Direkte Visualisierung der Murine Rücken Cochlear Nucleus für optogenetische Stimulation der Hörbahn

Zusammenfassung

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

Zusammenfassung

Untersuchung über die Verwendung von virusvermittelten Gentransfer zu verhaften oder rückwärts Hörverlust hat sich weitgehend auf die Umfangs Hörsystem verbannt worden. Nur wenige Studien haben den Gentransfer mit dem zentralen auditorischen Systems untersucht. Dorsalen cochlearen Nukleus (DCN) des Hirnstamms, die Neuronen zweiter Ordnung der Hörbahn enthält, ist eine potentielle Stelle für einen Gentransfer. In diesem Protokoll wird ein Verfahren zur direkten und maximale Exposition des murinen DCN über einen posterioren Fossa Ansatz demonstriert. Dieser Ansatz ermöglicht entweder akut oder das Überleben der Operation. Nach direkten Visualisierung des DCN, eine Vielzahl von Experimenten sind möglich, einschließlich Injektion in die Opsinen Cochleariskern und nachfolgende Stimulation durch eine optische Faser zu einer Blaulicht-Laser gekoppelt ist. Andere Neuro Experimenten wie elektrische Stimulation und neuronalen Injektor Kurven sind denkbar. Die Höhe der Visualisierungstion und die Dauer der Stimulation erreichbar machen diesen Ansatz für eine Vielzahl von Experimenten.

Einleitung

Virus-mediated gene transfer to reverse hearing loss has largely been focused on the peripheral auditory system.¹ Targeting the cochlea, investigators have examined a host of delivery routes, including osmotic minipump infusion², vector-transgene complex-soaked Gelfoam®² or gelatin sponge³, direct microinjection⁴; numerous gene transfer vectors, including adeno-associated viral vectors^5,6, lentiviral vectors⁷, and cationic liposomes²; and the dissemination of gene transfer vectors beyond the target tissue². Most recently, adeno-associated virus (AAV)-1 has been introduced in the cochlea in order to treat deafness in mice due to loss of vesicular glutamate transporter-3.⁸ Further, the application of optogenetics in peripheral auditory system has recently been described.⁹

Few studies, however, have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem contain second order neurons of the auditory pathway. While gene transfer techniques in the cochlear nucleus (CN) may be utilized for a host of investigations, gene transfer of opsins, light-sensitive proteins, to the DCN may also be utilized to enable optogenetics-based experimental techniques. Following virus-mediated gene transfer delivery of an opsin, such as channelrhodopsin-2 (ChR2), the neurons of the DCN becomes sensitive to light stimuli. Optogenetic gene transfer has been previously attempted in several brainstem regions, including the rat retrotrapezoid nucleus, mouse locus coeruleus, monkey superior colliculus, and mouse ventral tegmental area.^10-14

Recently, investigators have examined the use of optogenetics in the DCN.^15,16 The DCN is the location of placement of auditory brainstem implants in humans, making it an attractive part of the auditory system to study for translational studies on auditory neuroprostheses. However, given the location of the DCN, surgical exposure is challenging. The technique described herein provides a protocol for maximal exposure of the DCN via posterior fossa approach to enable viral vector gene transfer and optogenetics-based experiments in a murine model. Previous studies used stereotactic microinjection into the DCN with channelrhodopsin-2.¹⁶ Stereotaxic injections, however, are potentially less accurate than injections made by direct visualization, especially in a nucleus as small and deep along the brainstem as the DCN. Transgenic mice expressing tissue specific proteins in the CN are also an attractive option and would obviate the need for gene transfer. Our protocol for exposure of the DCN would also work in transgenic mice as the DCN would need to be directly exposed for optical stimulation. This technique for surgical exposure of the DCN is adapted from previous protocols involving recordings from the auditory nerve and cochlear nucleus in mice and rat models.^15,17-20

The overall goal of the protocol is to provide direct exposure to the CN to allow for gene transfer techniques. More specifically, the approach is compatible with both acute and survival surgery and the preparation can be repeated in the same animal for subsequent neurophysiological testing. The direct exposure of the DCN protocol has implications for optogenetics- and virus-mediated gene transfer-based experimentation in other nuclei of the brainstem.

Protokoll

HINWEIS: Alle experimentellen Verfahren sind in Übereinstimmung mit dem Animal Care und Verwenden Ausschuss der Massachusetts Eye and Ear Infirmary und der Harvard Medical School, die nationalen Tierpflege Richtlinien befolgen, einschließlich Public Health Service Politik über humane Pflege und Verwendung von Labortieren, die durchgeführt ILAR Guide, und das Tierschutzgesetz. Experimentelle Verfahren nachstehend im Detail Exposition der linken DCN aufgeführt. Verwenden Sie sterile Instrumente während der Durchführung Überleben Chirurgie.

1. Primär Kraniotomie und Rücken Cochlear Nucleus Belichtungs

1. Anästhesie
   1. Anesthetize einer Maus im Alter von 8-12 Wochen mit einem Gewicht von 18-24 g, Xylazin 20 mg / kg Ketamin 100 mg / kg über eine intraperitoneale Verabreichung. Überprüfen Sie die Anästhesie durch die Überwachung der Herzfrequenz, Atemfrequenz, sowie toe Prise Rückzug Reflex. Platz Tierarzt Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Sobald ausreichend unter Narkose, Rasur Haarüberlagert ter Kopfhaut, um ungehinderten Zugang zu der Operationsstelle zu schaffen.
2. Chirurgische Positionierung
   1. Platzieren Sie die Maus sicher in einer Kleintierstereotaktischen Halterung, an Ort und Stelle durch eine Schnauze Klammer gehalten.
   2. Stellen Sie sicher, dass die Schnauze Klemme locker genug, um für eine ausreichende Atmung aber fest genug, lassen den Kopf der Maus vollständig zu immobilisieren. Wenn die Maus den Kopf locker ist, ist das Tier wahrscheinlich während der Kraniotomie Teil der Verfahren des Kopfhalters fallen.
   3. Zeigen auditorischen Hirnstamm-Implantat Elektroden in üblicher Weise, die für die Überwachung der Herzfrequenz ermöglicht. Die Atemfrequenz sollte durch Visualisierung überwacht werden. Beachten Sie, dass die normale Herzfrequenz und die Atemfrequenz wird in Abhängigkeit vom Alter des Maus variieren.
   4. Ein Thermometer ist auf einer homeothermic Heizdecke platziert und über die Platzierung euthermia gewährleistet ist.
3. Hautschnitt und Exposition der interparietal und occipital Knochen des Schädels
   1. Unter einem Microscopa, stellen ein vertikaler Schnitt durch die Haut ausgehend von der Mittellinie, direkt zwischen der Ohrmuschel und sich bis zum Schwanzteil des Hinterhauptbein. Nach der Mittellinie Hautschnitt, verdrängen die Haut seitlich. Visualisieren Sie die Muskeln für den verließ den hinteren Teil des Schädels.
   2. Entfernen Muskel über dem linken Scheitel, interparietal und occipital Knochen des Schädels durch Exartikulation der Muskelansätze an ihre jeweiligen Knochen mit einem Skalpell oder Iris Schere. Beachten Sie ein kleines Maß an Blutungen entlang der Schnittmuskel Kanten. Minimieren Sie dies durch sanften Druck mit einem Wattestäbchen für 10-15 Sek.
4. Kraniotomie darüberliegenden Cochlear Nucleus
   1. Identifizieren Sie relevanten Nahtlinien, einschließlich sagittalen und Lambdanähte Linien (Abbildung 1, links).
   2. Mit Rongeure, machen Sie eine Kraniotomie über die Inkabein, links von der Mittellinie, ~ 2 mm kaudal der Lambda-Naht. Diese Region liegt über dem DCN.
   3. Following Kraniotomie, beachten Sie eine dünne Schicht der Dura, die das Kleinhirn überlagert. Mit einem Skalpell, entfernen Sie die Dura. (Bild 1, Mitte).
      HINWEIS: Das Entfernen der Dura kann ein kleines Maß an Blutungen. Dieses Verfahren der Verwendung der Skalpellklinge, um die Dura zu entfernen, ist beabsichtigt, um die Menge des Blutverlustes während der Cerebellum Aspiration, die auf der Hirnoberfläche und undurchsichtig Identifizierung des DCN Pool wird reduzieren. Gesamtblutvolumen von Maus ist ~ 1,5 ml nicht überschreiten soll> als 15%. Wenn die Blutung diesen Betrag übersteigt, sollte die Maus mit mit Flüssigkeit Ergänzung zur Verfügung gestellt werden.
   4. Entfernen geronnenem Blut überlagert das Kleinhirn mit dem Wattestäbchen. Optional sanft tropfen Kochsalzlösung mit einem Zahnpunkt auf das Kleinhirn, um Blut zu Blut entfernt.
5. Kleinhirn-Aspiration
   1. Verwendung eines 5 Französisch Saug absaugen seitlichen äußersten Abschnitt der linken Cerebellum über der DCN bis der DCN visBuchs (Abbildung 1, rechts). Entfernen etwa 1/4 bis 1/3 des linken Kleinhirn. Das Wahrzeichen neben dem DCN ist die Ampulle des oberen Bogenganges.
      HINWEIS: Aspiration des Kleinhirns ist der entscheidende Schritt des Protokolls. Gerichtete Streben des Cerebellum meisten erfolgreich durchgeführt, wenn es in einem einzigen Versuch auftritt und nicht mit Mehrfachdurchgänge des Saug da dies zu Blutungen führen. In Ansaugen zu unterstützen, setzen die Brennebene des Mikroskops an der erwarteten Tiefe des CN, die geringfügig distal der Oberfläche der Kleinhirn wird. Einstellen der Brennebene mit dem CN wird Visualisierung verbessern und ein scharfes Bild.
   2. Nach Aspiration, weitere Blutungen, Liquor (CSF) Aufbau und Kleinhirn Verschiebung auf der DCN erwartet. Vermitteln 0,5 cc steriler Kochsalzlösung schnell in die Kraniotomie Blutgerinnung verhindern. Eine Kombination aus sanften Abtupfen mit einem Zahnpunkt und Absaugung kann dannverwendet, um abzuräumen einen Weg für die direkte Visualisierung des DCN. Nicht direkt an die Oberfläche des DCN.

2. Druckmikroinjektion für Virus-vermittelte Gentransfer und chirurgische Wiederherstellung

1. Nachdem der DCN ist frei von überlagernden Blut und CSF und ist deutlich sichtbar, machen Druck Mikroinjektionen in das DCN mit einem 10 & mgr; l Hamilton-Spritze über einen Zeitraum 2 min.
2. Einführung der Nadel mit einem Mikromanipulator, bis die Spitze nicht mehr unter der Oberfläche des DCN sichtbar.
3. Für eine optimale Leistung verwenden Sie eine 33 oder 34 Gauge-Nadel (verwenden Sie eine gasdichte Spritze mit der 34-Gauge-Nadel) mit einem flachen Kegel, wie 45 °, um stumpfes Trauma zu minimieren und zu lokalisieren, das Injektionsvolumen im DCN, der ein dünner ist und seichten Hirnstruktur (<300 & mgr; m dick).
   Hinweis: andere Mikroinjektionsinstrumente genutzt basieren. Idealerweise sollte die Injektions Instrument flexibel sein, um für einige geringfügige ben ermöglichend, wenn nötig, direkt gezielt die DCN. Ferner ist, wie die Maus bewegt sich geringfügig, während des gesamten Verfahrens durch die Atmung, sollte das Gerät robust genug sein, um geringe Mengen an Bewegung zu widerstehen.

3. Chirurgische Wieder

1. Unmittelbar nach der Injektion wieder anzunähern, die Haut und lassen Sie die Maus, um per Standard Recovery-Verfahren zu erholen. Verbleibende Cerebellum und Narbengewebe in den Hohlraum durch Absaugen des Kleinhirns verursacht füllen. Ständig Tiere zu überwachen, bis genügend Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten. Überwachen Sie Herzfrequenz, Atemfrequenz, sowie die Fähigkeit zu ernähren.
   HINWEIS: Kein Tier, das einer Operation unterzogen wurde, wird in einen Käfig mit anderen Tieren zurückgegeben, bis vollständig erholt.
2. Wenn eine Maus fängt an, im Kreis nach der Operation zu gehen (<5% der Fälle), in der Regel 2-4 Stunden nach der Schließung der Hautschnitt, sofort opfern Sie die Maus, wie es würde wahrscheinlich eine schwierige Zeit Fütterung. Tseine Nebeneffekt ist durch Aspiration des Kleinhirns wahrscheinlich. Das Tier sollte bei Schmerzen nach der Operation überwacht und entsprechende Betäubungsmittel sollte der besseren Tier Komfort auf Grund institutioneller Normen werden. Antibiotika kann notwendig sein, wenn Anzeichen einer Infektion.

4. Sekundäre Kraniotomie und Cochlear Nucleus Belichtungs

1. Nach 2-4 Wochen der Heilung und virusvermittelten Gentransfer Inkubation erneut anästhesiert eine vorher injizierten Maus und Schritt 1,1-1,5 optimale Inkubationszeit hängt von der Art des Gens überführt.
2. Entfernen Narbengewebe über die Kraniotomiestelle durch eine Kombination von Pinzette, Skalpell und Knochenzangen.
3. Nach der Visualisierung der Kraniotomie, identifizieren eine Kombination aus Rest über der DCN Kleinhirn und Narbengewebe. Verwenden Sie einen 5 Französisch Ansaugen darüber liegenden Kleinhirn / Narbengewebe (ähnlich wie das vorherige Kleinhirn Aspiration) anzusaugen.
4. Nach Aspiration, erwarten weitere Blutungen, CSF build-up, und die verbleibenden Bits des Kleinhirns. Schnell einzuführen Salzlösung in die Kraniotomie, um die Blutgerinnung zu verhindern. Verwenden Sie eine Kombination aus sanften Zahnpunkt Abtupfen und Absaugung, um den Weg für die direkte Visualisierung des DCN löschen.
5. Beachten Sie die Oberfläche des DCN. Führen Optogenetik basierte Physiologie Experimente wie DCN ist jetzt zugänglich. Einführung eines Lichtreizes, zum Beispiel mit einer optischen Faser (2), um eine Optogenetik basierenden Experiment fahren.

5. Histologie

1. Nach Abschluss der Experimente, einschläfern die Maus mit einer Überdosis von Ketamin. Perfundieren der Maus mit normaler Salzlösung, gefolgt von 4% Paraformaldehyd.
2. Entpacken Sie die Hirnstamm aus dem Schädel und Post-fix für 2 Stunden. Cryoprotect den Hirnstamm in 30% Saccharose für 24-48 Std. Abschnitt der Hirnstamm mit einem Standard-Kryostaten mit 60 um-Schnitte.

Ergebnisse

Teilweise Cerebellar Aspiration den Zugang zu der Cochlear Nucleus

Nachdem die Haut und Muskeln, die über dem Schädel sind, Schädeloberfläche Sehenswürdigkeiten wie den koronaren und lamda Nahtlinien entfernt, zeigen die ungefähre Lokalisierung der Kraniotomie. Nach Kraniotomie mit Rongeure wird das Kleinhirn visualisiert. Sorgfältige Absaugung der kleinen Teil des Kleinhirns zeigt Visualisierung des CN, die dann injiziert werden kann (Abbildung 1).

Diskussion

Dieses Papier beschreibt die Technik der direkten Visualisierung des DCN im Mausmodell für die Manipulation des zentralen auditorischen Systems. Das skizzierte Ansatz der direkten Visualisierung bietet erhebliche Vorteile gegenüber dem Haupt Alternative, die stereotaktische Ansätze sind. In erster Linie die direkte Visualisierung des DCN ermöglicht sofortige Bestätigung der Website des Hirnstamms, während stereo Ansätze nicht direkte Visualisierung leisten. In Experimenten, die längere Inkubationszeiten erforder...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic holder	Stoelting	51500
Homeothermic blanket	Harvard	507214
Scalpel blade #11	Fine Surgical Tools	10011-00
Iris scissor	Fine Surgical Tools	14084-08
5 French suction	Symmetry Surgical	2777914
Dental Points	Henry Schein	100-8170
Bone rongeur	Fine Surgical Tools	16020-14
10 µl Hamilton syringe	Hamilton	7633-01
34 gauge, needle	Hamilton	207434
Rongeurs	Fine Surgical Tools	16021-14