JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Abstract

בגלל גרסאות חלבון תפקיד קריטי במחלות רבות, כולל TDP-43 בטרשת לרוחב amyotrophic (ALS), אלפא-סינוקלאין במחלה וביתא-עמילואיד וטאו במחלת אלצהיימר, זה חשוב באופן קריטי לפיתוח חומרים כימיים מסוימים מורפולוגיה שיכולה באופן סלקטיבי יעד פרקינסון חלבון ספציפי למחלה אלה גרסאות כדי ללמוד את התפקיד של גרסאות אלה בפתולוגיה מחלה ועבור יישומים אבחוניים וטיפוליים פוטנציאליים. פיתחנו טכניקות חדשניות במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) המבוססות biopanning המאפשרות בידוד של חומרים כימיים שסלקטיבי להכיר גרסאות חלבון ספציפית למחלה. ישנם שני שלבים עיקריים מעורבים בתהליך, שלבי צילום פנורמי השליליים וחיוביים. בשלב צילום פנורמי השלילי, פאגים שמגיבים לאנטיגנים מחוץ היעד בוטלו באמצעות סבבים רבים של צילום פנורמי תוסף ניצול סדרה נבחרו בקפידה אנטיגנים מחוץ היעד. תכונה מרכזית בשלילהשלב פנורמי הוא ניצול ההדמיה AFM כדי לפקח על התהליך ולוודא שכל חלקיקי phage לא רצויים יוסרו. בשלב צילום פנורמי החיובי, אנטיגן היעד של ריבית קבועה על משטח נציץ ופאגים מחויבים הם eluted והוקרנו לזהות פאגים שסלקטיבי לקשור את האנטיגן היעד. גרסת חלבון המטרה לא צריכה להיות מטוהרת מספקת בקרות צילום פנורמי השליליות המתאימות כבר בשימוש. אף למקד את גרסאות חלבון שנמצאים רק בריכוזים נמוכים מאוד בחומר ביולוגי מורכב יכול להיות מנוצל בצעד החיובי צילום פנורמי. באמצעות יישום של טכנולוגיה זו, שרכשנו את הנוגדנים לחלבון גרסאות של TDP-43 הנמצאות באופן סלקטיבי ברקמת המוח אנושית ALS. אנו צופים כי פרוטוקול זה צריך להיות ישים ליצירת חומרים כימיים שסלקטיבי לאגד גרסאות חלבון קיימים במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים שונים ומחלות.

Introduction

הנוכחות של גרסאות חלבון הייתה מעורבת כגורם בהתפתחות של מחלות רבות, כולל מחלות ניווניות כגון אלצהיימר, פרקינסון, ALS ופרונטוטמפורל דמנציה (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11. צורות Oligomeric של בטא-עמילואיד החלבונים ואלפא-סינוקלאין נחשבות למינים הרעילים האחראים לאלצהיימר ופרקינסון, בהתאמה 2,3,4,5. מצרפים של חלבון (43 TDP-43) TAR DNA מחייבים נקשרו לALS וFTD 12,13,14. לכן ריאגנטים כמו נוגדנים שיכולים באופן סלקטיבי למקד את גרסאות חלבון השונות יכולות להיות כלי רב עוצמה כדי לשמש כסמנים לאבחון וכתרופות פוטנציאליות. במחקר זה, אנו מתמקדים בפיתוח חומרים כימיים שסלקטיבי לאגד גרסאות של חלבון TDP-43 המעורבים בALS, אך הטכניקה שתוארה במאמר זה צריכה להיות ישימה לבידוד של חומרים כימיים נגד מגוון רחב של protein גרסאות.

צבירת cytoplasmic של TDP-43 זוהתה כתכונה פתולוגית בALS 15,16,17,18,19. בדרך כלל TDP-43 נמצאים בגרעין של כל תאי מאדם נורמלי, למרות שהיא נוטה לעבור בין cytosol והגרעין 15,17. צורות עם זאת, בALS מצטברים של TDP-43 מזוהות בציטופלסמה של תאי עצב בחר וגליה עם ריכוזים נמוכים יותר נמצאו בגרעין טוען התנועה של TDP-43 מהגרעין אל הציטופלסמה במהלך התקדמות מחלה 16,20. בעוד צבירה של TDP-43 נמצאת ברוב המכריע של המקרים ALS, זה אינו לוקח בחשבון את כל המקרים מאז 1% -2% מהמקרים כולל ALS (או 15% -20% מהמקרים ALS משפחתיים) צמודים למוטציות ב סופראוקסיד דיסמוטאז 1 15,17 גן (SOD1). בגלל התפקיד החשוב של TDP-43 ברוב המכריע של המקרים ALS, כאן אנו מתמקדים בפיתוח חומרים כימיים נוגדנים מבוססים שיכול באופן סלקטיבי להיקשר לTDP-43 וריאנטים שקיים ברקמת המוח אנושית ALS תוך שימוש בטכניקות biopanning מבוסס רומן AFM שלנו.

בתחילה אנו זקוקים לרפרטואר מגוון של תחומים נוגדן מחייב. אנחנו שילבנו שלוש ספריות בר שונה תצוגת הפאג שרשרת אחת תחום משתנה נוגדן (scFvs), (טומלינסון אני וJ וספריות גיליונות 21). תהליך צילום פנורמי מחולק לשלבי צילום פנורמי שליליים וחיוביים. פאגים מהספריות כפופים ראשון לתהליך צילום פנורמי השלילי שבמהלכו פאגים תגובה לאנטיגנים מחוץ יעד מרובים אינם נכללים. לאחר השלמת כל סיבוב של צילום פנורמי שלילי נגד כל אנטיגן מחוץ היעד, התהליך מנוטר על ידי ההדמיה AFM כדי להבטיח שכל הפאג מחייב אנטיגנים מחוץ היעד הוסר. רק אחרי שאימתי על ידי ההדמיה AFM שכל פאגים התגובה יוסרו אנחנו להמשיך ליעד הבא. כדי לבודד ריאגנטים נגד TDP-43 גרסאות מעורבות בALS אנו מנוצלים אנטיגנים פנורמי השליליים הבאים: 1) BSA כדי להסיר הפאג אשר נקלט חלש או שאינם ספציפי לחלבונים; 2) אלפא-סינוקלאין מצטבר להסיר הפאג אשר נקלט על ידי אלמנטים מבניים הגנרית של חלבונים מצטברים; 3) homogenates רקמת המוח האנושי כדי להסיר הפאג אשר נקלט על ידי כל חלבונים או רכיבים אחרים הנמצאים בדגימות שלאחר המוות של רקמת מוח אדם בריאה; 4) immunoprecipitated TDP-43 ממוח האנושי בריא כדי להסיר הפאג אשר נקלט על ידי כל TDP-43 טפסים הקשורים למוח אנושי בריא; ו -5) immunoprecipitated TDP-43 מבודד מhomogenates מוח FTD להסיר הפאג אשר נקלט TDP-43 וריאנטים הקשורים לפתולוגיה שאינו ALS. לאחר הסרת כל הפאג התגובה לכל אנטיגנים מחוץ היעד, אנחנו לאחר מכן המשכנו את שלב צילום פנורמי החיובי שבמהלכו שברי נוגדנים שקושרים את האנטיגן של עניין מבודדים, במקרה זה TDP-43 immunoprecipitated מרקמת המוח אנושי ALS. נוגדנים מבודדים אלה עשויים להיות תגובתי לצורות מצטברות או שונה של TDP-43.

"> Biopanning הפאג הקונבנציונלי מתמקד בעיקר בשלב צילום פנורמי החיובי 22,23. בדרך כלל המטרה של עניין היא משותקת, ספריית הפאג הוסיפה ופאגים כבול eluted. אז פאגים הם מוגברים והוסיפו ליעד שוב. תהליך ההגברה והדגירה בדרך כלל חוזרים על עצם מספר פעמים כדי להגדיל את האחוז של הפאג מחייב חיובי. בעוד וריאציות של תהליך זה נעשו שימוש נרחב לבודד את ריאגנטים נוגדנים נגד מגוון רחב של אנטיגנים יעד, הם בדרך כלל דורש כמויות גדולות של אנטיגן היעד המטוהר 24,25,26, 27, ואילו התהליך שלנו דורש רק כמויות זעירות של האנטיגן היעד. הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש כדי לבודד ריאגנטים שאנטיגנים באופן סלקטיבי לאגד יעד שנמצאים בריכוזים נמוכים מאוד, ללא הצורך בטיהור והצילום פנורמי יכולים להתבצע ישירות נגד הווה אנטיגן בדגימות רקמה מורכבות. השימוש בפרוטוקולי צילום פנורמי שליליים ממצים כפי שאומתעל ידי AFM מבטיח כי שיבוטים המבודדים נגד אנטיגן החיובי צריכים סלקטיבי יחייבו את היעד גם כאשר לא מטוהרים או מועשר.

Kasturirangan ועמיתיו (2003) ביצעו תהליך biopanning שלילי וחיובי דומה לבודד נוגדנים מגיבים לביתא-עמילואיד oligomeric באמצעות ריכוז ננוגרם של היעד 5. כאן אנו להרחיב על תהליך זה כדי לאפשר את הדור של חומרים כימיים שסלקטיבי לקשור חלבון ספציפי למחלה גרסאות ישירות מדגימות רקמה אנושיות. במחקרים עתידיים בכוונתנו להמשיך לחקור לא רק את הערך האבחנתי של ריאגנטים המבודדים כאן, אלא גם להעריך את הרלוונטיות הטיפוליות שלהם לטיפול ב- ALS.

בסך הכל, הטכנולוגיה הייחודית שלנו לAFM מבוססת biopanning צריכה להיות ישימה לבידודה של כל חלופת חלבון ספציפית למחלה בכל חומר ביולוגי ללא הצורך בטיהור חלבון או שינוי, גם כאשר concentratio אנטיגן היעדns הם נמוכים מאוד.

Protocol

1. הפאג הפקה

  1. לבצע את כל תהליכי ייצור הפאג וbiopanning בקבינט בטיחות ביולוגי. לייצר פאגים חלקיקים מהספריות השונות (ספריות אני וJ טומלינסון וגיליונות ספריית 21) לתהליך biopanning באמצעות הוראות היצרן (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf).
    הערה: אנו משתמשים בספריות מרובות בתהליך צילום פנורמי שלנו כדי להגדיל את המגוון של הנוגדנים הזמינים.
  2. בקצרה, מניות חיידקי התרבות של שלוש הספריות ב -200 מיליליטר של גלוקוז 1% מכיל 2xYT ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר של אמפיצילין על שייקר ב 37 ° C עד OD 600 היא 0.4.
  3. הוסף 8 x 10 11 של הפאג עוזר KM13 200 מיליליטר של ספריות טומלינסון אני וJ ו- 8 x 10 11 של הפאג עוזר VCSM13 200 מיליליטר של ספריית גיליונות. דגירה דגימות ספרייה עם הפאג עוזר למשך 30 דקות ב 37 ° C בלי לרעוד.
  4. צנטריפוגהתרבויות ב3,000 XG במשך 10 דקות וresuspend התא גלולה ב -200 מיליליטר של 2xYT עם גלוקוז 0.1%, 100 מיקרוגרם / מיליליטר של אמפיצילין ו -50 מיקרוגרם / מיליליטר של kanamycin.
  5. דגירה התרבויות O / N ב 30 מעלות צלזיוס עם רעד ואז לסובב במשך 30 דקות ב -3,300 XG למחרת.
  6. להוסיף 50 מיליליטר של פוליאתילן גליקול (PEG) 8000 בכ -2.5 M NaCl ל-200 מיליליטר של supernatant מכל אחת מהספריות ולדגור על קרח במשך שעה 1. אחרי הממטרים PEG, לסובב את הפתרונות שוב למשך 30 דקות ב 3,300 x ז.
  7. להוסיף 1-2 מיליליטר של בופר פוספט (PBS) לתא גלולה (תלוי בגודל של גלולה) ולהעביר צינורות microcentrifuge.
  8. דגירה חלקיקי phage על קרח למשך השעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס, כאשר מדי פעם ערבוב לפני צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 11,600 x ז. לאסוף את supernatant ולאחסן ב -80 ° C.
  9. לפני ההקפאה, להעביר נפח קטן של חלקיקי phage משלוש ספריות לצינור microcentrifuge אחר וtiter כל ספרייהבנפרד באמצעות תאי TG1 כדי לקבוע ריכוז. להלן תיאור של תהליך כייל לספרייה אחת.
    1. לגדל תאי TG1 לOD 600 של 0.4. להוסיף 990 μl של PBS על 6 צינורות microcentrifuge.
    2. לצינור הראשון להוסיף 10 μl של חלקיקי phage. לאחר הערבוב, להסיר 10 μl מצינור אחד ולהוסיף לצינור 2. חזרו על שלב זה עבור 4 צינורות הנותרים.
    3. הוסף 200 μl של תאי TG1 6 צינורות ולהוסיף 10 μl של כל אחד מששת דילולים הפאג לצינורות אלה. לאפשר לחלקיקי phage להדביק למשך 30 דקות ללא רועד ב 37 מעלות צלזיוס.
    4. צלחת של התאים אל-לוריא Bertani צלחות אגר עם 100 / מיליליטר מיקרוגרם של אמפיצילין (LBA) 100 μl. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לקבוע את pfu / מיליליטר באמצעות מספר מושבות גלויות.

2. תהליך Biopanning שלילי

הערה: הימנע יותר מדי הפשרת הקפאה של פאגים לאורך כל תהליך biopanning. Ideally, עדיף לבצע כמה שיותר פעולות צילום פנורמי השליליות ככל האפשר ביום. לאחר השלמת סבבי צילום פנורמי שלילי או חיובי אחד נגד היעד חשוב להציל חלק מהפאג במקרה של זיהום בכל צעד.

  1. 12 סיבובים של Panning שלילי נגד שור הסרום אלבומין (BSA)
    1. הוסף 4 מיליליטר של 1 מ"ג / מיליליטר פתרון BSA ב PBS עד 12 immunotubes דגירה O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
    2. לשלב 1 x 10 12 חלקיקי phage מכל אחת משלוש הספריות (להפריש כמות קטנה של תערובת הפאג זה לאימות עתיד תהליך צילום פנורמי השלילי).
    3. מחק את פתרון BSA מהצינור הראשון ולשטוף את הצינור 2-3 פעמים עם PBS כדי להסיר כל BSA מאוגד.
    4. הוסף את ספריות הפאג המשולבות לצינור הראשון, דגירה במשך 30 דקות ב RT על הכתף ולאסוף את פאגים מאוגד.
    5. חזור על שלב 2.1.3 עם immunotube השני ומוסיף את הפאג שנאסף מהצעד 2.1.4 לi זהmmunotube. חזור על שלב 2.1.4.
    6. חזרו על שלבי 2.1.3-2.1.4 עם 10 צינורות הנותרים של פתרון BSA והפאג מאוגד שנאסף לאחר כל דגירה.
    7. כדי לוודא הסרת כל קלסרים הפאג BSA להשתמש AFM. הוסף 10 μl של הפאג מצעד 2.1.2 ו -10 μl של הפאג שנותר לאחר צעד 2.1.7 בנפרד עד 10 / מיקרוגרם מיליליטר של BSA חייב נציץ ביקע. גרסה קצרה של תהליך AFM מתוארת בסעיף 8.
    8. חשוב לשמור כמות קטנה של הפאג לאחר שסיים רבים סיבובים של צילום פנורמי שלילי נגד כל יעד כדי לוודא הצלחה של תהליך צילום פנורמי.
  2. 10 סיבובים של Panning שלילי נגד צורות שונות של Alpha-סינוקלאין
    הערה: בפרויקט זה, אנו רוצים להסיר את הפאג שיכול לקשור צורות מצטברות אחרות של חלבונים כגון אלפא-סינוקלאין (מונומר, דימר, trimer, וכו ') ולכן אנחנו יהיו לחסל את כל אלה של פאגים (המטרה היא לחסל כ רבים פאגים צלב-reactive ככל האפשר). לאפשר אלפא-סינוקלאין המטוהר כדי לצבור לפחות 7 ימים, כך ששני צורות monomeric וoligomeric נמצאות לצילום פנורמי שלילי.
    1. הכן 4 immunotubes עם / 500 מיקרוגרם מיליליטר של אלפא-סינוקלאין מצטבר בPBS ו -4 immunotubes עם 100 מיקרוגרם / מיליליטר של אלפא-סינוקלאין מצטבר דגירה O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
    2. מחק את הפתרון מאחד הצינורות עם / 500 מיקרוגרם מיליליטר של אלפא-סינוקלאין מצטבר, לשטוף עם PBS ולהוסיף ספריית הפאג נאספה לאחר 12 הסיבובים של שלילי פנורמי עם BSA.
    3. דגירה הצינור למשך 30 דקות ב RT על הכתף ולאסוף את פאגים מאוגד.
    4. חזור על שלבים 2.2.3 ו2.2.4 לצינורות הנותרים עם / 500 מיקרוגרם מיליליטר של אלפא-סינוקלאין מצטבר ולאחר מכן את הצינורות עם 100 מיקרוגרם / מיליליטר של אלפא-סינוקלאין מצטבר באמצעות הפאג מאוגד שנאסף בכל פעם אחרי צעד 2.2.4.
    5. חזור על שלב 2.1.8 באמצעות הפאג אחרי הראשון של צילום פנורמי שלילי נגד 500 מיקרוגרם / מיליליטר של אלפא מצטבר-synuclein והפאג לאחר הסיבוב השמיני של צילום פנורמי שלילי נגד 100 מיקרוגרם / מיליליטר של אלפא-סינוקלאין.
    6. לחסל את כל קלסרים השליליים נגד אלפא-סינוקלאין להכין שתי immunotubes נוסף עם / 500 מיקרוגרם מיליליטר של אלפא-סינוקלאין מצטבר וחזור על צעדים 2.2.2-2.2.4.
  3. 10 סיבובים של Panning שלילי נגד homogenate רקמה בריא המוח האנושי
    1. הוסף חוצץ 1x STEN (50 מ"מ טריס (pH 7.6), 150 מ"מ NaCl, 2 מ"מ EDTA, 0.2% BSA 0.2% NP-40,, 20 מ"מ PMSF ומעכב פרוטאז קוקטייל) לרקמת המוח האנושית 28. Homogenize ב24,000 סל"ד דקות 1, דגימות צנטריפוגות ב -3,000 סל"ד ולאסוף supernatant.
    2. הכן 2 immunotubes עם 2 מיליליטר של 50 מיקרוגרם / מיליליטר של רקמת מוח אדם בPBS ו -8 immunotubes עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר של רקמת מוח אדם ודגירת O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
    3. חזור על שלבים 2.2.3-2.2.5 ראשון עם הצינורות המכילים 50 מיקרוגרם / מיליליטר של רקמת מוח אדם ולאחר מכן עם אלה המכילים 10 מיקרוגרם / מיליליטר של b אדםרקמת גשם באמצעות הפאג מאוגד נאסף לאחר צילום פנורמי השלילי נגד אלפא-סינוקלאין.
    4. חזור על שלב 2.1.8 באמצעות הפאג אחרי הראשון של צילום פנורמי שלילי נגד 50 / מיליליטר מיקרוגרם של רקמת מוח אדם והפאג לאחר הסיבוב העשירי של צילום פנורמי שלילי נגד רקמת מוח אנושית.
  4. 8 סיבובים של Panning שלילי נגד בריא immunoprecipitated TDP-43
    1. Immunoprecipitate חלבון TDP-43 בריא מרקמת המוח האנושי בריאה באמצעות הפרוטוקול המתואר בסעיף 9. בשל כמות נמוכה של חלבון immunoprecipitated, לבצע סיבובים של צילום פנורמי שלילי אלה באמצעות נציץ.
    2. קליב שמונה משטחים נציץ.
    3. לתציץ הראשון להוסיף ~ 5 מיקרוגרם / מיליליטר של חלבון immunoprecipitated 100 μl דגירה למשך 5-10 דקות ב RT.
    4. שטוף את המיקה 5 פעמים עם 0.1% PBS עם Tween 20 (PBST).
    5. הוספה של הפאג ~ 100 μl לאחר צילום פנורמי השלילי נגד רקמת מוח בריאה ודגירה למשך 5-10 דקות בRT.
    6. בדגירה באמצע הדרך של צעד 2.4.5, לבצע צעד 2.4.3 באמצעות נציץ השני.
    7. לאסוף את הפאג מצעד 2.4.5 ולשטוף נציץ 5 פעמים עם PBST 0.1%.
    8. לשטוף נציץ מהצעד 2.4.6 ולהוסיף הפאג מ2.4.7.
    9. חזור על השלבים 2.4.4 ל2.4.9 עד הפאג הוא נקטל באופן שלילי נגד כל נציץ שמונה עם חלבון immunoprecipitated. חזור על שלב 2.1.7 באמצעות הפאג אחרי הראשון ושמונה סיבוב של צילום פנורמי שלילי.
  5. 2 סיבובים של Panning שלילי נגד FTD immunoprecipitated TDP-43
    1. TDP-43 חלבון Immunoprecipitate ממוחם של אנשים עם FTD.
    2. קליב 2 משטחים נציץ.
    3. הוסף 50 μl 10 / מיקרוגרם מיליליטר של FTD TDP-43 לאחד נציץ. דגירה במשך 5 דקות בRT.
    4. שטוף את המיקה 5 פעמים עם PBST 0.1%.
    5. הוסף 50 μl של הפאג שנאסף לאחר צילום פנורמי שלילי נגד TDP-43 הבריא. דגירה של 5 דקות.
    6. לאסוף את פאגים מאוגד.
    7. RepeATS הצעדים 2.5.3 ל2.5.6 עם נציץ השני והפאג מאוגד שנאסף ב2.5.6.

3. חיובי Panning נגד immunoprecipitated TDP-43 מאנשים עם ALS

  1. TDP-43 חלבון Immunoprecipitate ממוחם של אנשים עם ALS. קליב 3 משטחים נציץ. הוסף 50 μl 10 / מיקרוגרם מיליליטר של ALS TDP-43 לאחד נציץ. דגירה במשך 5 דקות בRT. שטוף את המיקה 5 פעמים עם PBST 0.1%.
  2. הוסף 50 μl של הפאג שנאסף לאחר צילום פנורמי שלילי נגד TDP-43 הבריא ליציץ. דגירה של 5 דקות.
  3. לאסוף את פאגים מאוגד. גם לאסוף פאגים מחויבים בשלוש שיטות elution. חשוב לשמור את כל פאגים שנאספו בשלבי צילום פנורמי אלה נפרדים.
    1. ראשית, להוסיף 50 μl של טריפסין (1 מ"ג / מיליליטר PBS) לכל נציץ ודגירה של לא יותר מ -10 דקות. לאסוף את הפתרון ולשמור. לאחר מכן, להוסיף 50 μl של triethylamine 100 מ"מ (TEA) לכל נציץ ודגירה של לא יותר מ -10 דקות. Collect הפתרון, להוסיף נפח שווה של 1 pH חיץ M טריס-HCl 7.4 ולשמור.
    2. שלישית, להוסיף 50 μl של TG1 בOD 600 של 0.4 ישירות לתציץ דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. גם להוסיף פאגים שנאספו משתי שיטות elution ב3.3.1 100 μl של TG1 בOD 600 של 0.4 דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  4. חזור על שלבים 3.1 עם נציץ שני.
  5. קח את הפאג מאוגד שנאסף ב3.3.2. באמצעות נציץ הראשון עם ALS TDP-43 ולהוסיף אותו לתציץ השני עם ALS TDP-43. דגירה של 5 דקות.
  6. חזור על כל השלבים ב3.3 לסטים שני אלה של מיקה.
  7. מערבבים את התאים נגועים בTG1 פאגים eluted עם טריפסין משני ALS נציץ TDP-43 וצלחת על צלחות LBA. חזור על אותו התהליך לTEA וTG1 eluted פאגים משני נציץ ALS TDP-43 עבור הסכום כולל של שלוש צלחות.
    הערה: בגלל מעורבותו של TDP-43 בשני ALS וFTD, חלק מהשיבוטים מבודד בשני סבבים של צילום פנורמי חיובי נגד ALS TDP-43 עלולים להיות ספציפיים למטרה זו, אך חלקם עשוי גם לאגד FTD. כדי לבודד טוב יותר ALS שיבוטים ספציפיים, לקחת את הפאג מאוגד שנאסף לאחר 2 סיבובים של צילום פנורמי שלילי נגד FTD TDP-43 (מאז שני סבבים של צילום פנורמי שלילי אלה צריכים להסיר כל יעד שהוא מגיב לFTD TDP-43) ובאמצעות פאגים אלה ב עוד סיבוב אחד של צילום פנורמי חיובי נגד אנטיגן ALS TDP-43 ביציצו (להכין נציץ ALS TDP-43 כפי שתואר לעיל ב3.3 ו 3.4).
  8. חזור על כל השלבים ב3.3 עם נציץ ALS שלישי וצלחת תאי TG1 הנגוע בשלוש LBA צלחות O / N על 37 מעלות צלזיוס. למחרת לספור את מספר המושבות על 6 צלחות LBA עם השיבוטים ALS הפוטנציאליים. לא צריך להיות פחות מושבות על שלוש צלחות LBA עם השיבוטים ALS הפוטנציאליים לאחר הסיבוב השלישי של צילום פנורמי חיובי בהשוואה לשלוש צלחות LBA לאחר שני הסבבים של צילום פנורמי חיובי.

4. Culturing ומוצרי הפאגTDP-43 ספציפי היון של שיבוטים חיוביים פוטנציאליים נגד ALS

  1. לגדול כל מושבה מ6 צלחות בצלחות 96-המכילות גם של 2xYT 100 μl עם גלוקוז 1% ו- 100 מיקרוגרם / מיליליטר של אמפיצילין על שייקר ב 37 מעלות CO / N.
  2. ההעברה למחרת 10 μl מהבארות המכילות שיבוטים מצלחות LBA 3 אחרי הסיבוב השלישי של צילום פנורמי חיובי עם חלבון ALS TDP-43 לצינורות microcentrifuge המכילים 1 מיליליטר של 2xYT עם גלוקוז 1% ו- 100 מיקרוגרם / מיליליטר של אמפיצילין .
  3. להוסיף גליצרול לכל התרבויות ב96-גם צלחות לריכוז סופי של 15% ולהקפיא את הצלחות ב -80 ° C. אפשר תרבויות 1 מיליליטר לגדול במשך 2-3 שעות הרועדות ב 37 ° C.
  4. הוסף 10 9 של הפאג עוזר KM13 ולאפשר הפאג העוזר להדביק לשעה 1 ב 37 ° C עם רעד. צנטריפוגה התאים במשך 10 דקות ב 3000 XG, לבטל את supernatant ולהוסיף 1 מיליליטר של 2xYT עם גלוקוז 0.1%, 100 מיקרוגרם / מיליליטר של אמפיצילין ו -50 מיקרוגרם / מיליליטר של Kanamycin.
  5. תרבות התאים O / N ב 30 מעלות צלזיוס עם רעד. צנטריפוגה הצינורות ב 3300 XG למשך 30 דקות, להעביר את supernatant לצינורות microcentrifuge חדשים ולהוסיף 250 μl PEG / NaCl על צינור אחד.
  6. דגירה הצינורות על קרח עבור שעה 1. צנטריפוגה הצינורות שוב ב3,300 XG למשך 30 דקות, לבטל את supernatant ולהוסיף 100 של PBS μl לכל צינור.
  7. דגירה הצינורות על קרח עבור שעה 1. ספין הצינורות במשך 10 דקות ב 11,600 XG ולהעביר את supernatant לצינורות חדשים. אחסן את פאגים ב -80 ° C.

5. רצף של המשובטים ALS פוטנציאליים

  1. חזור על שלב 4.2 ומאפשר לתרבויות לגדול O / N ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד. למחרת לבצע preps פלסמיד DNA של השיבוטים על פי הוראות היצרן. רצף השיבוטים שימוש המתאים קדימה לאחור פריימרים.

6. הקרנת שיבוטים חיוביים פוטנציאליים נגד ELISA העקיף TDP-43 באמצעות ALS ספציפי

  1. הוספה של 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר של ALS, FTD ורקמת מוח אנושי בריאה 100 μl לבארות של צלחת ELISA גבוהה מחייבת לכל שיבוט ALS פוטנציאלי. דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם רעד איטי.
  2. לשטוף את הצלחות 3 פעמים עם PBST 0.1%. הוסף 200 μl של 2% אבקת חלב בPBS להיטב דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם רעד איטי.
  3. חזור על השלב לשטוף ולאחר מכן להוסיף בכל הפאג המדולל לפחות 1/100 בPBS לבארות 100 μl. לאחר הדגירה ולשטוף צעדים, להוסיף של 1/1000 אנטי-M13 HRP 100 μl היטב כל אחד. לשטוף את הצלחות ולדמיין באמצעות ערכת מצע chemiluminescence femto ELISA.

7. הפקת scFv והקרנה באמצעות ELISA העקיף

  1. לגדול HB 2,151 תאים לOD 600 של 0.4. הוסף 5 μl של פאגים השונים עד 20 μl של HB 2,151 תאים. לאפשר לפאגים 30 דקות להדביק על 37 מעלות צלזיוס בלי לרעוד. לחלק צלחות LBA לרשתות כל כךכי כ 20 שיבוטים יכולים להיות מצופים בכל.
  2. להוסיף 5-10 μl של כל חיידקי הפאג נגועים לצלחת ודגירת O / N ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת להוסיף מושבות בודדות עד 1 מיליליטר של 2xYT עם גלוקוז 0.1% ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר של אמפיצילין ולנער על 37 מעלות צלזיוס במשך 3-4 שעות עד OD 600 הוא 0.6.
  3. הוסף 1 μl של 1 M isopropylthiogalactoside (IPTG) על צינור אחד ודגירת O / N ב 30 מעלות צלזיוס עם רעד. ספין הצינורות ב 11,600 XG במשך 10 דקות ולאסוף את supernatant לבדיקת ELISA.
  4. לבדיקת ELISA בצע את אותו הליך כלשהו בסעיף 6, אלא שבמקום הפאג ב-6.5 להוסיף scFv חי ול-6.6 להוסיף 100 μl של 1/1000 9e10 HRP.

8. תהליך AFM

  1. להוסיף 10-20 μl של אנטיגן היעד ליציצו ביקע דגירה למשך 5-10 דקות. שטוף את המיקה 5 פעמים במים. להוסיף 10-20 μl של פאגים ליציצו ודגירה למשך 5-10 דקות.
  2. שטוף את המיקה 5 פעמים wi שובמים וה לאפשר נציץ לייבוש באוויר. דמיינו הפאג מחייב שימוש בAFM 1. לבצע את תהליך ההדמיה AFM שימוש במצב הקשה AFM עם בקר Nanoscope IIIa באוויר בRT 29. יש לי בדיקות AFM סיליקון תדר תהודה של 300 kHz וקבוע קפיץ של 40 N / m. השתמש בקצב סריקה של 3.05 הרץ ורזולוציית סריקה של 512 דגימות / קו.
  3. לעבד את התמונות על ידי השטחה בסיסית של הרקע כדי להבטיח שכל הגדלים של החלקיקים הם דומים בתוך כל תמונה. רוחב הפאג (לא אורך) עשוי להשתנות מתמונה לתמונה בשל גודל חלקיקים אחר ואזור הסריקה, אבל זה לעולם לא יתפשר על הדיוק של האם או לא הפאג נקשר לאנטיגן.
  4. אם במהלך אימות AFM עבור כל קבוצה של פאגים צילום פנורמי שליליים גלויים על נציץ, לבצע סיבובים בנוסף עד שלא פאגים מזוהים לפני שתמשיכו לסדרה הבאה של צילום פנורמי שלילי.

9. Immunoprecipitation של היעד Antigen

  1. לבידוד עדואר אנטיגן היעד (TDP-43), להוסיף 250 מיקרוגרם של רקמת מוח Homogenize (מהקורטקס מוטורי), של 1/100 דילול של נוגדן polyclonal אנטי-TDP 43 ו1x STEN 100 μl חיץ להיקף כולל של 700 μl לאפנדורף צינור 28.
  2. דגירה O / N ב 4 ° C על הכתף. חרוזים agarose לשטוף / G עם STEN 1x חיץ 2-3 פעמים ולהוסיף 25 מיליליטר לתערובת הרקמה. דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות על הכתף ואז צנטריפוגות בסל"ד 2,000-4,000 דקות 1.
  3. הסר את supernatant ולשטוף את הכדור פעם אחת עם חיץ 1x STEN ו -5 פעמים עם PBS. להוסיף 40-60 μl של חיץ 1x STEN לגלולה ולהרתיח במשך 5 דקות. לאחר הדגימות הם מגניבים, צנטריפוגה ולאסוף את supernatant. השתמש SDS-PAGE ומערבי סופג כדי לוודא הצלחת תהליך immunoprecipitation 30.

10. Dot כתם ניתוח

  1. לחתוך נייר nitrocellulose למלבנים קטנים עבור כל שיבוט שייבחן. Dot 2 μl של ALS, FTD ודגימות רקמת המוח אנושיות בריאה אל נייר nitrocellulose ולתת לו להתייבש לחלוטין.
  2. להוסיף 1-2 מיליליטר של 5% אבקת חלב בPBS ולתת לו לנער עבור שעה 1 ב RT. הוסף 1 מיליליטר של 1/100 דילול של כל הפאג ולתת לו ללחוץ את O / N ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את הממברנה 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד עם PBST 0.5%.
  3. הוסף 1 מיליליטר של 1/1000 דילול של אנטי-M13 HRP ולתת לו לנער עבור שעה 1 ב RT. הליך חזור על לשטוף ודמיינו באמצעות פתרון chemiluminescence מערבי.

תוצאות

באיור 1, סכמטי מדגים את תהליך צילום פנורמי השלילי שבו אנו הוסרו הפאג מחייבים אנטיגנים מחוץ יעד מהספרייה שלנו באמצעות immunotubes. אנחנו בתחילה התחלנו עם BSA שכן מדובר בסוכן חסימה נפוץ וכל הפאג שיגיב nonspecifically עם יעד זה יהיה בעייתי בimmunoassays העתיד. בשלב הבא, הסרנו קלסרי?...

Discussion

Protein variants have been shown to be involved in the progression of many neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s, ALS and FTD1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Isolation of antibodies that can selectively recognize these different protein variant targets can be effective reagents to study, diagnose and potentially treat such ailments. To generate such variant specific antibodies we have developed a novel biopanning process that utilizes atomic force microscopy to monitor the progress ...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענק מNIH: R21AG042066. ברצוננו להודות לפיליפ שולץ על תרומתו ביצירת קטעי וידאו לכידת מסך.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Tomlinson I and J LibrariesMRC (Cambridge, England)
Sheets LibraryMRC (Cambridge, England)
2xYTBD Sciences244020
GlucoseAmresco0188-2.5KG
AmpicillinAmresco0339-25GIrritant
KM13 Helper PhageMRC (Cambridge, England)
KanamycinOmniPur5880Irritant
Polyethylene Glycol 8000OmniPur6510Irritant
Sodium ChlorideMacron7647-14-5
Sodium Phosphate DibasicAmresco0404-1KGIrritant
Potassium ChlorideEMDPX1405-1Irritant
Potassium Phosphate MonobasicAmresco0781-500GIrritant
TG1 CellsMRC (Cambridge, England)
Luria-Bertani AgarEMD1.10283.0500
Bovine Serum AlbuminAmresco0332-100G
STEN bufferCrystalgen Inc.33429775
ImmunotubesThermo Scientific470319
MicaSpruce Pine Mica24365
Tween 20EMD
TrypsinSigmaT-0303Irritant
TriethylamineSigmaT-0886Flammable
GlycerolAmresco0854-1LIrritant
DNA Plasmid Prep Kitqiagen27106Irritant
Non-Fat Milk PowderCarnation
96-Well High Binding ELISA PlateCostar3590
Anti-M13 HRPGE Healthcare Life Sciences27-9421-01
ELISA Femto Chemiluminescence Substrate KitThermo Scientific37074
Anti-TDP 43 Polyclonal AntibodyProteinTech10782-2-AP
A/G Agarose BeadsSanta Cruz Biotechnologysc-2003
HB 2151 CellsMRC (Cambridge, England)
IsopropylthiogalactosideTeknova13325
9e10 HRPSanta Cruz Biotechnologysc-40
Nitrocellulose MembraneBiorad162-0115Flammable
CentrifugeThermo ScientificSorvall RC 6+
Nanoscope IIIa Atomic Force MicroscopeVeeco
AFM ProbesVistaProbesT300R-10

References

  1. Hedieh, B., Sharareh, E., Philip, S., Michael, R. S. Isolating recombinant antibodies against specific protein morphologies using atomic force microscopy and phage display technologies. Protein Engineering Design and Selection. 19, 497-502 (2006).
  2. Emadi, S., Barkhordarian, H., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. Isolation of a Human Single Chain Antibody Fragment Against Oligomeric α-Synuclein that Inhibits Aggregation and Prevents α-Synuclein-induced Toxicity. Journal of Molecular Biology. 368, 1132-1144 (2007).
  3. Emadi, S., Kasturirangan, S., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. Detecting Morphologically Distinct Oligomeric Forms of α-Synuclein. Journal of Biological Chemistry. 284, 11048-11058 (2009).
  4. Kasturirangan, S., et al. Nanobody specific for oligomeric beta-amyloid stabilizes nontoxic form. Neurobiology of Aging. 33, 1320-1328 (2012).
  5. Kasturirangan, S., et al. Isolation and characterization of antibody fragments selective for specific protein morphologies from nanogram antigen samples. Biotechnology Progress. 29, 463-471 (2013).
  6. Zameer, A., Kasturirangan, S., Emadi, S., Nimmagadda, S. V., Sierks, M. R. Anti-oligomeric Aβ Single-chain Variable Domain Antibody Blocks Aβ-induced Toxicity Against Human Neuroblastoma Cells. Journal of Molecular Biology. 384, 917-928 (2008).
  7. Boddapati, S., Levites, Y., Sierks, M. R. Inhibiting β-Secretase Activity in Alzheimer's Disease Cell Models with Single-Chain Antibodies Specifically Targeting APP. Journal of Molecular Biology. 405, 436-447 (2011).
  8. Boddapati, S., Levites, Y., Suryadi, V., Kasturirangan, S., Sierks, M. R. Bispecific Tandem Single Chain Antibody Simultaneously Inhibits β-Secretase and Promotes α-Secretase Processing of AβPP. Journal of Alzheimer's Disease. 28, 961-969 (2012).
  9. Zhou, C., Emadi, S., Sierks, M. R., Messer, A. A Human Single-Chain Fv Intrabody Blocks Aberrant Cellular Effects of Overexpressed [alpha]-Synuclein. Mol Ther. 10, 1023-1031 (2004).
  10. Vanden Broeck, L., Callaerts, P., Dermaut, B. TDP-43-mediated neurodegeneration: towards a loss-of-function hypothesis. Trends in Molecular Medicine. 20, 66-71 (2014).
  11. Akamatsu, M., et al. A unique mouse model for investigating the properties of amyotrophic lateral sclerosis-associated protein TDP-43, by in utero electroporation. Neuroscience Research. 77, 234-241 (2013).
  12. Keage, H. A., et al. TDP-43 in the Population: Prevalence and Associations with Dementia and Age. Journal of Alzheimer's Disease. 42, 641-650 (2014).
  13. Honda, D., et al. The ALS/FTLD-related RNA-binding proteins TDP-43 and FUS have common downstream RNA targets in cortical neurons. FEBS Open Bio. 4, 1-10 (2014).
  14. Baloh, R. H. TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration. FEBS Journal. 278, 3539-3549 (2011).
  15. Ling, S. -. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. . Converging Mechanisms in ALS and FTD: Disrupted RNA and Protein. 79, 416-438 (2013).
  16. Sasaki, S., Takeda, T., Shibata, N., Kobayashi, M. Alterations in subcellular localization of TDP-43 immunoreactivity in the anterior horns in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience Letters. 478, 72-76 (2010).
  17. Robertson, J., et al. Lack of TDP-43 abnormalities in mutant SOD1 transgenic mice shows disparity with ALS. Neuroscience Letters. 420, 128-132 (2007).
  18. Shan, X., Vocadlo, D., Krieger, C. Mislocalization of TDP-43 in the G93A mutant SOD1 transgenic mouse model of ALS. Neuroscience Letters. 458, 70-74 (2009).
  19. Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S., Kwak, S. The abnormal processing of TDP-43 is not an upstream event of reduced ADAR2 activity in ALS motor neurons. Neuroscience Research. 73, 153-160 (2012).
  20. Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
  21. Sheets, M. D., et al. Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: The production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6157-6162 (1998).
  22. Hairul Bahara, N. H., et al. Phage display antibodies for diagnostic applications. Biologicals. 41, 209-216 (2013).
  23. Azzazy, H. M. E., Highsmith, W. E. Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
  24. Zhang, X., et al. Rapid isolation of single-chain antibodies from a human synthetic phage display library for detection of Bacillus thuringiensis (Bt). Cry1B toxin. Ecotoxicology and Environmental Safety. 81, 84-90 (2012).
  25. Liu, H., et al. Selection and characterization of single-chain recombinant antibodies against spring viraemia of carp virus from mouse phage display library. Journal of Virological Methods. 194, 178-184 (2013).
  26. Cukkemane, N., Bikker, F. J., Nazmi, K., Brand, H. S., Veerman, E. C. I. Identification and characterization of a salivary-pellicle-binding peptide by phage display. Archives of Oral Biology. 59, 448-454 (2014).
  27. Adamson, C. S., et al. Novel single chain antibodies to the prion protein identified by phage display. Virology. 358, 166-177 (2007).
  28. Hebron, M. L., et al. Parkin Ubiquitinates Tar-DNA Binding Protein-43 (TDP-43) and Promotes Its Cytosolic Accumulation via Interaction with Histone Deacetylase 6 (HDAC6). Journal of Biological Chemistry. 288, 4103-4115 (2013).
  29. Wang, M. S., Zameer, A., Emadi, S., Sierks, M. R. Characterizing Antibody Specificity to Different Protein Morphologies by AFM. Langmuir. 25, 912-918 (2008).
  30. Williams, S., Sakic, B., Hoffman, S. A. Circulating brain-reactive autoantibodies and behavioral deficits in the MRL model of CNS lupus. Journal of Neuroimmunology. 218, 73-82 (2010).
  31. Jończyk, E., Kłak, M., Międzybrodzki, R., Górski, A. The influence of external factors on bacteriophages—review. Folia Microbiol. 56, 191-200 (2011).
  32. Hammers, C. M., Stanley, J. R. Antibody Phage Display: Technique and Applications. J Invest Dermatol. 134, e17 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

amyotrophicTDP 43BiopanningscFv96

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved