تقنية وقت التفاضلية تلطيخ جانب كامل الثنائي جيل إزالة التعصيب لدراسة Ionocytes في السمك

Summary

This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation.

Abstract

ionocytes الخيشومية (ICS) هي الوحدات الوظيفية لتنظيم الأيونية في الأسماك. في البالغين، وجدوا على filamental وظهائر رقائقي من الخيشومية حيث أيونات النقل مثل نا ^+، الكلورين ^- والكالسيوم ²⁺ عبر مجموعة متنوعة من القنوات الأيونية والمضخات والمبادلات. ومعصب على الخيشومية مكتملة العظام خارجيا من قبل الوجه (VI)، اللساني البلعومي (IX) والمبهم (X) الأعصاب. في التاسع والعاشر الأعصاب هي أيضا مصدر خارجي من الخيشومي IC تعصيب. هنا، يتم وصف اثنين من التقنيات المستخدمة لدراسة تعصيب، وانتشار وتوزيع المرحلية: وقت تقنية التفاضلية تلطيخ وتقنية الخيشومية إزالة التعصيب ثنائية كاملة. لفترة وجيزة، ويتعرض ذهبية لصبغة الحبيبات الخيطية محددة الحيوي (على سبيل المثال، MitoTracker الأحمر) التي تصف (مضان أحمر) المرحلية الموجودة مسبقا. سمح الأسماك إما لاسترداد لمدة 3 - 5 ايام أو خضع على الفور كامل الخيشومية إزالة التعصيب الثنائي. بعد 3-5 أيام من التعافي، وزويتم حصاد العلل وثابتة لالمناعية. ثم اتسخت الأنسجة مع الأجسام المضادة الأولية α-5 (الأهداف نا ⁺ / K ⁺ أتباز تحتوي على خلايا) بالتزامن مع الأجسام المضادة الثانوية التي تصم كل (كل من جديد وموجود مسبقا) المرحلية الأخضر. باستخدام التصوير متحد البؤر، وقد تبين أن المرحلية القائمة من قبل تظهر الصفراء (المسمى مع كل صبغة الحبيبات الخيطية محددة قابلة للحياة وα-5) والمرحلية الجديدة تظهر الخضراء (المسمى مع α-5 فقط). كلا تقنيات تستخدم جنبا إلى جنب يمكن تطبيقها على دراسة تعصيب، وانتشار وتوزيع الشهادات المرحلية على خيوط الخيشومية عندما تتعرض الأسماك للتحديات البيئية.

Introduction

المرحلية هي وحدة وظيفية لتنظيم الأيونية في الأسماك وتوجد على أسطح الظهارية من خيوط الخيشومية وصفاحات ^4،6-8،10. وعلى الرغم من مجموعة متنوعة من أنواع فرعية تم وصفها التي تمتلك ميزات فريدة من نوعها، وتتميز العديد من الشهادات المرحلية التي كتبها كثافة عالية من الميتوكوندريا (وبالتالي هي معروفة أيضا على أنها خلايا الحبيبات الخيطية الغنية) و / أو وفرة من انزيم نا ⁺ / K ⁺ أتباز (NKA). عادة، وهذه المرحلية المنزل مجموعة متنوعة من المضخات الأخرى، القنوات الأيونية والمبادلات المشاركة في تنظيم أيون (على سبيل المثال، نا ⁺ / H ⁺ مبادل، نا ⁺ / CL ^- شارك في نقل، H ⁺ مضخة) ^2،10،11. إعادة توزيع وانتشار المرحلية كآلية تعويضية أمر أساسي للحفاظ على التوازن الأيوني خاصة خلال الضغط الأيونية (على سبيل المثال، والتعرض لسوء ايون المياه) ^4،8،9.

توضح هذه الدراسة وقت التفاضلي تلطيخ TECHNIكيو ¹ لتحديد ionocytes انتشرت حديثا (المرحلية) في خياشيم الأسماك. ويقترن هذا الأسلوب مع إزالة التعصيب الثنائي كاملة من الأقواس الخيشومية. ذهبية (القشري)، والأنواع المستخدمة في هذه الدراسات، هي مناسبة تماما لدراسة تكاثر الخلايا الظهارية الخيشومية لأن لديهم قدرة ملحوظة لإعادة الهيكلية الخياشيم ^2. يشير الخيشومية إعادة عرض لنمو أو تراجع من كتلة الخلية بين الصفاحات (ILCM) عندما السمك (حافظ عادة بسرعة 15 - 30 درجة مئوية) وتأقلم على المياه الباردة (<15 ° C) أو نقص الأكسجين، على التوالي ^3. وقد ركزت الدراسات السابقة باستخدام تقنية الزمن التفاضلية تلطيخ على ذهبية على إعادة التوزيع، وتعصيب انتشار المرحلية على الخيشومية في سياق الخيشومية إعادة عرض ^4،5. Katoh وكانيكو ¹ ضعت هذه التقنية الجديدة لدراسة التحول واستبدال المرحلية الخيشومية في أسماك الكيلي فيش (القوعاء heteroclitus) حوالةrred من مياه البحر (SW) على المياه العذبة (FW). في هذه الدراسة، ويتم التركيز على انتشار وتعصيب المرحلية في ذهبية تأقلم إلى 25 ° C.

باستخدام تقنية الزمن التفاضلية تلطيخ أنه قد تبين أنه، في سياق إعادة عرض الخيشومية، ذهبية الحفاظ على عدد ثابت من المرحلية خلال التعرض ميتة والانتعاش normoxic لاحق، ومع ذلك، انخفضت النسبة المئوية للخلايا معصب طوال فترة الانتعاش normoxic ^5. واقترح منذ أكثر من 70 عاما أن آليات امتصاص الأيونية في الأسماك هي تحت السيطرة العصبية ^12. ومعصب على الخيشومية مكتملة العظام من الوجه (VII)، اللساني البلعومي (IX) والمبهم (X) الأعصاب يشار إليها أيضا باسم "الأعصاب خيشومي" ^13،14. الدراسات التي Jonz وممرضة (2003) بشأن الزرد (دانيو rerio) الخيشومية تعصيب أظهر أن أصل تعصيب هو خارجي (خلايا الجسم من الألياف العصبية وخارجي لالخيشومية)، وكذلك جوهري (جسم الخلية منالألياف العصبية هو جوهري لالخيشومية). أظهر نفس الكتاب أيضا أن المرحلية خيشومي ومعصب خارجيا ^7.

في هذه الدراسة، تم استخدام تقنية التفاضلية الوقت تلطيخ جانب الكامل الخيشومية إزالة التعصيب الثنائي للتحقيق في انتشار المرحلية التي تفتقر إلى تعصيب خارجي في ذهبية. ويشير كامل الخيشومية إزالة التعصيب الثنائي لقطع الأعصاب القحفية التاسع والعاشر من هذين النهجين مجدية في ذهبية لأن حجمها كبير نسبيا (30-200 ز) يبسط العمليات الجراحية الدقيقة، ويتم تحديد ionocytes بسهولة باستخدام تقنيات المناعية النسيجية القياسية. في هذه الدراسة، تم تصور المرحلية باستخدام صبغة حيوية الحبيبات الخيطية محددة (على سبيل المثال، MitoTracker الأحمر) أو الأجسام المضادة الأولية ضد α-فرعية من نا ⁺ / K ⁺ -ATPase (α-5؛ دراسات الإنمائية بنك هجين، جامعة أيوا، أيوا سيتي IA). يوفر هذا البروتوكول على metho مباشرد من تصور وتحليل إعادة توزيع وانتشار المرحلية على الخيشومية الأسماك.

Protocol

تتفق كل من بروتوكولات للمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي للرعاية الحيوان (CCAC) وكانت نفذت بموافقة من جامعة أوتاوا جنة رعاية الحيوان (بروتوكول BL-226).

1. الوقت التفاضلية تلطيخ التقنية: الخيطية Mitochondrion الغنية صبغ باث

1. إعداد 1 ملم MitoTracker الأحمر حل الأسهم عن طريق إذابة 50 ميكروغرام في 94.0 ميكرولتر من سلفوكسيد ثنائي ميثيل (100٪ DMSO). حافظ على حل الأسهم في الظلام في -20 ° C عندما لا تكون قيد الاستعمال. تجنب دورات تجميد / الذوبان.
2. إعداد صناديق مظلمة (3 - 6 مربعات) بحجم أقصى 600 مل. ملء الصناديق مع 400 مل من الماء نظام (الماء تقام عادة في الأسماك) ووضع حجر الهواء في كل مربع لتوفير مصدر من O _2. الحصول على ذهبية (30 - 40 جم) ووضعها في صناديق مع 400 مل من الماء والحجر الهواء. بعد 30 دقيقة، إضافة إلى الحبيبات الخيطية الغنية صبغ قابلة للحياة لانتاج تركيزات النهائي من 0.1 ميكرومتر و 0.01٪ DMSO. يستحم السمك لمدة 4 ساعاتص.
   1. إذا كانت هذه هي الأسماك التحكم (أي، لا إزالة التعصيب)، بدوره على تدفق المياه الى صناديق، والسماح للصبغ لطرد واسترداد الأسماك للفترة من الوقت المخصص في البروتوكول. وعادة ما يتم انتشال الأسماك لمدة 3 - 5 ايام.
3. بعد فترة نقاهة الشروع في القسم 3: الوقت التفاضلية تلطيخ التقنية: المناعية. إذا كانت هذه الأسماك هي أن مزالة العصب المضي قدما إلى القسم 2: الكامل الثنائي الإجراءات إزالة التعصيب.

2. كامل الثنائي إزالة التعصيب الداخلي

1. الحصول على 1 زوج من مقص طالب Vannas الربيع (المنحني)، 1 زوج من نمط ملقط على التوالي القياسية، 1 زوج من نمط ملقط منحني القياسية، 2 أزواج من رقم 5 ملقط، 1 زوج من الكامشات الأنسجة، وكرات القطن الصغيرة (1 - 2 مم في القطر)، ومسحات القطن (Q نصائح أو ما يعادلها).
2. تحضير حمام الماء مخدر. لأول مرة، ويحل 10 غراما من بنزوكاين إلى الحجم النهائي من 100 ملمن 99٪ من الإيثانول لإعداد محلول المخزون. لإعداد حمام الماء مخدر، ويحل 15 مل من محلول المخزون بنزوكاين في 30 L من الماء نظام الهوائية في درجة الحرارة المطلوبة. تهوية المياه من خلال وضع حجر الهواء متصلة مضخة الهواء أو خط الهواء المركزي في خزان المياه.
   1. ضع السمك في حمام ماء مخدر (الشكل 1A).
   2. مرة واحدة لم يعد التنفس، ضع السمك على طاولة الجراحة وتدخله كما هو موضح في الشكل 1B. القيام بذلك عن طريق إدخال أنبوب في تجويف لها الشدق لري الخياشيم مع الحل مخدر الهوائية. الري من الخياشيم يضمن أن يتم توفير السمك مع كمية كافية من O ₂ والتخدير أثناء إجراء إزالة التعصيب. ضع السمك بحيث يتم إمالة الرأس إلى الأسفل قليلا. وهذا يسمح لتحسين فرص الوصول إلى المنطقة وراء الخيشومية قوس الرابع.
3. رفع بلطف الغطاء الخيشومي على التوالي ملقط نمط القياسيةووضع الكامشات الأنسجة بين الغطاء الخيشومي وداخل الرأس. فتح بعناية الكامشات الأنسجة للحفاظ على الغطاء الخيشومي بعيدا عن الرأس والحفاظ على الخياشيم عرضة للخطر.
4. تأكد من أن الحل مخدر والري الخياشيم أثناء هذا الإجراء. ضع ضام يعالج المقبل في الرأس الذي يوفر الوصول إلى جميع الأقواس الخيشومية الأربعة.
5. وضع ملقط نمط القياسية المنحنية بين القوس الخيشومية الرابع والجزء الخلفي من الرأس وبلطف فتح لهم لخلق التوتر في الرباط إرفاق الرابع القوس الخيشومية في الرأس. مع زوج من رقم 5 ملقط خلق فتحة صغيرة (2-3 ملم) من خلال ثقب ظهارة ربط نهاية الظهري من الأقواس الخيشومية إلى تجويف صادي. يجب الحرص على عدم ذهاب في عميق جدا لأن هناك خطر من إتلاف أحد الأوعية الدموية الرئيسية.
6. مع كرة صغيرة من القطن عقده مع رقم 5 ملقط ببطء وبعناية توسيع شق لفضح التاسع (اللساني البلعومي) والعاشر (المبهم) الأعصاب. مجانا للالأعصاب من أي نوع من الأنسجة الضامة باستخدام رقم 5 ملقط، مع الأخذ مرة أخرى الحرص على عدم الإضرار الأوعية الدموية.
   ملاحظة: IX الخيشومي وX أعصاب ذهبية الراحة العميقة وراء الخيشومية قوس الرابع وهي في القرب من الأوعية الدموية الرئيسية التي تصب في الأقواس الخيشومية.
7. مرة واحدة وقد تم تحديد الأعصاب استخدام مقص الربيع منحنية لقطع بعناية الأعصاب في حين الضغط على شق مفتوح مع ملقط المنحنية شكل القياسية. بعد قطع الأعصاب، والتراجع بلطف ملقط منحنية. ليست هناك حاجة لإغلاق الجرح مع الغرز لأن ظهارة رقيقة جدا وشق يغلق عادة من تلقاء نفسها داخل 24 - 48 ساعة. إزالة ضام الأنسجة.
8. كرر نفس الإجراء على الجانب الآخر من الرأس.
9. تبديل الري من الخياشيم من مخدر على المياه الغازية جديدة لاسترداد الأسماك من التخدير. مرة واحدة واستؤنفت الحركات وصادي نقل الأسماك في خزانات التجريبية لفترة نقاهة لمدة 24 ساعة على الأقل.
إجراء "صورية" الإجراء على مجموعة منفصلة من الأسماك. ينطوي على "صورية" إجراء ثقب ظهارة وراء الخيشومية قوس الرابع دون قطع الأعصاب.

3. الوقت التفاضلية تلطيخ التقنية: المناعية

1. أولا، وإعداد بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في الفوسفات 1X مخزنة المالحة (PBS (4)؛ ز PFA في 96 مل من PBS). PFA لا تذوب بسهولة في برنامج تلفزيوني في RT. حل الحرارة في حمام مائي بحل PFA. تنفيذ هذا في غطاء الدخان. مرة واحدة PFA في حل السماح لتبرد قبل الاستعمال. تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل الى 2 أسابيع.
2. قبل القتل الرحيم الأسماك واستخراج الأنسجة الخيشومية، ضع 3-4 مل من 4٪ PFA إلى قارورة التلألؤ ليصبح المجموع 8 قارورة التلألؤ (1 فيال في الخيشومية قوس). وبالإضافة إلى ذلك، واتخاذ صغيرة تزن قارب وملء مع برنامج تلفزيوني 1X. وسوف تستخدم هذه لغسل الأنسجة بعد أن تم رفعه إليها. إبقاء جميع الحلول على الجليد.
3. بعد قابلة للحياة-الحبيبات الخيطية الغنية التعرض صبغالتجربة قد انتهت، الموت ببطء ذهبية عن طريق وضعه في حمام مائي مع جرعة زائدة من بنزوكاين.
4. استخدام ملقط حادة لرفع الغطاء الخيشومي على جانب واحد من الرأس ومقص منحني لقطع كل نهاية سلة الخيشومية الخيشومية. اختيار بعناية حتى الخياشيم من قبل rakers باستخدام ملقط حادة وانتشالهم من تجويف وصادي. يغسل فورا الخياشيم في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X لإزالة بنزوكاين الزائد والدم.
5. ضع الخياشيم رفعه في قارورة منفصلة (قارورة لكل قوس الخيشومية) مملوءة 4٪ PFA وإصلاح O / N عند 4 درجات مئوية.
6. بعد التثبيت، وغسل PFA الزائد في 1X PBS ووضع الأنسجة في أنبوب رصاصة 2 مل مليئة 1.5 مل من 1٪ تريتون-X على شاكر لمدة 6 ساعة عند RT أو O / N عند 4 درجات مئوية. هذه الخطوة permeabilizes الأنسجة. إذا كان الخيشومية كله هو كبير جدا لوضع في أنبوب 2 مل ثم قطع الأنسجة إلى أقسام صغيرة بما يكفي لتناسب أنبوب مع الحرص على عدم تلف خيوط.
   1. إعداد التخفيفات الأجسام المضادة الأولية التي كتبها miشينغ 4 ميكرولتر من محلول المخزون من كل الأجسام المضادة الأولية (ما مجموعه 8 ميكرولتر) إلى 992 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X. تأكد من أن NKA (تسميات خلايا NKA الغنية) و (العلامات الخلايا العصبية) 12 الزنك، وقد أثيرت الأجسام المضادة الأولية في نفس المضيف. وهذا أمر مهم إذا قرر الباحثون إلى تحديد أنواع فرعية محددة IC في نفس الوقت الذي سيكون لديهم لاستخدام الأجسام المضادة الأولية والثانوية التي أثيرت في الأنواع المضيفة مختلفة.
   2. إزالة حل تريتون-X وبدون غسل الأنسجة تضيف 1: 250 التخفيف (تمييع في برنامج تلفزيوني 1X) من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة NKA (α-5) للكشف عن خلايا NKA الغنية والأجسام المضادة الخلايا العصبية محدد الزرد (الزنك-12) للكشف عن الألياف العصبية (الأجسام المضادة الأولية)، واحتضان على شاكر لمدة 6 ساعة عند RT أو O / N عند 4 درجات مئوية.
7. يغسل الأجسام المضادة الأولية 3 مرات لمدة 3 دقائق لكل باستخدام برنامج تلفزيوني 1X. للقيام بذلك، وإزالة حل الأجسام المضادة الأولية من الأنبوب عن طريق شفط بها باستخدام ماصة.
8. إعداد الأجسام المضادة الثانوية في1: 200 التخفيف عن طريق خلط 5 ميكرولتر من الأسهم الضد الثانوية في 995 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X. تطبيق الضد الثانوية (اليكسا فلور 488)، واحتضان لمدة 6 ساعة عند RT أو O / N عند 4 درجات مئوية على شاكر.
   ملاحظة: MitoTracker الأحمر هو متحمس في ~ 594 نانومتر الطول الموجي وسوف يتألق الأحمر. والضد الثانوية التي هو متحمس في ~ 488 نانومتر الطول الموجي وتتفلور الأخضر يجب أن تستخدم لتسمية NKA والأجسام المضادة الأولية 12 الزنك.
9. إزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائد عن طريق غسل الأنسجة 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما (كما هو موضح في الخطوة 3.7).

4. التصوير

1. بعد يغسل، تركيب الأنسجة على شريحة مقعرة لجبل بأكمله التصوير متحد البؤر الخلايا والألياف العصبية. لتركيب الأنسجة، ووضع لأول مرة في انخفاض (200 ميكرولتر) من برنامج تلفزيوني 1X على شريحة المجهر مسطحة. هذا يضمن أن الأنسجة لا يجفف.
2. فصل hemibranchs الخيشومية مع منحني مقص الدقيقة. ضع قطرة من برنامج تلفزيوني 1X وقطرة من وسائل الاعلام المتزايدة في شريحة مقعرة.
3. ضع hemibranchs فصل في الشريحة مقعرة مع الحافة الأمامية للخيوط التي تواجه صعودا، وتغطي مع انزلاق الغطاء. ربت على حواف الغطاء زلة مع طلاء الأظافر لمنع انزلاق الغطاء من التحرك وتشريد الأنسجة. السماح للأنسجة لتستقر في أسفل الشريحة المقعرة لمدة 10 - 15 دقيقة قبل التصوير.
4. لكل قوس الخيشومية، حدد ستة خيوط الخيشومية عشوائيا للتصوير، وإنتاج ست صور في الخيشومية القوس. استخدام متحد البؤر المجهري التقليدي لصورة الأنسجة من خلال اتخاذ 1 - 3 ميكرون شرائح الضوئية.
   ملاحظة: أي خلايا موجودة مسبقا سوف يكون المسمى مع MitoTracker الأحمر وايجابية NKA سوف تظهر الصفراء فقط. الخلايا التي تبدو حمراء فقط هي المرحلية القائمة من قبل التي لا تحتوي على NKA. وأي خلية انتشرت حديثا إلا الإيجابي لNKA وستظهر الأخضر فقط. سوف تظهر الألياف العصبية أيضا الأخضر.

5. تحليل الصور لIonocyte الكمي

1. لEACح الخيشومية خيوط التي تم تصويرها، كميا المرحلية وتعصيب المرتبطة بالتنقل بين أقسام Z المكدس وإحصاء عدد رقائقي وfilamental المرحلية الحاضر وعما إذا كانت أو لم تكن متباينة حديثا، قبل القائمة، و / أو معصب .
2. تحديد المرحلية في خيوط أو في منطقة (مم ²⁾ من خيوط. القيام بذلك عن طريق استخدام أدوات الرسم المرتبطة البرمجيات المستخدمة للحصول على صور لمخطط صفاحات من خيوط تشمل منطقة خيوط التي تم كميا المرحلية. معظم برامج التصوير متحد البؤر لديها خيار لحساب مساحة منطقة المبينة على الصورة. استخدام الخيار في برامج التصوير الذي يسمح لك أن تفعل هذا للحصول على المنطقة.
3. تقسيم المرحلية عد من منطقة محسوبة من قبل البرنامج للحصول على قدر من المرحلية في وحدة المساحة (على سبيل المثال، في ملم ^2).

النتائج

ويوضح الشكل 1 الجدول جراحة انشاء (الشكل 1A)، ووضع الأسماك أثناء الجراحة (الشكل 1B) وأهم الخطوات الثلاث للمرة التفاضلي تلطيخ تقنية (الشكل 1C). في الخطوة 1، يتم الاحتفاظ السمك لمدة 30 دقيقة في حمام مائي الهوائية بشكل جيد عند 25 درجة مئوية في الظلام. خلال فترة 30 دقيقة، ويمكن للباحث تحضير الصبغة قسامة-الحبيبات الخيطية الغنية في DMSO التي تضاف إلى الماء أثناء الخطوة 2 (الشكل 1C). فترة الحضانة في الخطوة 2 تسمح لامتصاص الصبغة-الحبيبات الخيطية الغنية من الماء في خلايا الحبيبات الخيطية الغنية (أي المرحلية). السمك يمكن بعد ذلك إما الخضوع لهذا الإجراء الكامل الثنائي إزالة التعصيب أو إجراء صورية التي يتم مخدرة الأسماك وأوصدة التلاعب بها ولكن تظل الأعصاب سليمة. وأنشئت في الخطوة 3 يمثل غرفة الإنعاش تزويد المياه المتدفقة للسمكة التي لديها الصناعات الاستخراجيةذر خضع لإزالة التعصيب ثنائي كامل أو "صورية" الإجراء.

بعد فترة النقاهة، وكان الموت الرحيم الأسماك وتم رفعه الخياشيم والثابتة لالمناعية. ويصور التوزيع العام وتعصيب من ICS على خيوط الخيشومية من الأسماك التي خضعت ل"صورية" الإجراء في الشكل 2. المرحلية هي موجودة على ظهائر filamental وكذلك في القاعدة من المناطق بين الصفاحات. ويبين الشكل 2A المرحلية موجودة مسبقا وصفت مع الحبيبات الخيطية الغنية صبغ (أي وجود هذه الشهادات قبل أجريت إجراءات إزالة التعصيب / صورية). الشكل 2B يظهر الألياف العصبية التعصيب المرحلية الموجودة من قبل والتي شكلت حديثا (التي حددها NKA مناعية) من filamental و ظهائر رقائقي. وأخيرا، ودمج من الصورتين (الشكل 2C) يكشف بوضوح المرحلية القائمة من قبل (يبدو أصفر) والمرحلية جديدة (تظهر الخضراء).الشكل 2D هو الرسم البياني التمثيلي IC الكمي للخيوط مبين في الشكل 2A-C. على هذا خيط معين، يبدو أن هناك عدد أكبر من المرحلية انتشرت حديثا في ملم ² من المرحلية الموجودة من قبل (N = 1). لإزالة مصدر تعصيب الخيشومي خارجي، قطعت التاسع والعاشر الأعصاب القحفية (تعصيب خارجي). ويبين الشكل 3A المنطقة الظهرية من تجويف وصادي بعد خيوط الخيشومية وأزيلت ظهائر التي تغطي الأعصاب لفضح التاسع والعاشر الأعصاب القحفية (المشار إليها مع الأرقام الرومانية) التي تمتد من اثنين من جذوع الأعصاب الرئيسية ليعصب كل الأقواس الأربعة (الشكل 3A)؛ يتم ترقيم الأقواس الخيشومية من 1 إلى 4. الشكل 3B-E توضيح إزالة التعصيب الانتقائي لأول قوس الخيشومية. ومعصب أول قوس الخيشومية من قبل كل من التاسع والعاشر الأعصاب القحفية (الشكل 3B) التي يمكن إزالتها دون التأثير على تعصيب إلى بقية سو الأقواس الخيشومية (الشكل 3C-E). النتائج الكاملة إزالة التعصيب الثنائية في الفقدان التدريجي للتعصيب خارجي للخيوط الخيشومية (أرقام 4A-C). الأسماك السيطرة المعرض لحزمة الأعصاب واضحة والتي تمتد على طول خيوط (الشكل 4A). أدى إزالة التعصيب ثنائي كامل في فقدان بعض من تعصيب خارجي بعد 2 أيام من الانتعاش (الشكل 4B). ولوحظ أيضا اختفاء تعصيب خارجي بعد 5 أيام من التعافي من إزالة التعصيب (الشكل 4C). أي تعصيب المتبقية لالمرحلية بعد 5 أيام من الانتعاش يفترض اشتق من الأعصاب مع أجسام الخلايا داخل خيوط الخيشومية (تعصيب ذاتي؛ الشكل 4C).

ضبط الشكل 1. التجريبية تصل لهذا الإجراء إزالة التعصيب وتسلسل الخطوات المستخدمة فيالوقت تقنية التفاضلية تلطيخ. (A) طاولة جراحة التي أنشئت من أجل إجراء إزالة التعصيب تظهر الدبابات التخدير والإنعاش. (B) مثال على تنسيب من مخدرة والأسماك مدخل أنبوب. (C) الخطوات الرئيسية المستخدمة في الوقت تقنية التفاضلية تلطيخ. في الخطوة 1، يتم وضع الأسماك في درجة الحرارة للرقابة، ثابت حمام الماء الهوائية لمدة 30 دقيقة. يضاف صبغ الحبيبات الخيطية الغنية في الخطوة 2 إلى تركيز النهائي من 0.1 ميكرومتر ويسمح للأسماك ليستحم في الحل مدة لا تقل عن 4 ساعات. إعادة تشغيل تدفق المياه في الخطوة 3 وعند هذه النقطة الأسماك يخضع إما إزالة التعصيب الثنائي الكامل للالخيشومية أو جراحة صورية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

/>
الشكل 2. الميكروسكوب الخفيفة تمثل في الوقت تقنية التفاضلية تلطيخ في سمكة ذهبية (تأقلم إلى 25 ° C) بعد 2 أيام إزالة التعصيب ثنائي كامل. (A) توزيع ionocytes الموجودة مسبقا (المرحلية، السهام). على خيوط الخيشومية واحد هو كشف كل الحبيبات الخيطية الغنية صبغ تلطيخ (B) توزيع الشهادات المرحلية الأعصاب (الجديدة والموجودة من قبل) وخيشومي (السهام متقطع) والتي كشفت عنها تلطيخ مع α-5 والزنك، 12 الأجسام المضادة، على التوالي. وتبين الأسهم المرحلية (C) وتداخل (A) و (B) يميز المرحلية القائمة من قبل. (تظهر الأصفر، يدل على النصال) من المرحلية انتشرت حديثا (تظهر الخضراء، المشار إليها السهام). إدراج في (C) هو التكبير من قبل القائمة ionocyte معصب. (D) الرسم البياني الممثل من IC الكمي للخيوط هو موضح في لوحات (AC). N = شريط 1. مقياس في لوحة (C) هو 50 ميكرون وينطبق على جميع لوحات./ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. صور الممثل يصور مراحل مختلفة من تعصيب الخيشومية. عرض (A) الظهرية من الشدق تبين التاسع والعاشر الأعصاب القحفية التعصيب كل 4 الخيشومية الأقواس. يتم ترقيم الأقواس الخيشومية 1-4. يتم فصل خيوط الخيشومية والأنسجة التي تغطي أزيلت الأعصاب لتصور أفضل للتعصيب. (ب) ^شارع 1 و 2 الأقواس الخيشومية ^{الثانية} للكشف عن الجهاز الحسي وفروع التاسع والعاشر الأعصاب القحفية التعصيب ^الحادي الخيشومية 1 القوس. (CE) تسلسل الصور التي تبين إزالة التعصيب الانتقائي لل1 ^الحادي الخيشومية قوس بقطع فروع التاسع والعاشر الأعصاب القحفية. لإعادة التخطيطيعرض الخيشومية تعصيب من الأسماك مكتملة العظام، راجع الشكل 1 في Milsom وآخرون ²⁶ خطوط بيضاء في الصور هي انعكاس الماء من أضواء المجهر؛ أنها لا تعرف أي هيكل الصرفي. شريط النطاق في لوحة (E) هو 4 ملم وينطبق على جميع لوحات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

كانت ملطخة الشكل 4. الميكروسكوب ضوء تصور التوزيع وتعصيب من ionocytes على خيوط واحد من 1 ^الحادي الخيشومية قوس سمكة ذهبية تأقلم إلى 25 درجة مئوية. Ionocytes (المشار إليها رؤساء السهم) مع الأجسام المضادة α-5 والأعصاب (المشار إليها بكانت ملطخة السهام ص) مع الأجسام المضادة الزنك-12. (A) جيل خيوط سمكة السيطرة يظهر حزمة الأعصاب المركزية التي تنشأ يفترض من التاسع والعاشر الأعصاب (تعصيب خارجي) مع رقائقي واسعة المتفرعة. ومعصب بعض ionocytes أشار أيضا (إدراج). (ب) الخيشومية خيوط بعد 2 أيام إزالة التعصيب ثنائي كامل. كان هناك انخفاض في حزمة الأعصاب المركزية في حين ظهر تعصيب رقائقي سليمة إلى حد كبير. (C) والخيشومية خيوط بعد 5 أيام إزالة التعصيب ثنائي كامل مما يدل على أن تعصيب خارجي كان غائبا إلى حد كبير. ويشير التحليل النوعي أن إزالة التعصيب الثنائي الكامل يسبب تدهور تعصيب خارجي الخيشومية مع الحفاظ على الأعصاب مع أجسام الخلايا داخل خيوط الخيشومية (تعصيب جوهري) إنشاء شبكة من الأعصاب من خلال خيوط وداخل الصفيحة. الرجاءانقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

الساعة تقنية التفاضلية تلطيخ يمكن أن تكون أداة مفيدة لفهم التنظيم الديناميكي لامتصاص أيون ودراسة إعادة توزيع الزمني للالمرحلية في ظهائر الخيشومية. وعلى الرغم من إجراءات واضحة، وهناك عدد من النقاط الأساسية التي تعتبر حاسمة بالنسبة لنجاح الوقت تقنية التفاضلية تلطيخ. يجب أن تتعرض ذهبية لصبغ الحبيبات الخيطية الغنية للمرة المخصصة في البروتوكول. سوف تعرض أقصر يؤدي ذلك إلى ضعف الإقبال على صبغ من قبل خلايا الحبيبات الخيطية الغنية (أي ionocytes). أثناء التثبيت، يجب رفعه الأنسجة الخيشومية بسرعة وأبقى في الظلام لتجنب الصورة التبييض. يجب أن تتم معالجة الأنسجة للتصوير في حدود 2 أسابيع من التثبيت. خلال العصب إجراء باجتزاء الثنائي ضمان أن الأسماك هي الخدر بشكل جيد؛ يتم تحديد الأعصاب والأوعية الدموية بوضوح؛ وتستأنف الأسماك وظيفة وصادي كامل قبل أن يتم نقله إلى خزان الانتعاش.

"> وتقدم بيئة FW السمك مع التحدي المزدوج للموازنة خسائر أيون سلبية وناضح مكاسب المياه ^14. إن موازنة الخسائر أيون سلبية يحدث عن طريق امتصاص نشط من الملح عبر المرحلية التي تكون مترجمة إلى filamental وظهائر رقائقي حيث يمكن إجراء اتصال مباشر مع البيئة الخارجية ^{2،4،8،9،16.} ومع ذلك، فإن موقع المرحلية على الخيشومية ليس جامدا. وعلى مدى العقود الثلاثة الماضية أظهرت عدد من الدراسات أن العديد من أنواع الأسماك FW، عندما واجه مع التحدي الأيونية و / أو درجة الحرارة، وإعادة توزيع الشهادات المرحلية خيشومي من خيوط أو قاعدة الصفيحة إلى المناطق الأكثر القاصي من الصفيحة ^{1،2،4،5،17-21.} هذا إعادة توزيع قد يزيد من سماكة الصفيحة التي يمكن التنازل نقل الغاز (O _2، CO ₂₎ عبر الظهارة الخيشومية واستخدمت ^22. الباحثون تقنية اختلاف التوقيت تلطيخ وصفها في هذه المخطوطة لتتبع نقل وemergenc(ه) من المرحلية جديدة على ظهائر الخيشومية في ظل هذه الظروف التجريبية المختلفة (الشكل 1C) ^1،4،5.

الخياشيم، ويفترض المرحلية الخيشومية، ومعصب من قبل التاسع والعاشر الأعصاب القحفية ^7،23-25. هذه الأعصاب تحمل كل من ناقل والمدخلات وارد من وإلى الخيشومية، على التوالي. وهي تقع في الجانب الظهري من الشدق وراء ^ال 4 الخيشومية القوس. سهولة الحصول على الأعصاب والسهولة التي يمكن أن يؤديها الإجراء إزالة التعصيب الثنائي هو نوع معين. في سمك السلمون المرقط، على سبيل المثال، وعلم التشريح وأشار وبالارض من الرأس يسمح للأعصاب للكذب في طائرة واحدة وراء ^ال 4 الخيشومية قوس تحت طبقة رقيقة من الأنسجة. وهذا يجعل الأعصاب وضوحا ويمكن الوصول إليها بسهولة للباحث لتنفيذ الإجراء إزالة التعصيب. في المقابل، ذهبية لها خطم أقصر ورأس مستدير. في التاسع والعاشر من الأعصاب القحفية ذهبية تكمن أعمق في سي الظهريةدي من تجويف بعد 4 ^تشرين الخيشومية قوس الاحتلال طائرات مختلفة. هذا التوجه يحد من سهولة الوصول إلى الأعصاب ويتطلب نهجا أكثر حذرا لتحديد وقطع الأعصاب المناسبة. والهدف من هذا الإجراء هو إزالة التعصيب لإزالة الحسي وارد وصادر المدخلات من وإلى الخيشومية، على التوالي. ويمكن أيضا إزالة التعصيب من الأقواس الخيشومية أن يقترن مع التجارب تدفق أيون باستخدام النظائر المشعة (على سبيل المثال، ²² نا). هذه التقنيات يمكن استخدامها جنبا إلى جنب لدراسة مساهمة المدخلات العصبي على حركة الأيونات عبر الظهارة الخيشومية. الحد أخرى إلى إجراء إزالة التعصيب هو عدم القدرة على التمييز بين الخلايا العصبية الحسية والحركية، وبالتالي عندما قطع العصب حزمة من الممكن أن كلا النوعين من تعصيب يتم إزالتها. قطع أي الخلايا العصبية الحركية قد تؤثر على الخيشومية والحركة وصادي من الأسماك. وهكذا عند تنفيذ التجارب إزالة التعصيب الخيشومية من المهم أيضا لمراقبة التهوية بعدوتعافى الأسماك من الإجراء لضمان أن هناك حركة الخيشومية كافية لكل من الغاز والتبادل الأيوني.

البروتوكولات وصفها في هذه المخطوطات الحيوانات الكبار استخدام أبقت على ضوء 00:12: دورة الظلام وتغذية الكريات الغذائية التجارية. يمكن تعديل هذه الطرق في عدة طرق. أولا، فترة نقاهة بعد الحبيبات الخيطية الغنية التعرض صبغ يمكن تعديلها لمتطلبات بروتوكول الباحث (على سبيل المثال، 1، 3، 5، أو 14 يوما). وكانت أطول فترة من الانتعاش بعد التعرض للالحبيبات الخيطية الغنية صبغ في المختبر 14 يوما ^4،5. لم يكن هناك انخفاض ملحوظ في كثافة مضان من صبغ الحبيبات الخيطية الغنية بعد 14 يوما من الانتعاش. ثانيا، استخدام الأجسام المضادة الأولية α-5 يقتصر على تحديد فقط الخلايا NKA الغنية ولا يميز بين أنواع فرعية مختلفة من المرحلية الخيشومية. لحسن الحظ، في ذهبية ثبت أن غالبية المرحلية على حد سواء mitochondrأيون الغنية (التسمية مع MitoTracker) وNKA الغنية (التسمية مع α-5) خلايا والتي قد لا يكون هذا هو الحال في جميع أنواع الأسماك ^4،27. يمكن التجارب المستقبلية تركز على إثر إعادة توزيع الزمني لأنواع فرعية محددة IC باستخدام الأجسام المضادة الموجهة تحديدا ضد مجموعة متنوعة من القنوات والمضخات والمبادلات (على سبيل المثال، NHE، H ⁺ مضخة). وجدت دراسات سابقة أن غالبية ionocytes ملطخة-الحبيبات الخيطية الغنية صبغ المعرض NKA مناعية ^4. يمكن الكشف عن تعصيب المرحلية باستخدام الأجسام المضادة الأولية ضد الخلايا العصبية محددة مستضد المستمدة من الزرد (الزنك، 12). في هذه الدراسة، α-5 و تم الكشف عن الأجسام المضادة الأولية باستخدام نفس الأجسام المضادة الثانوية (اليكسا فلور 488) لكل 12 الزنك. ويرجع هذا الحد على كل من الأجسام المضادة الأولية تثار في مجموعة الماوس والتغلب عليها حقيقة أن الخلايا NKA الغنية والخلايا العصبية يمكن تمييزها شكليا على الرغم من أنها يتألق نفس اللون. تلطيخ متسلسلمع الأجسام المضادة الثانوية المختلفة (على سبيل المثال، أول α-5 مع اليكسا فلور 488 ثم زد-12 مع اليكسا فلور 594) يمكن أن تستخدم أيضا للقضاء على مشكلة وجود كل علامات الاستشعاع نفس اللون. وأخيرا، يمكن تعديل البروتوكول باجتزاء العصبية ثنائي كامل لاستهداف الأعصاب إلى الأقواس الخيشومية محددة. على سبيل المثال، انتقائية باجتزاء العصبية يمكن أن يؤديها في أول قوس الخيشومية عن طريق فصل بلطف الأولى والثانية الأقواس الخيشومية لفضح الأعصاب مما يؤدي إلى أول قوس الخيشومية في نهاية الظهري للسلة الخيشومية (الشكل 2B-E). ويمكن أيضا أن تقنية اختلاف التوقيت تطبيقها على دراسة توزيع ionocytes في الأسماك الزرد اليرقات حيث تطوير والتحولات النقل أيون من الجلد إلى الخيشومية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MitoTracker Red	Life Technologies	M-7512
Dimethyl sulfoxide	Sigma Alrdich	D2650
α-5 primary antibody	Develompental Hybridoma Bank	a5
zn12 primary antibody	Develompental Hybridoma Bank	zn12
Alexa Fluor 488 (anti mouse)	Life Technologies	A-11001
Benzocaine	Sigma Alrdich	E1501	4-aminobenzoic acid ethyl ester, ethyl 4-aminobenzoate
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-10
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	straight
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11001-12	curved
Dumont No. 5 forceps	Fine Science Tools	11252-30
Tissue retractor	Fine Science Tools	17009-07
Paraformaldehyde	Sigma Alrdich	P6148
Triton X	Sigma Alrdich	X100
Vectashield with DAPI	Vector Laboratories	H-1200