، مع زيلازين 20 ملغ / كغ والكيتامين 100 ملغ / كغ عن طريق إدارة داخل الصفاق. تأكيد التخدير المناسبة من خلال رصد معدل ضربات القلب ومعدل التنفس، فضلا عن أخمص القدمين قرصة الانسحاب لا ارادي. مكان البيطري مرهم على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير. مرة واحدة على نحو كاف تحت التخدير، والشعر يحلق المغطي رانه فروة الرأس لتوفير إمكانية الوصول دون عائق إلى موقع الجراحية.
2. المواقع الجراحي
   1. ضع الماوس بشكل آمن في حامل التجسيمي الحيوانات الصغيرة، والذي عقد في مكان من قبل المشبك الخطم.
   2. تأكد من أن المشبك خطم واهية بما يكفي للسماح للتنفس كافية ولكن ضيق بما يكفي لشل تماما الرأس من الفأرة. إذا كان رئيس الماوس واهية، ومن المرجح أن تسقط من صاحب الرأس أثناء الجزء حج القحف الداخلي الحيوان.
   3. وضع أقطاب كهربائية الدماغ السمعية زرع في الأزياء القياسية، والذي يسمح لرصد معدل ضربات القلب. وينبغي رصد معدل التنفس عن طريق التصور. لاحظ أن معدل ضربات القلب الطبيعي ومعدل التنفس وسوف تختلف تبعا للعمر من الفأرة.
   4. يتم وضع ميزان الحرارة ويتم ضمان euthermia عن طريق وضع على بطانية التدفئة homeothermic.
3. شق الجلد والتعرض للعظام الجداريين والقفوية من الجمجمة
   1. تحت microscمكتب مستشار رئيس الوزراء، وجعل شق عمودي من خلال الجلد تبدأ في خط الوسط، مباشرة بين الصيوان، وتمتد إلى الجزء الذيلية من قفا. بعد خط الوسط شق الجلد، تهجير الجلد أفقيا. تصور العضلات التي تغطي ترك الجانب الخلفي من الجمجمة.
   2. إزالة العضلات التي تغمر الأيسر الجدارية، بين الجداريين، والعظام القفوية من الجمجمة عن طريق التفكك المرفقات العضلات بالعظام كل منها مع مشرط أو مقص القزحية. مراقبة درجة صغيرة من النزيف على طول حواف قطع العضلات. تقليل ذلك عن طريق ضغط لطيف مع قضيب من القطن ذات الرؤوس لمدة 10-15 ثانية.
4. المغطي حج القحف القوقعة نواة
   1. تحديد خطوط خياطة ذات الصلة، بما في ذلك خطوط الغرز السهمي وامدا (الشكل 1، لوحة اليسار).
   2. باستخدام رينجرز، وجعل حج القحف على العظم الجداري، غادر من خط الوسط، ~ 2 ملم الذيلية إلى خط امدا خياطة. هذه المنطقة يعتلي على DCN.
   3. Followinز حج القحف، ومراقبة طبقة رقيقة من الجافية أن يعتلي المخيخ. باستخدام شفرة مشرط، وإزالة الجافية. (الشكل 1، لوحة الأوسط).
      ملاحظة: إزالة الجافية قد تتسبب درجة صغيرة من النزيف. والقصد من هذا عملية استخدام شفرة مشرط لإزالة الجافية إلى تقليل كمية فقدان الدم أثناء التطلع المخيخ، والتي سوف تجمع على سطح الدماغ وتحديد غامضة من DCN. إجمالي حجم دم الفأر هو ~ 1.5 مل لا ينبغي أن تتجاوز> من 15٪. إذا تجاوز نزيف هذا المبلغ، وينبغي توفير الفأر مع مع مكملات السوائل.
   4. إزالة الدم متخثر تتراكب المخيخ مع قضيب من القطن طرف. اختياريا، بالتنقيط بلطف المالحة باستخدام نقطة الأسنان على المخيخ لمسح الدم بعيدا الدم.
5. مخيخي الطموح
   1. باستخدام الشفط الفرنسي 5، نضح الجزء الجانبي الأكثر من المخيخ الأيسر تغمر DCN حتى DCN هو مقارنةالسياقية (الشكل 1، لوحة يمين). إزالة ما يقرب من 1/4 إلى 1/3 من المخيخ الأيسر. المعلم الرئيسي المحاذي لDCN هو أمبولة القناة الهلالية العلوية.
      ملاحظة: الطموح من المخيخ هي الخطوة الرئيسية للبروتوكول. يتم تنفيذ تطلع موجهة من المخيخ أكبر قدر من النجاح في حال حدوثه في محاولة واحدة وليس مع يمر متعددة من شفط وهذا سوف يسبب النزيف. للمساعدة في الطموح، تعيين البؤري للمجهر على عمق المتوقع للCN، والتي ستكون البعيدة قليلا إلى السطح من المخيخ. ووضع البؤري للCN تحسين التصور وضمان وجود صورة حادة.
   2. ومن المتوقع التالية الطموح، المزيد من النزيف، السائل النخاعي (CSF) بناء المتابعة، وتشريد المخيخ على DCN. غرس 0.5 سم مكعب من المياه المالحة عقيمة بسرعة في حج القحف لمنع تخثر الدم. مزيج من اللمس لطيف مع نقطة الأسنان وشفط قد تكون ثمتستخدم لازالة مسار لرؤية مباشرة للDCN. عدم الاتصال مباشرة سطح DCN.

2. حقن مكروي الضغط لبوساطة الفيروسات نقل الجينات والإنعاش الجراحي

1. بعد DCN خالية من الدم المغطي وCSF ومرئيا بوضوح، وجعل إبر دقيقة الضغط في DCN باستخدام 10 ميكرولتر هاميلتون حقنة على مدى فترة 2 دقيقة.
2. إدخال الإبرة مع مياداة مجهرية حتى غيض لم يعد مرئية تحت سطح DCN.
3. لتحقيق الأداء الأمثل، واستخدام 33 أو 34 إبرة قياس (استخدام حقنة gastight مع إبرة قياس 34) مع شطبة الضحلة، مثل 45 درجة، للحد من صدمة حادة وتوطين حجم الحقن داخل DCN، وهي رقيقة و بنية الدماغ الضحلة (<300 ميكرون سميكة).
   ملاحظة: أدوات حقن مكروي أخرى يمكن استخدامها مقرا لها. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون أداة حقن مرونة للسماح لبعض طفيف بند، إذا لزم الأمر لاستهداف مباشرة DCN. وعلاوة على ذلك، كما بتحريك الماوس قليلا في جميع أنحاء الداخلي بسبب التنفس، يجب أن تكون أداة قوية بما يكفي لتحمل كميات ضئيلة من الحركة.

3. استعادة الجراحي

1. على الفور حقن التالية، وإعادة تقارب الجلد والسماح الماوس لاستعادة الانتعاش في الإجراء القياسي. سوف تبقى المخيخ وندبا في ملء تجويف الناجمة عن تطلع المخيخ. باستمرار مراقبة الحيوانات حتى يتم استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية. مراقبة معدل ضربات القلب ومعدل التنفس، وكذلك القدرة على إطعام.
   يتم إرجاع أية الحيوان الذي خضع لعملية جراحية لقفص مع الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما: ملاحظة.
2. إذا يبدأ الماوس على المشي في دوائر بعد العملية (<5٪ من الحالات)، وعادة 2-4 ساعة بعد إغلاق شق الجلد، وتضحي فورا الماوس، لأنه على الأرجح تغذية الوقت صعبة. تيومن المرجح الآثار الجانبية له نظرا لتطلع المخيخ. يجب مراقبة الحيوانات لآلام بعد العمل الجراحي، ويجب أن تعطى المخدرات المناسبة لضمان راحة الحيوان على أساس المعايير المؤسسية. قد تكون المضادات الحيوية اللازمة، إذا أدلة على العدوى.

4. الثانوي حج القحف والقوقعة نواة التعرض

1. بعد 2-4 أسابيع للشفاء وبوساطة الفيروسات الجينات نقل الحضانة، وإعادة تخدير واحد حقن سابقا الماوس وكرر الخطوة 1،1-1،5 فترة حضانة الأمثل يختلف مع نوع الجين المنقول.
2. إزالة ندبة الأنسجة اكثر من موقع حج القحف من قبل مجموعة من ملاقط، مشرط، ورينجرز.
3. بعد تصور حج القحف، وتحديد مجموعة من المخيخ وندبا التي تغمر DCN المتبقية. استخدام شفط الفرنسي 5 إلى نضح المخيخ المغطي / ندبا (على غرار تطلع المخيخ السابق).
4. التالية الطموح، ونتوقع المزيد من النزيف، CSF بuild المتابعة، والبتات المتبقية من المخيخ. إدخال بسرعة المالحة في حج القحف لمنع تخثر الدم. استخدام مزيج من لطيف اللمس نقطة الأسنان والشفط لتمهيد الطريق لرؤية مباشرة للDCN.
5. مراقبة سطح DCN. إجراء تجارب علم وظائف الأعضاء على أساس علم البصريات الوراثي كما DCN الآن يمكن الوصول إليها. إدخال التحفيز خفيفة، على سبيل المثال مع الألياف البصرية (الشكل 2)، لدفع التجربة على أساس علم البصريات الوراثي.

5. علم الأنسجة

1. وبعد الانتهاء من التجارب، والموت ببطء الفأر مع جرعة زائدة من الكيتامين. يروي الماوس مع محلول ملحي تليها بارافورمالدهيد 4٪.
2. استخراج الدماغ من الجمجمة وبعد الإصلاح، لمدة 2 ساعة. Cryoprotect الدماغ في 30٪ سكروز لمدة 24-48 ساعة. قسم الدماغ باستخدام ناظم البرد قياسي باستخدام 60 ميكرون أقسام.

النتائج

الجزئي مخيخي الطموح يوضح الوصول إلى القوقعة نواة

بعد إزالة الجلد والعضلات التي تغمر الجمجمة، ومعالم سطح الجمجمة، مثل خطوط الدرز الإكليلي وLAMDA، ​​وإظهار توطين التقريبي للحج القحف. وبعد حج القحف مع رينجرز، هو تصور المخيخ. طم...

Discussion

وتصف هذه الورقة تقنية التصور المباشر للDCN في نموذج الفئران للتلاعب من النظام السمعي المركزي. النهج المبين التصور المباشر يوفر مزايا هامة على البديل الرئيسي، والتي هي نهج التجسيمي. في المقام الأول، والتصور المباشر للDCN يسمح للتأكيد فوري للموقع من جذع الدماغ، في حين أ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic holder	Stoelting	51500
Homeothermic blanket	Harvard	507214
Scalpel blade #11	Fine Surgical Tools	10011-00
Iris scissor	Fine Surgical Tools	14084-08
5 French suction	Symmetry Surgical	2777914
Dental Points	Henry Schein	100-8170
Bone rongeur	Fine Surgical Tools	16020-14
10 µl Hamilton syringe	Hamilton	7633-01
34 gauge, needle	Hamilton	207434
Rongeurs	Fine Surgical Tools	16021-14