JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Abstract

بسبب المتغيرات البروتين تلعب أدوارا حاسمة في كثير من الأمراض بما في ذلك TDP-43 في الضموري العضلي الجانبي التصلب (ALS)، ألفا synuclein في باركنسون مرض وبيتا اميلويد وتاو في مرض الزهايمر، من المهم للغاية لتطوير الكواشف التشكل المحددة التي يمكن أن تستهدف بشكل انتقائي هذه البروتينات بأمراض محددة المتغيرات لدراسة دور هذه المتغيرات في علم الأمراض والتطبيقات التشخيصية والعلاجية المحتملة. لقد قمنا بتطوير مجهر القوة الذرية (AFM) تقنيات biopanning رواية تقوم العزلة التي تمكن من الكواشف التي تعترف بشكل انتقائي المتغيرات البروتين بأمراض محددة. هناك مرحلتين الرئيسية المشاركة في هذه العملية، ومراحل بالغسل السلبية والإيجابية. خلال المرحلة بالغسل السلبية، يتم استبعاد فاجات التي هي رد الفعل لمستضدات خارج الهدف من خلال جولات متعددة من بالغسل مطروح باستخدام سلسلة من تم اختيارهم بعناية بعيدا عن الهدف المستضدات. ومن السمات الرئيسية في السلبيةالمرحلة بالغسل هو الاستفادة التصوير AFM لمراقبة العملية والتأكد من أن تتم إزالة جميع الجزيئات فج غير مرغوب فيها. وبالنسبة للمرحلة بالغسل إيجابية، يتم إصلاح المستضد الهدف من الفائدة على سطح الميكا ومزال فاجات ملزمة وفحص لتحديد فاجات التي تربط بشكل انتقائي المستضد الهدف. لا يحتاج البديل البروتين الهدف المراد تنقيتها توفير استخدمت الضوابط بالغسل السلبية المناسبة. حتى استهداف المتغيرات البروتين التي تكون موجودة فقط في تركيزات منخفضة جدا في المواد البيولوجية المعقدة يمكن استخدامها في الخطوة بالغسل إيجابية. من خلال تطبيق هذه التكنولوجيا، وحصلنا على أجسام مضادة لبروتين من المتغيرات TDP-43 التي تم العثور عليها بشكل انتقائي في أنسجة المخ ALS الإنسان. نحن نتوقع أن هذا البروتوكول ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق على الكواشف توليد التي تربط بشكل انتقائي المتغيرات البروتين الموجودة في مجموعة واسعة من العمليات والأمراض البيولوجية المختلفة.

Introduction

وجود بدائل البروتين وقد تورط كعامل في تطور العديد من الأمراض بما فيها الأمراض العصبية مثل الزهايمر والشلل الرعاش، ALS والجبهي الصدغي الخرف (FTD) 1،2،3،4،5،6،7،8،9 ، 10،11. ويعتقد أشكال بلازميدة قليلة القسيمات من البروتينات بيتا اميلويد وألفا synuclein أن تكون من الأنواع السامة المسؤولة عن مرض الزهايمر والشلل الرعاش، على التوالي 2،3،4،5. وقد تم ربط المجاميع من البروتين 43 (TDP-43) TAR DNA ملزم لALS وFTD 12،13،14. لذلك الكواشف مثل الأجسام المضادة التي يمكن أن تستهدف بشكل انتقائي يمكن للمتغيرات بروتين مختلفة أن تكون أدوات قوية لخدمة علامات تشخيصية وعلاجية محتملة. في هذه الدراسة، وركزنا على تطوير الكواشف التي تربط بشكل انتقائي أنواع من البروتين TDP-43 المتورطين في ALS، ولكن التقنية الواردة في هذه الورقة يجب أن تكون قابلة للتطبيق إلى عزل الكواشف ضد طائفة واسعة من البروتوكول الاضافيعين المتغيرات.

وقد تم تحديد تجميع حشوية من TDP-43 كسمة المرضية في ALS 15،16،17،18،19. وعادة ما يتم العثور TDP-43 في نواة كل الخلايا من فرد العادي، على الرغم من أنه يميل للتنقل بين العصارة الخلوية ونواة 15،17. تم الكشف عن أشكال ومع ذلك، في ALS تجميعها من TDP-43 في سيتوبلازم الخلايا العصبية والدبقية مختارة مع تركيز أقل وجدت في النواة مما يدل على أن حركة TDP-43 من النواة إلى السيتوبلازم أثناء تطور المرض 16،20. في حين تم العثور على تجميع TDP-43 في معظم الحالات ALS، فإنه لا حساب لجميع الحالات منذ 1٪ -2٪ من إجمالي الحالات ALS (أو 15٪ -20٪ من الحالات الأسرية ALS) ترتبط طفرات في ديسموتاز الفائق 1 (SOD1) 15،17 الجين. نظرا للدور الهام للTDP-43 في الغالبية العظمى من الحالات ALS، وهنا علينا أن نركز على تطوير الكواشف الأجسام المضادة مقرها التي يمكن أن تربط بشكل انتقائي لTDP-43 المتغيرات التي هيموجودة في الإنسان ALS أنسجة المخ باستخدام لدينا رواية AFM تقنيات biopanning مقرها.

في البداية نحن بحاجة إلى ذخيرة متنوعة من الأجسام المضادة ملزمة المجالات. نحن الجمع بين ثلاثة نماذج مختلفة من عرض فج سلسلة واحدة نطاق متغير الأضداد شظية (scFvs) مكتبات (توملينسون الأول وJ والمكتبات صفائح 21). وتنقسم عملية بالغسل إلى مراحل بالغسل السلبية والإيجابية. وتعرض فاجات من المكتبات أولا إلى عملية بالغسل السلبية خلالها فاجات رد الفعل ليتم استبعاد متعددة المستضدات بعيدا عن الهدف. بعد الانتهاء من كل جولة من بالغسل السلبي ضد كل مستضد بعيدا عن الهدف، ويتم رصد هذه العملية عن طريق AFM التصوير لضمان أن كل فج ملزمة المستضدات بعيدا عن الهدف قد أزيلت. إلا بعد التحقق من AFM التصوير التي تتم إزالة كافة فاجات رد الفعل لم نشرع في الهدف التالي. لعزل الكواشف ضد TDP-43 المتغيرات المتورطين في ALS نحن الاستفادة من المستضدات بالغسل السلبية التالية: 1) BSA لإزالة فج التي تربط ضعيفة أو غير خصيصا لبروتينات. 2) مجمعة ألفا synuclein لإزالة الفيروس التي ربط العناصر الهيكلية العامة للبروتينات المجمعة. 3) الخليط أنسجة المخ البشري لإزالة الفيروس التي ربط أي البروتينات أو المكونات الأخرى الموجودة في عينات التشريح من صحة أنسجة المخ البشري؛ 4) immunoprecipitated TDP-43 من الدماغ البشري صحي لإزالة فج التي تربط لجميع TDP-43 الأشكال المرتبطة الدماغ البشري صحي. و5) immunoprecipitated TDP-43 معزولة عن الخليط الدماغ FTD لإزالة فج التي تربط TDP-43 المتغيرات المرتبطة غير ALS-علم الأمراض. بعد إزالة كل فج رد الفعل لجميع المستضدات بعيدا عن الهدف، ثم انتقلنا بعد ذلك إلى المرحلة بالغسل إيجابية خلالها شظايا الأجسام المضادة التي تربط مستضد من الفائدة معزولة، في هذه الحالة TDP-43 immunoprecipitated من أنسجة المخ ALS الإنسان. قد تكون هذه الأجسام المضادة معزولة رد الفعل إلى أشكال تجميعها أو معدلة من TDP-43.

"> التقليدي فج biopanning يركز أساسا على المرحلة بالغسل إيجابية 22،23. وأضافت مكتبة فج وعادة ما يتم يجمد الهدف من الفائدة ومزال فاجات منضم. وتتضخم وفاجات ثم وإضافتها إلى الهدف مرة أخرى. هذه عملية التضخيم وحضانة وعادة ما تتكرر عدة مرات لزيادة نسبة فج ملزم إيجابي. وفي حين أن الاختلافات من هذه العملية وقد استخدمت على نطاق واسع لعزل الكواشف الأجسام المضادة ضد طائفة واسعة من المستضدات الهدف، فإنها تتطلب عادة كميات كبيرة من النقى الهدف مستضد 24،25،26، 27، في حين أن عمليتنا يتطلب تتبع سوى كميات من المستضد الهدف. بروتوكول الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم لعزل الكواشف أن المستضدات الهدف على ربط بشكل انتقائي التي تكون موجودة بتركيزات منخفضة جدا، دون الحاجة لتنقية وبالغسل يمكن القيام بها مباشرة ضد مستضد موجودة في عينات الأنسجة المعقدة. إن استخدام بروتوكولات بالغسل السلبية شاملة كما تم التحقق منهابواسطة AFM يضمن أن الحيوانات المستنسخة معزولة ضد مستضد إيجابي يجب ربط بشكل انتقائي الهدف حتى عندما لا تنقيته أو المخصب.

ونفذت كاستوريرانجان وزملاؤه (2003) من السلبية والإيجابية لعملية biopanning مماثلة لعزل الأجسام المضادة تفاعلية للبلازميدة قليلة القسيمات بيتا اميلويد باستخدام تركيز نانوغرام من الهدف 5. نحن هنا التوسع في هذه العملية لتمكين جيل من الكواشف التي تربط بشكل انتقائي البروتين بأمراض محددة المتغيرات مباشرة من عينات الأنسجة البشرية. في الدراسات المستقبلية نعتزم مواصلة التحقيق ليس فقط القيمة التشخيصية الكواشف معزولة هنا ولكن أيضا تقييم أهميتها العلاجية لعلاج ALS.

وعموما، يجب أن يكون لدينا رواية AFM التكنولوجيا biopanning مقرها ينطبق على عزل أي مرض معين البروتين البديل في أي مادة بيولوجية دون الحاجة لتنقية البروتين أو التعديل، حتى عندما يكون الهدف مستضد concentratioنانوثانية منخفضة للغاية.

Protocol

1. فج الإنتاج

  1. أداء جميع عمليات الإنتاج فج وbiopanning في خزانة السلامة البيولوجية. إنتاج فاجات جزيئات من مكتبات مختلفة (توملينسون المكتبات الأول وJ وصفائح المكتبة 21) لعملية biopanning باستخدام إرشادات الشركة المصنعة (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf).
    ملاحظة: نحن نستخدم مكتبات متعددة في عملية بالغسل لدينا لزيادة تنوع الأجسام المضادة المتاحة.
  2. لفترة وجيزة، والأسهم البكتيريا ثقافة المكتبات الثلاث في 200 مل من 2xYT تحتوي على الجلوكوز 1٪ و 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين على شاكر عند 37 درجة مئوية حتى OD 600 هي 0.4.
  3. إضافة 8 × 10 11 من KM13 المساعد فج إلى 200 مل من المكتبات توملينسون I و J و 8 × 10 11 من VCSM13 المساعد فج إلى 200 مل من المكتبة صفائح. احتضان عينات المكتبة مع مساعد فج لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C دون أن تهتز.
  4. الطرد المركزيالثقافات في 3،000 x ج لمدة 10 دقيقة و resuspend بيليه الخلية في 200 مل من 2xYT مع 0.1٪ الجلوكوز، 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين و 50 ميكروغرام / مل من الكانامايسين.
  5. احتضان الثقافات O / N عند 30 درجة مئوية مع الهز ثم تدور لمدة 30 دقيقة في 3،300 x ج في اليوم التالي.
  6. إضافة 50 مل من غليكول البولي ايثيلين (PEG) 8000 في 2.5 M كلوريد الصوديوم إلى 200 مل من طاف من كل من المكتبات واحتضان على الجليد لمدة 1 ساعة. بعد PEG هطول الأمطار، وتدور الحلول مرة أخرى لمدة 30 دقيقة في 3،300 ز س.
  7. إضافة 1-2 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى الخلية بيليه (اعتمادا على حجم بيليه) ونقل إلى أنابيب microcentrifuge.
  8. احتضان جزيئات فج على الجليد لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية مع الخلط أحيانا قبل الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 11،600 ز س. جمع طاف وتخزينها في -80 ° C.
  9. قبل التجميد، ونقل كمية صغيرة من جزيئات فج من المكتبات ثلاثة إلى أنبوب microcentrifuge آخر وعيار كل مكتبةفردي باستخدام خلايا TG1 لتحديد التركيز. وفيما يلي وصف لعملية عيار للمكتبة واحدة.
    1. زراعة خلايا TG1 إلى OD 600 من 0.4. إضافة 990 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني إلى 6 أنابيب microcentrifuge.
    2. إلى الأنبوب الأول إضافة 10 ميكرولتر من الجزيئات فج. بعد الاختلاط، وإزالة 10 ميكرولتر من أنبوب واحد وإضافة إلى أنبوب 2. كرر هذه الخطوة ل4 أنابيب المتبقية.
    3. إضافة 200 ميكرولتر من خلايا TG1 إلى 6 الأنابيب وإضافة 10 ميكرولتر من كل من التخفيفات فج ستة إلى هذه الأنابيب. السماح للجسيمات فج لتصيب لمدة 30 دقيقة مع أي اهتزاز في 37 ° C.
    4. لوحة 100 ميكرولتر من خلايا منعزلة لوريا، BERTANI أجار لوحات مع 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين (LBA). احتضان O / N عند 37 درجة مئوية ومن ثم تحديد PFU / مل باستخدام عدد من المستعمرات مرئية.

2. السلبية عملية Biopanning

ملاحظة: تجنب الكثير من ذوبان الجليد تجميد فاجات خلال عملية biopanning. الهويةeally، فمن الأفضل لتنفيذ كما العديد من الخطوات بالغسل السلبية ممكن في يوم واحد. بعد الانتهاء من جولات بالغسل سلبي أو إيجابي ضد كل هدف من المهم لانقاذ بعض من فج في حالة تلوث في أي خطوة.

  1. 12 جولات من الطبخ السلبية ضد الأبقار مصل الزلال (BSA)
    1. إضافة 4 مل من 1 ملغ / مل حل BSA في برنامج تلفزيوني إلى 12 immunotubes واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية.
    2. الجمع بين 1 × 10 12 الجسيمات فج من كل من المكتبات الثلاث (تخصيص كمية صغيرة من هذا الخليط فج للتحقق في المستقبل من عملية بالغسل السلبية).
    3. تجاهل الحل BSA من الأنبوب الأول وغسل أنبوب 2-3 مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة أي BSA غير منضم.
    4. إضافة المكتبات فج مجتمعة لهذا الأنبوب الأول، واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT على محور دوار وجمع فاجات غير منضم.
    5. كرر الخطوة 2.1.3 مع immunotube الثانية وإضافة فج التي تم جمعها من الخطوة 2.1.4 لهذا أناmmunotube. كرر الخطوة 2.1.4.
    6. كرر الخطوات 2.1.3-2.1.4 مع 10 أنابيب المتبقية من BSA الحل وفج غير منضم التي تم جمعها بعد كل الحضانة.
    7. للتحقق من إزالة جميع المجلدات BSA فج استخدام AFM. إضافة 10 ميكرولتر من فج من الخطوة 2.1.2 و 10 ميكرولتر من فج المتبقية بعد الخطوة 2.1.7 على حدة إلى 10 ميكروغرام / مل من BSA بد أن الميكا المشقوق. ويرد نسخة موجزة من عملية AFM في القسم 8.
    8. من المهم حفظ كمية صغيرة من فج بعد الانتهاء من جولات عديدة من بالغسل السلبي ضد كل هدف للتحقق من نجاح عملية بالغسل.
  2. 10 جولات من الطبخ السلبية ضد أشكال مختلفة من ألفا-synuclein
    ملاحظة: في هذا المشروع، ونحن نريد لإزالة الفيروس التي يمكن أن تربط أشكال مجمعة أخرى من البروتينات مثل ألفا synuclein (مونومر، ديمر، ترايمر، الخ)، ولذا فإننا سوف القضاء على أي من هذه فاجات (الهدف هو القضاء كما العديد من فاجات عبر التفاعل ممكن). السماح النقى ألفا synuclein لتجميع لمدة 7 أيام على الأقل بحيث أن كلا من أشكال أحادى وبلازميدة قليلة القسيمات موجودة لبالغسل سلبي.
    1. إعداد 4 immunotubes مع 500 ميكروغرام / مل من تجميعي ألفا synuclein في برنامج تلفزيوني و 4 immunotubes مع 100 ميكروغرام / مل من تجميعي ألفا synuclein واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية.
    2. تجاهل الحل من واحدة من الأنابيب مع 500 ميكروغرام / مل من تجميعي ألفا synuclein، ويغسل مع برنامج تلفزيوني وإضافة مكتبة فج التي تم جمعها بعد 12 جولات من سلبية بالغسل مع BSA.
    3. احتضان الأنبوب لمدة 30 دقيقة في RT على محور دوار وجمع فاجات غير منضم.
    4. كرر الخطوات من 2.2.3 و2.2.4 لأنابيب المتبقية مع 500 ميكروغرام / مل من تجميعي ألفا synuclein ثم الأنابيب مع 100 ميكروغرام / مل من تجميعي ألفا synuclein باستخدام فج غير منضم التي تم جمعها في كل مرة بعد خطوة 2.2.4.
    5. كرر الخطوة 2.1.8 باستخدام فج بعد الأول من بالغسل سلبي ضد 500 ميكروغرام / مل من ألفا مجمعة-synuclein وفج بعد الجولة الثامنة من بالغسل سلبي مقابل 100 ميكروغرام / مل من ألفا-synuclein.
    6. للقضاء على جميع المجلدات السلبية ضد ألفا synuclein إعداد اثنين immunotubes اضافية مع 500 ميكروغرام / مل من تجميعي ألفا synuclein وكرر الخطوات 2.2.2-2.2.4.
  3. 10 جولات من الطبخ السلبية ضد صحي الدماغ البشري الأنسجة جناسة
    1. إضافة 1X STEN عازلة (50 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 150 مم كلوريد الصوديوم، 2 مم EDTA، 0.2٪ NP-40، 0.2٪ BSA، 20 ملي PMSF والبروتياز كوكتيل المانع) لأنسجة المخ الإنسان 28. التجانس في 24،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة، والعينات الطرد المركزي في 3،000 دورة في الدقيقة وجمع طاف.
    2. إعداد 2 immunotubes مع 2 مل من 50 ميكروغرام / مل من أنسجة المخ الإنسان في PBS و 8 immunotubes مع 10 ميكروغرام / مل من أنسجة المخ الإنسان واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية.
    3. كرر الخطوات من 2.2.3-2.2.5 أولا مع أنابيب تحتوي على 50 ميكروغرام / مل من نسيج الدماغ البشري ومن ثم مع تلك التي تحتوي على 10 ميكروغرام / مل من ب الإنسانالأنسجة المطر باستخدام فج غير منضم التي تم جمعها بعد بالغسل سلبي ضد ألفا synuclein.
    4. كرر الخطوة 2.1.8 باستخدام فج بعد الأول من بالغسل سلبي مقابل 50 ميكروغرام / مل من أنسجة المخ الإنسان وفج بعد الجولة العاشرة من بالغسل سلبي ضد أنسجة المخ الإنسان.
  4. 8 جولات من الطبخ السلبية ضد صحي Immunoprecipitated TDP-43
    1. Immunoprecipitate صحي TDP-43 البروتين من صحية أنسجة المخ البشري باستخدام بروتوكول موضح في القسم 9. نظرا لكمية أقل من البروتين immunoprecipitated، تنفيذ هذه الجولات من بالغسل السلبي باستخدام الميكا.
    2. يلتصق ثمانية الأسطح الميكا.
    3. إلى الميكا الأول إضافة ~ 100 ميكرولتر من 5 ميكروغرام / مل من البروتين immunoprecipitated واحتضان لمدة 5-10 دقيقة في RT.
    4. غسل الميكا 5 مرات مع 0.1٪ PBS مع توين 20 (PBST).
    5. إضافة ~ 100 ميكرولتر من فج بعد بالغسل سلبي ضد أنسجة المخ صحية واحتضان لمدة 5-10 دقيقة فيRT.
    6. في حضانة منتصف الطريق من خطوة 2.4.5، 2.4.3 تنفيذ خطوة باستخدام الميكا الثاني.
    7. جمع فج من الخطوة 2.4.5 وغسل الميكا 5 مرات مع 0.1٪ PBST.
    8. غسل الميكا من الخطوة 2.4.6 وإضافة فج من 2.4.7.
    9. كرر الخطوات من 2.4.4 إلى 2.4.9 حتى يتم انتقادات فج سلبا ضد كل الميكا ثمانية مع البروتين immunoprecipitated. كرر الخطوة 2.1.7 باستخدام فج بعد أول وثمانية جولة من بالغسل سلبي.
  5. 2 جولات من الطبخ السلبية ضد FTD Immunoprecipitated TDP-43
    1. Immunoprecipitate TDP-43 البروتين من أدمغة الأشخاص الذين يعانون من الخرف الجبهي الصدغي.
    2. يلتصق 2 الأسطح الميكا.
    3. إضافة 50 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل من FTD TDP-43 إلى واحد الميكا. احتضان لمدة 5 دقائق على RT.
    4. غسل الميكا 5 مرات مع 0.1٪ PBST.
    5. إضافة 50 ميكرولتر من فج جمعت بعد بالغسل سلبي ضد TDP-43 صحي. احتضان لمدة 5 دقائق.
    6. جمع فاجات غير منضم.
    7. RepeATS الخطوات 2.5.3 إلى 2.5.6 مع الميكا الثاني وفج غير منضم التي تم جمعها في 2.5.6.

3. إيجابي الطبخ ضد Immunoprecipitated TDP-43 من الأفراد مع ALS

  1. Immunoprecipitate TDP-43 البروتين من أدمغة الأفراد مع ALS. يلتصق 3 الأسطح الميكا. إضافة 50 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل من ALS TDP-43 إلى واحد الميكا. احتضان لمدة 5 دقائق على RT. غسل الميكا 5 مرات مع 0.1٪ PBST.
  2. إضافة 50 ميكرولتر من فج جمعت بعد بالغسل سلبي ضد TDP-43 صحي لالميكا. احتضان لمدة 5 دقائق.
  3. جمع فاجات غير منضم. كما جمع فاجات ملزمة باستخدام ثلاث طرق شطف. فمن المهم للحفاظ على جميع فاجات جمعها في هذه الخطوات بالغسل منفصلة.
    1. أولا، إضافة 50 ميكرولتر من التربسين (1 ملغ / مل في PBS) إلى كل الميكا واحتضان لمدة لا تزيد عن 10 دقيقة. جمع الحل وحفظها. المقبل، إضافة 50 ميكرولتر من 100 ملي ثلاثي الإيثيلامين (TEA) لكل الميكا واحتضان لمدة لا تزيد عن 10 دقيقة. شركةllect الحل، إضافة حجم مساو من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك عازلة درجة الحموضة 7.4 وحفظها.
    2. ثالثا، إضافة 50 ميكرولتر من TG1 في OD 600 من 0.4 مباشرة إلى الميكا واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C. أيضا إضافة فاجات التي تم جمعها من طرق شطف اثنين في 3.3.1 إلى 100 ​​ميكرولتر من TG1 في OD 600 من 0.4 واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C.
  4. كرر الخطوات من 3.1 مع الميكا الثاني.
  5. خذ فج غير منضم التي تم جمعها في 3.3.2. باستخدام الميكا الأول مع ALS TDP-43 وإضافته إلى الميكا الثاني مع ALS TDP-43. احتضان لمدة 5 دقائق.
  6. كرر كافة الخطوات في 3.3 لهاتين المجموعتين الثانية من الميكا.
  7. الجمع بين الخلايا TG1 المصابين فاجات مزال مع التربسين من اثنين ALS TDP-43 ميكا وعلى لوحات لوحة LBA. كرر نفس العملية لTEA ومزال TG1 فاجات من اثنين ALS TDP-43 الميكا ليصبح المجموع ثلاث لوحات.
    ملاحظة: بسبب تورط TDP-43 في كل من ALS وFTD، وبعض من الحيوانات المستنسخة معزولة فيجولتين من بالغسل إيجابي ضد ALS TDP-43 قد تكون محددة لهذا الهدف، ولكن البعض قد ربط أيضا FTD. لعزل أفضل ALS الحيوانات المستنسخة محددة، واتخاذ فج غير منضم جمعها بعد 2 جولات من بالغسل سلبي ضد FTD TDP-43 (منذ هذه جولتين من بالغسل سلبي يجب أن إزالة أي هدف وهذا هو رد الفعل إلى FTD TDP-43) واستخدام هذه فاجات في جولة واحدة أكثر من بالغسل إيجابي ضد مستضد ALS TDP-43 على الميكا (إعداد ALS TDP-43 الميكا كما هو موضح أعلاه في 3.3 و 3.4).
  8. كرر كافة الخطوات في 3.3 مع هذا ALS الميكا الثالث ولوحة الخلايا المصابة TG1 على ثلاث لوحات LBA O / N عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي حساب عدد المستعمرات على 6 لوحات LBA مع الحيوانات المستنسخة ALS المحتملة. ينبغي أن يكون هناك عدد أقل من المستعمرات على لوحات ثلاث LBA مع الحيوانات المستنسخة ALS المحتملة بعد الجولة الثالثة من بالغسل إيجابي مقارنة مع لوحات LBA الثلاثة بعد جولتي بالغسل إيجابي.

4. التثقيف وفج المنتجأيون من المحتملة النسخ إيجابي ضد ALS محددة TDP-43

  1. تنمو كل مستعمرة من 6 لوحات في لوحات 96-جيدا تحتوي على 100 ميكرولتر من 2xYT مع 1٪ جلوكوز و 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين على شاكر عند 37 درجة CO / N.
  2. نقل اليوم التالي 10 ميكرولتر من الآبار التي تحتوي على الحيوانات المستنسخة من لوحات LBA 3 بعد الجولة الثالثة من بالغسل الإيجابي مع البروتين ALS TDP-43 إلى أنابيب microcentrifuge تحتوي على 1 مل من 2xYT مع 1٪ جلوكوز و 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين .
  3. إضافة الجلسرين لجميع الثقافات في لوحات 96-جيدا لتركيز النهائي من 15٪ وتجميد لوحات في -80 ° C. السماح لل1 مل الثقافات لتنمو لمدة 2-3 ساعة تهتز عند 37 درجة مئوية.
  4. إضافة 10 9 من KM13 المساعد فج والسماح للفج المساعد لتصيب لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز. الطرد المركزي الخلايا لمدة 10 دقيقة في 3،000 x ج، تجاهل طاف وإضافة 1 مل من 2xYT مع 0.1٪ الجلوكوز، 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين و 50 ميكروغرام / مل من kanamycin.
  5. ثقافة الخلايا O / N عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز. أنابيب الطرد المركزي في 3،300 x ج لمدة 30 دقيقة، ونقل طاف لأنابيب microcentrifuge جديدة وإضافة 250 ميكرولتر PEG / كلوريد الصوديوم إلى كل أنبوب.
  6. احتضان الأنابيب على الجليد لمدة 1 ساعة. أنابيب الطرد المركزي مرة أخرى في 3،300 x ج لمدة 30 دقيقة، وتجاهل طاف وإضافة 100 ميكرولتر من PBS إلى كل أنبوب.
  7. احتضان الأنابيب على الجليد لمدة 1 ساعة. تدور الأنابيب لمدة 10 دقيقة في 11،600 x ج ونقل طاف لأنابيب جديدة. تخزين فاجات في -80 ° C.

5. تسلسل المحتملة ALS النسخ

  1. كرر الخطوة 4.2 و تسمح للثقافات أن ينمو O / N عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز. في اليوم التالي تنفيذ محضرات بلازميد الحمض النووي من الحيوانات المستنسخة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تسلسل استنساخ باستخدام الاقتضاء إلى الأمام وعكس الاشعال.

6. الفحص المحتملة النسخ إيجابي ضد ALS محددة TDP-43 عن طريق غير مباشر ELISA

  1. إضافة 100 ميكرولتر من 2.5 ميكروغرام / مل من ALS، FTD وأنسجة المخ الإنسان صحية للآبار من لوحة ELISA ملزمة عالية لكل ALS استنساخ المحتملين. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع الهز بطيئة.
  2. تغسل الصحون 3 مرات مع 0.1٪ PBST. إضافة 200 ميكرولتر من 2٪ مسحوق الحليب في برنامج تلفزيوني إلى البئر واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع الهز بطيئة.
  3. كرر الخطوة غسل ثم قم بإضافة 100 ميكرولتر من كل فج المخفف 1/100 على الأقل في PBS إلى الآبار. بعد الحضانة وغسل الخطوات، إضافة 100 ميكرولتر من 1 / 1،000 مكافحة M13 HRP إلى كل بئر. تغسل الصحون وتصور باستخدام ELISA عدة فيمتو معان كيميائي الركيزة.

7. إنتاج scFv والفحص عن طريق غير مباشر ELISA

  1. تنمو HB 2151 الخلايا لOD 600 من 0.4. إضافة 5 ميكرولتر من فاجات مختلفة ل20 ميكرولتر من الخلايا HB 2151. السماح للفاجات 30 دقيقة لتصيب عند 37 درجة مئوية دون أن تهتز. تقسيم لوحات LBA في شبكات ذلكأن ما يقرب من 20 الحيوانات المستنسخة يمكن مطلي في كل منها.
  2. إضافة 5-10 ميكرولتر من كل فج المصابة البكتيريا على لوحة واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي إضافة المستعمرات الفردية إلى 1 مل من 2xYT مع 0.1٪ جلوكوز و 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين ويهز عند 37 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعة حتى OD 600 هو 0.6.
  3. إضافة 1 ميكرولتر من 1 M isopropylthiogalactoside (IPTG) إلى كل أنبوب واحتضان O / N عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز. تدور الأنابيب في 11،600 x ج لمدة 10 دقيقة وحصاد طاف لاختبار ELISA.
  4. لاختبار ELISA اتباع نفس الإجراءات في القسم 6، باستثناء بدلا من فج في 6.5 إضافة scFv مخفف وعن 6.6 إضافة 100 ميكرولتر من 1 / 1،000 9e10 HRP.

8. عملية AFM

  1. إضافة 10-20 ميكرولتر من المستضد الهدف لالميكا المشقوق واحتضان لمدة 5-10 دقيقة. غسل الميكا 5 مرات بالماء. إضافة 10-20 ميكرولتر من فاجات إلى الميكا واحتضان لمدة 5-10 دقيقة.
  2. غسل الميكا واي 5 مرات مرة أخرىالمياه التاسع والسماح للالميكا في الهواء الجاف. تصور فج ملزمة باستخدام AFM 1. تنفيذ عملية التصوير AFM باستخدام وضع التنصت AFM مع وحدة تحكم Nanoscope الثالث ألف في الهواء في RT 29. تحقيقات AFM السيليكون لديها تردد الرنين من 300 كيلو هرتز وثابت ربيع 40 N / م. استخدام معدل المسح من 3.05 هرتز ودقة المسح الضوئي 512 عينات / خط.
  3. معالجة الصور عن طريق تسطيح الأساسي من الخلفية لضمان أن جميع أحجام الجسيمات قابلة للمقارنة داخل كل صورة. عرض فج (وليس طول) قد تختلف من صورة إلى صورة نظرا لأحجام الجسيمات الأخرى ومنطقة المسح الضوئي، لكنه لن تساوم أبدا دقة أم لا فج تربط للمستضد.
  4. إذا أثناء التحقق AFM لكل مجموعة من فاجات بالغسل السلبية هي واضحة على الميكا، نفذ جولات بالإضافة إلى أن يتم الكشف عن أي فاجات قبل الانتقال إلى المجموعة التالية من بالغسل سلبي.

9. مناعي من الهدف مستضد

  1. لisolatالبريد المستضد الهدف (TDP-43)، إضافة 250 ميكروغرام من الأنسجة التجانس الدماغ (من القشرة الحركية)، و 100 ميكرولتر من 1/100 التخفيف من مكافحة TDP 43 بولكلونل الأجسام المضادة و1X STEN العازلة إلى 700 ميكرولتر إجمالي حجم لإيبندورف أنبوب 28.
  2. احتضان O / N عند 4 درجات مئوية على محور دوار. حبات الاغاروز غسل A / G مع 1X STEN العازلة 2-3 مرات وإضافة 25 مل إلى الخليط الأنسجة. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة على محور دوار ثم الطرد المركزي في 2،000-4،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
  3. إزالة طاف ويغسل بيليه مرة واحدة مع 1X STEN العازلة و5 مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة 40-60 ميكرولتر من العازلة 1X STEN لبيليه وتغلى لمدة 5 دقائق. بعد العينات هي باردة، الطرد المركزي وجمع طاف. استخدام SDS-PAGE والنشاف الغربي للتحقق من نجاح عملية مناعي 30.

10. دوت تحليل لطخة

  1. قطع ورقة النيتروسليلوز إلى مستطيلات صغيرة لكل استنساخ التي سيتم اختبارها. نقطة 2 ميكرولتر من ALS، FTD وصحية الإنسان عينات أنسجة المخ حتى ورقة النيتروسليلوز واتركها تجف تماما.
  2. إضافة 1-2 مل من 5٪ مسحوق الحليب في برنامج تلفزيوني والسماح لها يهز لمدة 1 ساعة على RT. إضافة 1 مل من 1/100 التخفيف من كل فج والسماح لها تهز O / N عند 4 درجات مئوية. غسل غشاء 3 مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما مع 0.5٪ PBST.
  3. إضافة 1 مل من 1 / 1،000 التخفيف من مكافحة M13 HRP والسماح لها يهز لمدة 1 ساعة على RT. إجراء غسل تكرار وتصور باستخدام حل معان كيميائي الغربي.

النتائج

في الشكل 1، يوضح التخطيطي عملية بالغسل السلبية التي أزلنا فج ملزم بعيدا عن الهدف مستضدات من مكتبتنا باستخدام immunotubes. بدأنا في البداية مع BSA لأن هذا هو عامل مشترك وحجب أي فج التي سترد nonspecifically مع هذا الهدف سيكون إشكالية في المناعية في المستقبل. المقبل، ونحن إزا?...

Discussion

Protein variants have been shown to be involved in the progression of many neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s, ALS and FTD1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Isolation of antibodies that can selectively recognize these different protein variant targets can be effective reagents to study, diagnose and potentially treat such ailments. To generate such variant specific antibodies we have developed a novel biopanning process that utilizes atomic force microscopy to monitor the progress ...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا البحث عن طريق منحة من المعاهد الوطنية للصحة: ​​R21AG042066. ونود أن نشكر فيليب شولتز لمساهماته في خلق أشرطة الفيديو القبض على الشاشة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Tomlinson I and J LibrariesMRC (Cambridge, England)
Sheets LibraryMRC (Cambridge, England)
2xYTBD Sciences244020
GlucoseAmresco0188-2.5KG
AmpicillinAmresco0339-25GIrritant
KM13 Helper PhageMRC (Cambridge, England)
KanamycinOmniPur5880Irritant
Polyethylene Glycol 8000OmniPur6510Irritant
Sodium ChlorideMacron7647-14-5
Sodium Phosphate DibasicAmresco0404-1KGIrritant
Potassium ChlorideEMDPX1405-1Irritant
Potassium Phosphate MonobasicAmresco0781-500GIrritant
TG1 CellsMRC (Cambridge, England)
Luria-Bertani AgarEMD1.10283.0500
Bovine Serum AlbuminAmresco0332-100G
STEN bufferCrystalgen Inc.33429775
ImmunotubesThermo Scientific470319
MicaSpruce Pine Mica24365
Tween 20EMD
TrypsinSigmaT-0303Irritant
TriethylamineSigmaT-0886Flammable
GlycerolAmresco0854-1LIrritant
DNA Plasmid Prep Kitqiagen27106Irritant
Non-Fat Milk PowderCarnation
96-Well High Binding ELISA PlateCostar3590
Anti-M13 HRPGE Healthcare Life Sciences27-9421-01
ELISA Femto Chemiluminescence Substrate KitThermo Scientific37074
Anti-TDP 43 Polyclonal AntibodyProteinTech10782-2-AP
A/G Agarose BeadsSanta Cruz Biotechnologysc-2003
HB 2151 CellsMRC (Cambridge, England)
IsopropylthiogalactosideTeknova13325
9e10 HRPSanta Cruz Biotechnologysc-40
Nitrocellulose MembraneBiorad162-0115Flammable
CentrifugeThermo ScientificSorvall RC 6+
Nanoscope IIIa Atomic Force MicroscopeVeeco
AFM ProbesVistaProbesT300R-10

References

  1. Hedieh, B., Sharareh, E., Philip, S., Michael, R. S. Isolating recombinant antibodies against specific protein morphologies using atomic force microscopy and phage display technologies. Protein Engineering Design and Selection. 19, 497-502 (2006).
  2. Emadi, S., Barkhordarian, H., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. Isolation of a Human Single Chain Antibody Fragment Against Oligomeric α-Synuclein that Inhibits Aggregation and Prevents α-Synuclein-induced Toxicity. Journal of Molecular Biology. 368, 1132-1144 (2007).
  3. Emadi, S., Kasturirangan, S., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. Detecting Morphologically Distinct Oligomeric Forms of α-Synuclein. Journal of Biological Chemistry. 284, 11048-11058 (2009).
  4. Kasturirangan, S., et al. Nanobody specific for oligomeric beta-amyloid stabilizes nontoxic form. Neurobiology of Aging. 33, 1320-1328 (2012).
  5. Kasturirangan, S., et al. Isolation and characterization of antibody fragments selective for specific protein morphologies from nanogram antigen samples. Biotechnology Progress. 29, 463-471 (2013).
  6. Zameer, A., Kasturirangan, S., Emadi, S., Nimmagadda, S. V., Sierks, M. R. Anti-oligomeric Aβ Single-chain Variable Domain Antibody Blocks Aβ-induced Toxicity Against Human Neuroblastoma Cells. Journal of Molecular Biology. 384, 917-928 (2008).
  7. Boddapati, S., Levites, Y., Sierks, M. R. Inhibiting β-Secretase Activity in Alzheimer's Disease Cell Models with Single-Chain Antibodies Specifically Targeting APP. Journal of Molecular Biology. 405, 436-447 (2011).
  8. Boddapati, S., Levites, Y., Suryadi, V., Kasturirangan, S., Sierks, M. R. Bispecific Tandem Single Chain Antibody Simultaneously Inhibits β-Secretase and Promotes α-Secretase Processing of AβPP. Journal of Alzheimer's Disease. 28, 961-969 (2012).
  9. Zhou, C., Emadi, S., Sierks, M. R., Messer, A. A Human Single-Chain Fv Intrabody Blocks Aberrant Cellular Effects of Overexpressed [alpha]-Synuclein. Mol Ther. 10, 1023-1031 (2004).
  10. Vanden Broeck, L., Callaerts, P., Dermaut, B. TDP-43-mediated neurodegeneration: towards a loss-of-function hypothesis. Trends in Molecular Medicine. 20, 66-71 (2014).
  11. Akamatsu, M., et al. A unique mouse model for investigating the properties of amyotrophic lateral sclerosis-associated protein TDP-43, by in utero electroporation. Neuroscience Research. 77, 234-241 (2013).
  12. Keage, H. A., et al. TDP-43 in the Population: Prevalence and Associations with Dementia and Age. Journal of Alzheimer's Disease. 42, 641-650 (2014).
  13. Honda, D., et al. The ALS/FTLD-related RNA-binding proteins TDP-43 and FUS have common downstream RNA targets in cortical neurons. FEBS Open Bio. 4, 1-10 (2014).
  14. Baloh, R. H. TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration. FEBS Journal. 278, 3539-3549 (2011).
  15. Ling, S. -. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. . Converging Mechanisms in ALS and FTD: Disrupted RNA and Protein. 79, 416-438 (2013).
  16. Sasaki, S., Takeda, T., Shibata, N., Kobayashi, M. Alterations in subcellular localization of TDP-43 immunoreactivity in the anterior horns in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience Letters. 478, 72-76 (2010).
  17. Robertson, J., et al. Lack of TDP-43 abnormalities in mutant SOD1 transgenic mice shows disparity with ALS. Neuroscience Letters. 420, 128-132 (2007).
  18. Shan, X., Vocadlo, D., Krieger, C. Mislocalization of TDP-43 in the G93A mutant SOD1 transgenic mouse model of ALS. Neuroscience Letters. 458, 70-74 (2009).
  19. Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S., Kwak, S. The abnormal processing of TDP-43 is not an upstream event of reduced ADAR2 activity in ALS motor neurons. Neuroscience Research. 73, 153-160 (2012).
  20. Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
  21. Sheets, M. D., et al. Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: The production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6157-6162 (1998).
  22. Hairul Bahara, N. H., et al. Phage display antibodies for diagnostic applications. Biologicals. 41, 209-216 (2013).
  23. Azzazy, H. M. E., Highsmith, W. E. Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
  24. Zhang, X., et al. Rapid isolation of single-chain antibodies from a human synthetic phage display library for detection of Bacillus thuringiensis (Bt). Cry1B toxin. Ecotoxicology and Environmental Safety. 81, 84-90 (2012).
  25. Liu, H., et al. Selection and characterization of single-chain recombinant antibodies against spring viraemia of carp virus from mouse phage display library. Journal of Virological Methods. 194, 178-184 (2013).
  26. Cukkemane, N., Bikker, F. J., Nazmi, K., Brand, H. S., Veerman, E. C. I. Identification and characterization of a salivary-pellicle-binding peptide by phage display. Archives of Oral Biology. 59, 448-454 (2014).
  27. Adamson, C. S., et al. Novel single chain antibodies to the prion protein identified by phage display. Virology. 358, 166-177 (2007).
  28. Hebron, M. L., et al. Parkin Ubiquitinates Tar-DNA Binding Protein-43 (TDP-43) and Promotes Its Cytosolic Accumulation via Interaction with Histone Deacetylase 6 (HDAC6). Journal of Biological Chemistry. 288, 4103-4115 (2013).
  29. Wang, M. S., Zameer, A., Emadi, S., Sierks, M. R. Characterizing Antibody Specificity to Different Protein Morphologies by AFM. Langmuir. 25, 912-918 (2008).
  30. Williams, S., Sakic, B., Hoffman, S. A. Circulating brain-reactive autoantibodies and behavioral deficits in the MRL model of CNS lupus. Journal of Neuroimmunology. 218, 73-82 (2010).
  31. Jończyk, E., Kłak, M., Międzybrodzki, R., Górski, A. The influence of external factors on bacteriophages—review. Folia Microbiol. 56, 191-200 (2011).
  32. Hammers, C. M., Stanley, J. R. Antibody Phage Display: Technique and Applications. J Invest Dermatol. 134, e17 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

96 TDP 43 Biopanning scFv

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved