İşitsel Yolu ve optogenetic Stimülasyon için Murin Dorsal Koklear Çekirdek Doğrudan Görselleştirme

Özet

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

Özet

Tutuklama veya işitme kaybı ters virüs aracılı gen transferi kullanımı soruşturma büyük ölçüde çevresel işitme sisteminin küme olmuştur. Birkaç çalışma, merkezi işitme sistemine gen transferi inceledik. işitsel yolun ikinci dereceden nöronları içeren beyin sapı dorsal koklear nükleus (DCN), gen transferi için potansiyel bir sitedir. Bu protokol, posterior fossa yaklaşımı ile kemirgen DCN doğrudan ve maksimal maruz kalma bir tekniktir gösterilmiştir. Bu yaklaşım, akut ya da hayatta kalma cerrahi sağlar. DCN doğrudan görselleştirme sonra, deney bir ana bilgisayar, bir mavi ışık lazer bağlanmış bir fiber optik ile koklear nükleus ve daha sonra stimülasyon içine opsins püskürtülmesi de dahil olmak üzere uygulanabilir. Böyle elektrik stimülasyonu ve nöral enjektör iz gibi diğer nörofizyoloji deneyler de mümkün bulunmaktadır. Visualiza düzeyiyon ve uyarılma süresi elde deneyler geniş bu yaklaşım uygulanamaz hale.

Giriş

Virus-mediated gene transfer to reverse hearing loss has largely been focused on the peripheral auditory system.¹ Targeting the cochlea, investigators have examined a host of delivery routes, including osmotic minipump infusion², vector-transgene complex-soaked Gelfoam®² or gelatin sponge³, direct microinjection⁴; numerous gene transfer vectors, including adeno-associated viral vectors^5,6, lentiviral vectors⁷, and cationic liposomes²; and the dissemination of gene transfer vectors beyond the target tissue². Most recently, adeno-associated virus (AAV)-1 has been introduced in the cochlea in order to treat deafness in mice due to loss of vesicular glutamate transporter-3.⁸ Further, the application of optogenetics in peripheral auditory system has recently been described.⁹

Few studies, however, have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem contain second order neurons of the auditory pathway. While gene transfer techniques in the cochlear nucleus (CN) may be utilized for a host of investigations, gene transfer of opsins, light-sensitive proteins, to the DCN may also be utilized to enable optogenetics-based experimental techniques. Following virus-mediated gene transfer delivery of an opsin, such as channelrhodopsin-2 (ChR2), the neurons of the DCN becomes sensitive to light stimuli. Optogenetic gene transfer has been previously attempted in several brainstem regions, including the rat retrotrapezoid nucleus, mouse locus coeruleus, monkey superior colliculus, and mouse ventral tegmental area.^10-14

Recently, investigators have examined the use of optogenetics in the DCN.^15,16 The DCN is the location of placement of auditory brainstem implants in humans, making it an attractive part of the auditory system to study for translational studies on auditory neuroprostheses. However, given the location of the DCN, surgical exposure is challenging. The technique described herein provides a protocol for maximal exposure of the DCN via posterior fossa approach to enable viral vector gene transfer and optogenetics-based experiments in a murine model. Previous studies used stereotactic microinjection into the DCN with channelrhodopsin-2.¹⁶ Stereotaxic injections, however, are potentially less accurate than injections made by direct visualization, especially in a nucleus as small and deep along the brainstem as the DCN. Transgenic mice expressing tissue specific proteins in the CN are also an attractive option and would obviate the need for gene transfer. Our protocol for exposure of the DCN would also work in transgenic mice as the DCN would need to be directly exposed for optical stimulation. This technique for surgical exposure of the DCN is adapted from previous protocols involving recordings from the auditory nerve and cochlear nucleus in mice and rat models.^15,17-20

The overall goal of the protocol is to provide direct exposure to the CN to allow for gene transfer techniques. More specifically, the approach is compatible with both acute and survival surgery and the preparation can be repeated in the same animal for subsequent neurophysiological testing. The direct exposure of the DCN protocol has implications for optogenetics- and virus-mediated gene transfer-based experimentation in other nuclei of the brainstem.

Protokol

NOT: Bütün deneysel prosedürler Halk Sağlığı Servisi İnsanca Bakım Politikası ve laboratuvar Hayvanların Kullanımı, dahil olmak üzere ulusal hayvan bakımı yönergeleri izleyin Massachusetts Göz Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Kulak Revir ve Harvard Tıp Okulu, uygun yapılmaktadır Ilar Kılavuzu ve Hayvan Refahı Yasası. Deneysel işlemler sol DCN detay maruz aşağıda listelenen. Sağkalım ameliyat yaparken steril aletler kullanın.

1. İlköğretim Kraniyotomi ve Dorsal Cochlear Nucleus Pozlama

1. Anestezi
   1. Bir intraperitonal uygulama yoluyla ksilazin 20 mg / kg ve ketamin 100 mg / kg ile 18-24 g ağırlığında 8-12 haftalık, yaşlı bir fare, anestezisi. Izleme kalp hızı, solunum hızı, yanı sıra ayak tutam çekilme refleksi ile uygun anestezi onaylayın. Gözleri yerleştirin veteriner merhem anestezi altında iken kuruluğu önlemek için. Bir kez yeterli anestezi altında, tıraş saç örten tO cerrahi siteye engelsiz erişim sağlamak için kafa derisi.
2. Cerrahi konumlandırma
   1. Bir burun kelepçe ile yerinde tutulan küçük bir hayvan steryotaksik tutucu, güvenli bir şekilde fare yerleştirin.
   2. Burun kelepçe tamamen fare kafasını hareketsiz yeterli solunum ama yeterince sıkı sağlamak için yeterli gevşek olduğundan emin olun. Fare kafası gevşek ise, hayvan prosedürünün kraniotomi bölümü sırasında baş yuvasından dışarı düşmesi muhtemeldir.
   3. Kalp hızı izleme sağlar standart moda, işitsel beyinsapı implantı elektrotları yerleştirin. Solunum hızı görselleştirme tarafından takip edilmelidir. Normal kalp hızı ve solunum hızı fare yaşına bağlı olarak değişecektir unutmayın.
   4. Bir homotermik ısıtma battaniye yerleştirme yoluyla bir termometre yerleştirilir ve euthermia sağlanır.
3. Cilt kesi ve kafatası interparietal ve oksipital kemikler maruz
   1. Bir Microsc altındaope, deri yoluyla dikey kesi doğrudan kepçesi arasında, orta hatta başlayan ve oksiputa kaudal kısmına uzanan yapmak. Orta hat cilt kesi ardından, yanal cildi yerinden. Kafatasının sol arka yönünü kapsayan kasları gözünüzde canlandırın.
   2. Bir neşter veya iris makas ile kendi kemiklere, kas ekleri dezartikülasyon ile kas sol parietal, interparietal örten ve kafatasının oksipital kemikleri çıkarın. Kesme kas kenarları boyunca kanama küçük bir derecede dikkat edin. 10-15 saniye için bir pamuk uçlu bir aplikatör ile hafif basınç ile bu en aza indirin.
4. Kranyotomi üstteki Cochlear Nucleus
   1. Sagital ve lambda sütür hatları (Şekil 1, Sol Panel) dahil olmak üzere ilgili dikiş hatları, tanımlayın.
   2. Rongeurs kullanarak, lambda dikiş hattına orta hat sol interparietal kemik üzerinde opera, ~ 2 mm kaudal yapmak. Bu bölge DCN üzerler.
   3. Following kraniotomi, beyincik üzerinde uzanan dura ince bir tabaka gözlemlemek. Bir neşter bıçak kullanarak, dura çıkarın. (Şekil 1, Orta Panel).
      Not: dura çıkarılması kanama küçük olmasına neden olabilir. Dura kaldırmak için neşter bıçak kullanarak Bu süreç beyin yüzeyinin ve DCN ve karanlık tanımlanmasına havuz olacak beyincik aspirasyon sırasında kan kaybı miktarını azaltmak için tasarlanmıştır. Fare toplam kan hacmi% 15 daha> ~ 1.5 ml geçmemelidir değildir. Kanama, bu miktarı aşarsa, fare sıvı takviyesi ile birlikte sağlanmalıdır.
   4. Pamuk uçlu aplikatör ile beyincik kaplayan pıhtılaşmış kan çıkarın. İsteğe bağlı olarak, yavaşça kan kanı temizlemek için beyincik üzerine bir diş noktası kullanarak tuzlu damla.
5. Serebellar Aspirasyon
   1. DCN karşısında olduğu kadar 5 Fransız emme kullanarak, DCN örten sol beyincik lateral-en bölümünü aspireual (Şekil 1, Sağ Panel). Sol beyincik yaklaşık 1/4 1/3 çıkarın. DCN bitişik ana dönüm superior semisirküler kanalın ampulla olduğunu.
      NOT: beyincik Aspirasyon protokolünün önemli bir adımdır. O kanamaya neden olur, bu gibi emme birden paslar ile bir tek denemede oluşur ve eğer beyinciğin Yönetmen aspirasyon en başarılı yapılır. Aspirasyon yardımcı olmak için, beyincik yüzeyine biraz uzak olacak CN, beklenen derinlikte mikroskop odak düzlemi ayarlanır. CN odak düzlemi ayarlanması görselleştirme geliştirmek ve keskin bir görüntü sağlayacaktır.
   2. DCN aşağıdaki aspirasyon, daha kanama, beyin omurilik sıvısı (BOS) birikmesi ve beyincik deplasman bekleniyor. Kan pıhtılaşmasını önlemek için hızla Kraniotomi içine steril serum fizyolojik 0.5 cc aşılamak. Bir diş alanına ve emme ile hafifçe vurma bir kombinasyonu daha sonra olabilirDCN doğrudan görüntülenmesi için bir yol temizlemek için kullanılır. Doğrudan DCN yüzeyine temas etmeyin.

Virüs-aracılı Gen Transferi ve Cerrahi Kurtarma 2. Basınç Mikroenjeksiyon

1. DCN örten kan ve CSF serbest olan ve net bir şekilde görülebilir sonra, 2 dakikalık bir süre boyunca, 10 ul Hamilton şırıngası kullanılarak DCN içine basınç microinjections olun.
2. Ucu artık DCN yüzeyinin altında görünür oluncaya kadar bir micromanipulator ile iğne tanıtın.
3. En iyi performans için, künt travma en aza indirmek ve bir ince DCN içinde enjeksiyon hacmi, lokalize, 45 ° olarak, sığ konik böyle bir 33 veya 34 gauge iğne (34 gauge iğne ile bir gaz geçirmez şırınga kullanın) kullanın ve sığ beyin yapısı (<300 mikron kalınlığında).
   NOT: Diğer mikroenjeksiyon aletleri kullanılan dayalı olabilir. İdeal olarak, enjeksiyon enstrüman bazı hafif ben izin vermek için esnek olmalıdırd eğer doğrudan DCN hedef için gerekli. Fare nedeniyle solunum prosedür boyunca hafifçe hareket gibi Ayrıca, enstrüman hareketinin küçük miktarlarda dayanacak kadar sağlam olmalıdır.

3. Cerrahi Kurtarma

1. Hemen ardından enjeksiyon, cilt yeniden yaklaştığı ve fare standart kurtarma prosedürüne göre kurtarmak için izin verir. Kalan beyincik ve skar dokusu beyincik aspirasyonu nedeniyle boşluğunda dolduracaktır. Yeterli bilinç sternum yatma korumak için sağlanıncaya kadar sürekli hayvanları izlemek. Kalp hızı, solunum sayısı, hem de besleme becerisi izleyin.
   NOT: Tamamen iyileşene kadar hiçbir hayvan ameliyatı geçirmiş diğer hayvanlarla bir kafese geri döner.
2. Bir fare operasyon sonrası çevrelerinde yürümeye başlarsa büyük olasılıkla zor bir zaman besleme olurdu gibi (

4. İkincil Kraniyotomi ve Cochlear Nucleus Pozlama

1. Şifa ve virüs aracılı gen transferi inkübasyon 2-4 hafta sonra, önceden enjekte fare ve adımı tekrarlayın 1,1-1,5 Optimal inkübasyon süresi aktarılan genin tipine göre değişir yeniden uyutmak.
2. Cımbız, neşter ve rongeurs bir kombinasyonu ile Kraniotomi sitesi üzerinden skar dokusu çıkarın.
3. Kraniotomiye görselleştirmek sonra, DCN örten beyincik ve skar dokusu kalan bir arada tanımlamak. Örten beyincik / (önceki serebellar aspirasyon benzer) skar dokusu aspire 5 Fransız emiş kullanın.
4. Aspirasyon ardından, daha kanama, BOS b bekliyoruzuild-up ve beyincik kalan bitleri. Hızla kan pıhtılaşmasını önlemek için Kraniotomi içine tuzlu tanıtmak. DCN doğrudan görselleştirme yolunu temizlemek için yumuşak diş nokta dabbing ve emme bir arada kullanın.
5. DCN yüzeyini gözlemlemek. DCN artık erişilebilir olduğu gibi Optogenetik-tabanlı fizyolojisi deneyleri. Bir Optogenetik tabanlı deney sürmek için, bir fiber optik (Şekil 2), örneğin, hafif bir uyarıcı, tanıtılması.

5. Histoloji

1. Deneylerin sonucu takiben, ketamin dozu ile fare euthanize. % 4 paraformaldehid tarafından takip normal tuzlu su ile fare serpmek.
2. 2 saat kafatası ve post-fix gelen beyin sapı ayıklayın. 24-48 saat süreyle% 30 sukroz içinde beyin sapı cryoprotect. Bölüm 60 mikron bölümleri kullanarak standart bir kriyostat kullanarak beyin sapı.

Sonuçlar

Kısmi Serebellar Aspirasyon Koklear Nucleus Erişim gösterir

Kafatası örten deri ve kas gibi koronal ve lamda sütür hatları gibi, kafatası yüzey işaretlerini, kaldırıldıktan sonra, Kraniotomi yaklaşık lokalizasyonu göstermektedir. Rongeurs ile kraniyotomi ardından, beyincik görüntülenmiştir. Serebellumun küçük bir kısmı dikkatlice aspire enjekte edilebilir CN, (Şekil 1) görselleştirme gösterir.

Mavi Iş?...

Tartışmalar

Bu kağıt, merkezi işitme sisteminin manipülasyonu için fare modelinde DCN doğrudan görselleştirme tekniği anlatılmaktadır. Doğrudan görselleştirme özetlenen yaklaşım stereotaksik yaklaşımlar ana alternatif üzerinde önemli avantajlar sağlar. Stereotaksik yaklaşımlar doğrudan görselleştirme göze değil oysa Öncelikle, DCN doğrudan görselleştirme, beyin sapı sitenin hemen onay veriyor. Virüs-aracılı gen transferi durumunda olduğu gibi, inkübasyon sürelerini uzun süreli gerektirecek d...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic holder	Stoelting	51500
Homeothermic blanket	Harvard	507214
Scalpel blade #11	Fine Surgical Tools	10011-00
Iris scissor	Fine Surgical Tools	14084-08
5 French suction	Symmetry Surgical	2777914
Dental Points	Henry Schein	100-8170
Bone rongeur	Fine Surgical Tools	16020-14
10 µl Hamilton syringe	Hamilton	7633-01
34 gauge, needle	Hamilton	207434
Rongeurs	Fine Surgical Tools	16021-14