تحليل الوراثية المحسنة من واحدة Bioparticles الإنسان المستردة من قبل المجهرية المبسطة من الطب الشرعي الأدلة "تاتش DNA"

Summary

نحن هنا وصف استراتيجية إزالة الأمثل وفعالة لجمع الحيوي الجزيئات الموجودة في "لمس DNA" العينات، جنبا إلى جنب مع بروتوكول التضخيم تعزيز تنطوي على خطوة واحدة 5 ميكرولتر الصغيرة الحجم تحلل / STR التضخيم، للسماح للانتعاش تكرار جنبا إلى جنب قصيرة (STR) لمحات من الجهات المانحة الحيوي الجسيمات (ق).

Abstract

ويمكن الحصول على الحمض النووي من الأدلة "لمسة DNA"، الذي يضم آثار مجهرية من المواد البيولوجية البشرية. الأساليب الحالية لاسترداد DNA أثر مسحات توظيف القطن أو شريط لاصق لأخذ عينات مساحة من الاهتمام. ومع ذلك، فإن هذا النهج "أعمى ينظف" ك-عينة المواد الخلوية من مختلف الأفراد، حتى لو وتقع خلايا الأفراد في مواقع متميزة جغرافيا على هذا البند. وهكذا، وبعض من خليط الحمض النووي التي واجهتها في عينات DNA تعمل باللمس يتم إنشاؤها بشكل مصطنع من قبل ينظف نفسه. في بعض الحالات، DNA الضحية يمكن الاطلاع عليها في فائض كبير وبالتالي اخفاء DNA أي مرتكب محتمل ل.

من أجل الالتفاف على التحديات مع وسائل التعافي وتحليل القياسية، وقد وضعنا بتكلفة أقل، وطريقة "التحليل الذكي" التي تؤدي إلى تعزيز التحليل الجيني للأدلة الحمض النووي التي تعمل باللمس. نحن تصف والأمثلاستراتيجية الإنعاش المجهرية الفعالة د لجمع الحيوي الجزيئات الموجودة في عينات DNA تعمل باللمس، وكذلك استراتيجية التضخيم تعزيز تنطوي على خطوة واحدة 5 ميكرولتر microvolume تحلل / STR التضخيم للسماح استعادة ملامح STR من الجهة المانحة الحيوي الجسيمات (ق). استخدام فرد أو عدد قليل (أي "كتل") النتائج bioparticles في القدرة على الحصول على لمحات مصدر واحد. وتمثل هذه الإجراءات تقنيات محسنة بديلة لعزل وتحليل bioparticles واحد من الطب الشرعي أدلة الحمض النووي التي تعمل باللمس. في حين ليس من الضروري في كل تحقيقات الطب الشرعي، يمكن أن يكون مفيدا للغاية طريقة لاستعادة لمحة DNA الجاني مصدر واحد في الحالات التي تنطوي على الاعتداء الجسدي (على سبيل المثال، الخنق) التي قد لا يكون ممكنا باستخدام تقنيات التحليل القياسية. بالإضافة إلى ذلك، الاستراتيجيات التي وضعت هنا تقدم فرصة للحصول على المعلومات الجينية على مستوى خلية واحدة من مجموعة متنوعة من سذر أثر غير الشرعي المواد البيولوجية.

Introduction

DNA اللمس هو شكل من أشكال الأدلة البيولوجية أثر الذي هو نقل مباشر من المواد الخلوية (على سبيل المثال، تسليط خلايا الجلد) من الفرد إلى كائن أو شخص آخر خلال الاتصال الجسدي ^1. القدرة على الحصول على الحمض النووي من مجموعة متنوعة من الكائنات تطرق (وثائق، والفراش، والأحذية، والأسلحة النارية، وحاويات الشرب، والأقلام، مقابض حقيبة) وقد أبلغ في الأدب ^2-9.

وثمة عامل حاسم في تحليل الأدلة DNA مسة انتعاش الناجح لأثر المواد البيولوجية الحاضر. اللمس هو جمع أدلة الحمض النووي عادة من قبل ينظف منطقة يشتبه مع مسحة القطن المعقمة (المشار إليها باسم "ينظف أعمى"). باستخدام هذا النهج، وطبيعة المواد البيولوجية التي تم جمعها من غير المعروف ويتم تنفيذ أخذ العينات من منطقة المعمم. وجود أخاديد السطح أو الشقوق قد تعوق الانتعاش الناجح لكمية صغيرة في كثير من الأحيان بالفعل السياالمواد استثارة الحاضر. بالإضافة إلى ذلك، سوف نهج 'أعمى ينظف "المواد الخلوية بالضرورة شارك في عينة من مختلف الأفراد الذين خلايا موجودة على هذا البند، حتى لو وتقع خلايا الأفراد في مواقع متميزة مكانيا على هذا البند. التعافي من الحمض النووي ممزوجة، والتي غالبا ما تتحدى لحل لا سيما مع عينات من الحمض النووي قالب منخفض، وكثيرا ما لوحظ ^8،10،11 وفي كثير من الحالات سيكون قطعة أثرية تبعية لعملية ينظف نفسه. إذا كان فقط كمية صغيرة من المواد الحالي من إحدى الجهات المانحة، قد تفشل تقنيات استخراج وتحليل القياسية لاستعادة الملف من المساهم طفيفة. بالإضافة إلى ذلك، نوع مسحة أو ما إذا كان يستخدم الجاف أو الرطب (قبل مبلل بالماء المعقم) قد تؤثر على كمية المواد البيولوجية التي يتم جمعها بسبب الاختلافات في الامتصاصية وadsorptivity وكفاءة الافراج عن المواد البيولوجية ^12. Sأساليب الاستخراج tandard قد يؤدي إلى فقدان عينة إضافية بسبب التلاعب المطلوبة المادي للعينة أو نقل عينة الخطوات.

كما هو موضح أعلاه، تقنيات ينظف بسيطة لاسترداد المواد البيولوجية قد يؤدي إلى فقدان كميات ضئيلة من عينة بيولوجية فضلا عن حدوث زيادة لمحات ممزوجة بسبب عدم فصل المكونات البيولوجية الفردية. ولذلك، سعينا إلى تطوير استراتيجيات الانتعاش أكثر انتقائية وفعالة لجمع المجهرية الدقيقة الخلوية الحالية على الأشياء لمسها. الاستراتيجية التي وضعت لتحليل المواد البيولوجية من أدلة الحمض النووي اتصال (المشار إليها هنا باسم "bioparticles" يرجع ذلك إلى حقيقة أن نواة ليست واضحة دائما منذ أغلبية الخلايا الموجودة في طبقة البشرة الخارجية للجلد ميتة أو تموت الكيراتينية ^13)، تتضمن ما يلي: 1) مجموعة من المواد البيولوجية (أي bioparticles) عن طريق هلام فيلم الابام تطرق الأجسام والسطوح، الملابس البالية أو الجلد البشري المباشر، 2) الفحص المجهري للمواد البيولوجية تعافى لضمان جمع المواد البيولوجية البشرية المحتملة، و3) المجهرية الحيوي الجسيمات واحدة أو عدد قليل باستخدام مادة لاصقة للذوبان في الماء، و 4) راثي التنميط DNA-STR من جمعها الحيوية الجزيئات باستخدام microvolume (5 ميكرولتر) من خطوة واحدة تحلل / رد فعل التضخيم.

يوفر هذا الإجراء مزايا عديدة أكثر من طرق التحليل المستخدمة تقليديا. انتعاش bioparticles باستخدام فيلم هلام يسمح الفحص المجهري للحاضر المواد البيولوجية في العينة قبل التحليل. في حين أن الغالبية العظمى من bioparticles تعافى من أدلة الحمض النووي اللمس قد لا تكون خلايا الأنوية مما يجعلها أكثر صعوبة لتحديد أي أو كم ينبغي اختيار جزيئات الحيوية، والفحص المجهري لهذه العينات قبل يوفر التحليل إلى فرصة للبحث عن خلايا الأنوية وبالتالي maximizجي احتمال انتعاش الحمض النووي. جمع bioparticles استخدام المياه القابلة للذوبان المجهرية بمساعدة لاصق يسمح بنقل مباشر من bioparticles المستهدفة في أنابيب رد فعل. هو تصور هذا الإجراء تحت المجهر لضمان نجاح نقل المواد البيولوجية. رد فعل تخفيض أو microvolume يزيد من حساسية في حين خفض تكلفة التحليل في العينة. هذا يسمح تحليل أعداد متزايدة من عينات من الفرد قطعة من الأدلة. نظرا لمجموعة في ولاية الوراثية للجزيئات الحيوية في أدلة الحمض النووي تعمل باللمس، ينصح عينات متعددة من الأصناف الفردية.

هنا، علينا أن نظهر نجاح استخدام البروتوكولات المتقدمة للحصول على لمحات الوراثية الثبوتية للغاية من المانحين من المواد البيولوجية في أدلة الحمض النووي اللمس. أساليب التنميط جمع bioparticle المتقدمة وDNA توفر شامل "الذكية" (أي ومحددة وقابلة للقياس، عطانهج inable وواقعية وفي الوقت المناسب) الجزيئي استنادا إلى توصيف وتحليل وتفسير المواد البيولوجية أثر. في حين وضعت أصلا لتطبيقها على التحليل الجنائي للأدلة الحمض النووي تعمل باللمس، والاستراتيجيات التي وضعت هنا يمكن تطبيقها على مصادر أخرى من المواد البيولوجية وتقديم فرصة للحصول على المعلومات وتحديد الفردية على مستوى خلية واحدة.

Protocol

ملاحظة: تم جمع سوائل الجسم من المتطوعين باستخدام الإجراءات المعتمدة من قبل جامعة المؤسسي المجلس المركزي في ولاية فلوريدا مراجعة. تم الحصول على موافقة خطية أبلغ من كل جهة مانحة.

1. جمع Bioparticles من كائنات تطرق والسطوح

1. قطع فيلم هلام إلى الحجم المطلوب. تأكد من أنه هو الحجم المناسب للشريحة ميكروسكوب زجاجية تستخدم باعتبارها دعما قويا. على سبيل المثال، ل3 "س 1" شريحة زجاجية، واستخدام حجم هلام فيلم 2 "س 0.75".
   ملاحظة: طول وعرض المواد يمكن تخفيض، إذا رغبت في ذلك، ولكن لا ينبغي أن تتجاوز هذا الحجم.
2. إزالة الدعم أبيض من فيلم جل وإرفاق فيلم الجل على شريحة المجهر (الشكل 1A). اضغط لأسفل بشدة لضمان الحجز كاملة.
   ملاحظة: هناك أعلى طبقة واضحة الوقائية التي يجب عدم إزالة الضغط للسماح ليتم تطبيقها على قطعة من هلام سن الفيلم دون تلويث سطح هلام الفيلم. الشرائح استعداد هلام فيلم (مع طبقة واقية المرفقة) ويمكن تخزين في درجة حرارة الغرفة لحين الحاجة إليها.
3. إزالة فيلم واقية أعلى واضح من فيلم الجل باستخدام ملاقط معقمة عند جاهزة للاستخدام (الشكل 1B) عينة هلام الفيلم. ضع سطح هلام فيلم في اتصال مباشر مع الكائن المطلوب لمسها أو السطح (الشكل 2). ضع كمية صغيرة من الضغط لضمان نقل فعال للجزيئات الحيوية إلى فيلم هلام.
   ملاحظة: إذا تم تطبيق الكثير من الضغوط، يمكن للشريحة زجاجية كسر.
   ملاحظة: عينات متعددة من نفس الكائن أو سطح يمكن جمعها على نفس قطعة من هلام الفيلم.
4. تأكيد نقل جزيئات الحيوية على فيلم هلام (الشكل 3) عن طريق وضع شريحة على stereomicroscope (العابرة أو برنامج التحصين الموسع من الإضاءة يمكن استخدامها). استخدام التكبير من ~ 20X لأفضل عرض مساحات واسعة من فيلم هلام، والتكبير من ~ 200X للحصول على أفضل السادسالفردية جزيئات الحيوية يوينغ.
5. تخزين عينة شريحة هلام الفيلم في درجة حرارة الغرفة في مربع الشريحة مغطاة أو استخدامها على الفور لتلطيخ و / أو جمع الحيوي الجسيمات.

2. تلطيخ اختياري من Bioparticles للمساعدة في التصور

1. ضع عينة شريحة هلام فيلم أعدت في الخطوة 1 على رف الشريحة تلطيخ أكثر من بالوعة.
2. باستخدام الماصة نقل القابل للتصرف، تغطية كامل سطح هلام الفيلم مع وصمة عار التريبان الأزرق (الشكل 4A). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 دقيقة.
3. إزالة وصمة عار الزائدة عن طريق إمالة الشريحة للسماح للوصمة عار لاستنزاف قبالة في بالوعة (الشكل 4B).
   ملاحظة: الشريحة يمكن أن تشطف من الفيضانات لطيف مع الماء المعقم باستخدام الماصة نقل المتاح إذا لزم الأمر (الشكل 4C).
4. السماح الشريحة الهواء الجاف قبل الشروع في عزل جزيئات الحيوية. عرض الشرائح باستخدام stereomicroscope (~ 20X للعرض الشامل و~ 200-300X إلى vbioparticles الفردية iew) لضمان تلطيخ السليم (الشكل 4D-E).
   ملاحظة: يمكن تخزين الشريحة في درجة حرارة الغرفة في مربع الشريحة مغطاة.

3. عزل Bioparticles الاهتمام لتحليل

1. ضع العدد المناسب من 0.2 مل أنابيب PCR في رفوف وتسمية الأنابيب بشكل مناسب.
2. تحضير مزيج STR التضخيم (انظر قائمة المواد) في PCR التضخيم غطاء محرك السيارة المعينة أو الوزراء للسلامة الأحيائية. دوامة مزيج الرئيسي أجهزة الطرد المركزي بشكل جيد لفترة وجيزة في أجهزة الطرد المركزي-مصغرة.
   1. حجم مزيج التضخيم اللازمة لكل عينة هو 3.5 ميكرولتر. إعداد حجم مناسب من مزيج الرئيسي لعدد المطلوب من العينات.
3. الماصة 3.5 ميكرولتر من مزيج التضخيم في كل أنبوب 0.2 مل. سقف كل أنبوب فضفاضة.
4. ضع قطعة من شريط مزدوج عصا على نظيفة شريحة ميكروسكوب زجاجية أو مباشرة على كتلة الزجاج.
   ملاحظة: سيتم استخدام هذه لعقدأنبوب 0.2 مل في مكان أثناء جمع العينات.
5. ضع قطعة من شريط مزدوج عصا على نظيفة شريحة ميكروسكوب زجاجية. ضع قطعة من ذوبان في الماء الشريط موجة حام على رأس العصا الشريط المزدوج.
   ملاحظة: يمكن تخزين هذه الشريحة في مجفف لاستخدامها في المستقبل.
6. وضع أول أنبوب 0.2 مل على شريحة مزدوجة الشريط عصا أو كتلة أعدت في الخطوة 3.4. تعيين هذا الأنبوب جانبا حتى يتم جمع العينة.
7. ضع موجة جندى الشريحة الشريط للذوبان في الماء تحت المجهر (تضخم منخفض). استخدام غيض من إبرة التنغستن، كشط بلطف من سطح الشريط من أجل جمع كمية صغيرة (أو "الكرة") من مادة لاصقة في نهاية الإبرة (الشكل 5A).
   ملاحظة: حجم الكرة يمكن أن تكون مصنوعة صغيرة أو كبيرة اعتمادا على عدد من bioparticles التي سيتم جمعها.
8. إزالة بعناية الإبرة التنغستن بمادة لاصقة من تحت المجهر من دون إزعاج رأس الإبرة. الإبرة يمكنيكون مكان في رفوف إذا رغبت خلال وضع العينة.
9. ضع عينة مستعدة هلام فيلم (من خطوات 1 و 2) على المسرح المجهر. ضبط التركيز والتكبير حتى bioparticles يمكن أن ينظر إليها بسهولة. التعرف على جزيئات الحيوية التي سيتم جمعها.
   ملاحظة: يمكن استخدام كتلة الزجاج لدعم الشريحة إذا لزم الأمر.
10. استرداد إبرة التنغستن مع الكرة لاصقة، ووضع إبرة على سطح هلام الفيلم حيث توجد جزيئات الحيوية من الفائدة. اضغط على رأس الإبرة (مع لاصق) أسفل بحيث يكون على اتصال مع الجسيمات الحيوية (الشكل 5B). رفع الإبرة حتى تأكد من أن الجسيمات الحيوية تم جمعها. كرر هذه العملية حتى يتم جمع العدد المطلوب من جزيئات الحيوية.
11. ضع إعداد 0.2 مل PCR أنبوب على المسرح المجهر. ضبط التكبير بحيث أسفل الأنبوب الذي يحتوي على مزيج التضخيم هو في التركيز.
12. إدراج بعناية needl التنغستنه إلى 0.2 مل PCR أنبوب حتى رأس الإبرة هو في مزيج التضخيم.
    ملاحظة: يتم تنفيذ هذا أفضل أثناء عرض من خلال المجهر.
13. عقد إبرة في مزيج التضخيم حتى يتم الإفراج يذوب لاصقة وbioparticles إلى حل (الشكل 5C). إزالة الإبرة، ضع 0.2 مل تستقيم وفضفاضة غطاء الأنبوب.
14. كرر الإجراء جمع عينات إضافية. تنظيف إبرة التنغستن مع الكحول قبل مبلل (الأيزوبروبانول) تمسح بين العينات.

4. المشتركة Microvolume حمض النووي العزلة (المباشر تحلل) وراثي جسمي قصيرة جنبا إلى جنب كرر (STR) التنميط

1. إعداد العازلة تحلل (انظر المواد) في PCR التضخيم غطاء محرك السيارة المعينة أو الوزراء للسلامة الأحيائية. إضافة 1.5 ميكرولتر من تحلل العازلة لكل أنبوب لإجمالي حجم رد الفعل 5 ميكرولتر. إغلاق الأغطية أنبوب بإحكام.
   ملاحظة: 0.2 مل أنابيب تحتوي بالفعل 3.5 ميكرولتر منمزيج التضخيم وجمع الحيوي الجسيمات من الخطوة 3.
2. مكان العينات في cycler الحرارية وتضخيم عينات باستخدام الدراجات الظروف التالية: 75 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. 95 درجة مئوية لمدة 11 دقيقة. 34 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 20 ثانية و 59 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 60 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. و4 ° C الانتظار.
   1. تخزين المنتجات التضخيم في 4 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى القصير.

5. كشف المنتج - شعري الكهربائي (CE)

1. في 96 لوحة جيدا، إضافة 10 ميكرولتر من CE تشغيل مزيج (9.7 ميكرولتر الفورماميد منزوع الأيونات و 0.3 ميكرولتر معيار حجم، وانظر المواد). إضافة 1 ميكرولتر من الناتج تضخيمها أو سلم أليلية إلى كل بئر.
   تنبيه: الفورماميد هو المغير المحتملين وينبغي التعامل في غطاء الكيميائية في حين ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
2. استخدام الظروف الكهربي المحدد من قبل الشركة المصنعة في دليل عدة التضخيم أو internallذ التحقق من صحة الشروط.
3. تحليل البيانات الخام مع برامج التحليل STR.

النتائج

وتظهر الصور التمثيلية للbioparticles الفردي وتجمعت التي تم استردادها من طوق القميص (100٪ البوليستر) التي يرتديها متبرع الذكور في الشكل 6 (bioparticles الفردي) والشكل 7 (bioparticles تجمعت). وقد استعاد bioparticles من ذوي الياقات البيضاء قميص باستخدام بروتوكول الموصوفة هنا: نقل bioparticles من طوق القميص إلى هلام الفيلم من خلال الاتصال المباشر، وتلطيخ للbioparticles تعافى مع الأزرق التريبان، وجمع عينات bioparticle باستخدام إبرة التنغستن والمياه لاصقة قابلة للذوبان وتحليل STR باستخدام التضخيم 5 ميكرولتر الصغيرة الحجم تحلل / STR. أرقام 6 و 7 تمثل عينة نموذجية من bioparticles التي سيجري تحليلها من عنصر DNA اتصال فردي (20 bioparticles واحد / الفردية و 20 bioparticles تجمعت). وصفت وbioparticle (ق) التي جمعت في كل صورة مع طول وعرض القياسات (في ميكرون). والايثيلينوتقدم entage الأليلات STR تعافى من كل من bioparticle جمعها (ق) على كل صورة فردية للتدليل على درجات متفاوتة من النجاح الذي يمكن المتوقع الحصول عليها من bioparticles مع هذا النوع من الأدلة. وbioparticles تعافى من عينات DNA تعمل باللمس لقوا حتفهم إلى حد كبير أو يموتون الخلايا الكيراتينية، وبالتالي لا الحصول على لمحة STR ثبوتية من كل bioparticle التي تم جمعها، كما يمكن أن يرى في أرقام 6 و 7. لهذه العينة طوق القميص، تم الحصول عليها ملامح STR من 14/20 (70٪) من bioparticles الفردي و15/20 (75٪) تجمعت bioparticles. ومع ذلك، كل من لمحات تعافى يتراوح في القيمة الإثباتية: 3-97٪ الانتعاش أليل لمحات الفردية bioparticles و3-100٪ الانتعاش أليل لمحات bioparticle تجمعت. بسبب التباين في معدلات النجاح، ويوصى جمع العديد من bioparticles من كل بند DNA التي تعمل باللمس. وهذا يضمن فرصة أفضل للحصول على درجة عالية من probatiلقد STR الشخصية.

يتم عرض الملف الشخصي STR تم الحصول عليها من أحد نماذج bioparticle الفردية من طوق القميص في الشكل 8 (يظهر bioparticle التي الشخصى نشأت إلى اليسار). تقريبا تم الحصول على لمحة STR الكامل (28 من أصل 30 الأليلات، وانخفاض موضع واحد من أصل، دقة البيانات الشخصية التي تم الحصول عليها التحقق من خلال المقارنة إلى ملف تعريف مرجع) من هذا bioparticle الفرد. البيانات الشخصية التي تم الحصول عليها هي ذات جودة عالية مع متوازنة إلى حد معقول بين موضع مرتفعات الذروة وانخفاض لا أليلية بها. أليلية التسرب وكلاهما كثيرا ما لوحظ ارتفاع غير المتوازنة التحف الذروة مع عينات من الحمض النووي قالب منخفض. يتم عرض الملف الشخصي STR تم الحصول عليها من أحد نماذج bioparticle تجمعت من طوق القميص في الشكل 9. لمحة كاملة STR (30/30 الأليلات، دقة البيانات الشخصية التي تم الحصول عليها التحقق من خلال المقارنة إلى ملف تعريف مرجع) تم الحصول عليها. وكما ذكر سابقا، لا يتم استردادها لمحة STR من أي وقت مضىذ bioparticle التي تم جمعها. ويرد مثال التنميط DNA غير ناجحة لbioparticle احد (3٪ الانتعاش أليل، 1/30 الأليلات) في الشكل رقم 10 (bioparticle فرد). في حين كان هذا bioparticle الفرد لم تكن ناجحة، تم الحصول على لمحات أس تي آر الثبوتية للغاية من الجهات المانحة للbioparticles في هذه العينة من bioparticles الآخرين تعافى من نفس العينة. وهذا يوضح الحاجة إلى إجراء عدة عينات خلية واحدة / أجمة من نفس الكائن.

وقد استخدمت المتقدمة "الذكية" طرق التحليل موضح هنا عن أدلة الحمض النووي اتصال بنجاح لاسترداد الثبوتية لمحات من مصدر واحد واحد و"تجمعت" bioparticles من مختلف مست الأشياء والملابس (على سبيل المثال، تصلح كرسي، عجلات توجيه السيارة، والهواتف الخلوية، فناجين القهوة والسجائر، والأقلام، والقمصان، والسراويل، والسترات الصوفية). ومع ذلك، والأهم، كما تم استخدام هذا النهج للكشف والتنميط د الذكورonor DNA (مصدر واحد) في عينات البدني خليط الاتصال / الاعتداء محاكاة (على سبيل المثال، الجاني الاستيلاء على الضحية الرسغ، الرقبة أو الملابس، أو الاتصال مع الفراش الضحية كما في الاعتداءات الجنسية).

الشكل 1: إعداد الشرائح هلام الفيلم لجمع bioparticle. تتم إزالة (A) والغطاء الواقي الخلفي الأبيض باستخدام ملاقط معقمة من قطعة من هلام الفيلم لفضح دعم لاصقة. ثم يتم الالتزام بها للفيلم هلام إلى شريحة المجهر والزجاج مع الضغط على الشركة. (B) عندما العينة هلام فيلم مستعدة لاستخدامها لجمع bioparticle، فيلم وقائي واضح أعلى وإزالتها باستخدام ملاقط معقمة.

الشكل 2: جمع Bioparticle باستخدام هلام-film من مختلف ركائز. الشرائح هلام الفيلم يمكن استخدامها لجمع bioparticles من مجموعة متنوعة من السطوح. يتم وضع فيلم هلام في اتصال مباشر مع الكائن أو السطحية المثيرة للاهتمام. يتم تطبيق ضغط لطيف من أجل نقل bioparticles على سطح هلام الفيلم. مجموعة من bioparticles من (A) العناصر البالية الملابس (معطف طوق)، (B) تطرق الكائنات (سفر فنجان القهوة)، و (C) الجلد البشري المباشر (الرسغ الذكور) ترد.

يتم نقل Bioparticles على قطعة الملابس البالية (داخل بانت الساق) Bioparticles إلى هلام الفيلم من خلال الاتصال المباشر مع سطح القطعة: الرقم 3. Bioparticles يمكن العثور باسم "كتل" أو bioparticles واحد / الفرد (المشار إليها مع السهام الحمراء).

ALT = "الشكل 4" SRC = "/ الملفات / ftp_upload / 52612 / 52612fig4.jpg" />
الرقم 4: تلطيخ اختياري من bioparticles على الشرائح هلام الفيلم لتصور أفضل للbioparticles، وعينات هلام الفيلم يمكن ملطخة صمة عار التريبان الأزرق. يتم تغطية كامل سطح هلام فيلم الأزرق التريبان (A). وبعد 1-2 دقائق من تلطيخ، يميل الشريحة بلطف للسماح صمة عار الزائدة لتشغيل خارج الشريحة (B). الفيضانات لطيف مع الماء المعقم (C) يمكن استخدامها لإزالة وصمة عار الزائدة. بعد الشريحة والهواء المجففة، ويمكن الاطلاع على الشريحة تحت المجهر للتأكد من تلطيخ السليم (D، E). ملاحظة: سوف تظهر ليس كل bioparticles الملون (أي والأزرق في اللون) يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

OAD / 52612 / 52612fig5.jpg "/>
الشكل 5: جمع وتحليل Bioparticle. (A) وهناك كمية صغيرة (أو "الكرة") من ذوبان في الماء الشريط موجة حام ("لاصقة") يتم جمعها إلى غيض من إبرة التنغستن عن طريق كشط لطيف. (B) ثم تطرق لاصق على gel- سطح الفيلم من أجل جمع bioparticles من الفائدة. bioparticles فردية أو متعددة يمكن جمعها مع الكرة لاصقة واحدة. (C) مرة واحدة وقد تم جمع bioparticles المطلوب، يتم وضع رأس الإبرة إلى مزيج التضخيم في 0.2 مل PCR أنبوب. يقام إبرة في السائل حتى يذوب ويلاحظ إطلاق سراح bioparticles إلى حل. يتم تنفيذ جميع الخطوات في عملية جمع وينظر تحت المجهر لضمان جمع bioparticle ناجحة ونقلها. الرجاء انقر هنا لعرض لارنسخة الالماني من هذا الرقم.

الشكل 6: bioparticles الفردي في عينة طوق القميص تم انتشال Bioparticles باستخدام هلام فيلم من داخل طوق القميص الذي ترتديه إحدى الجهات المانحة الذكور. كانت ملطخة bioparticles باستخدام الأزرق التريبان والصور من عشرين bioparticles الفردية مختلفة تم تحديدها في العينة ترد. في كل صورة، وحلقت في bioparticle التي تم جمعها (الدوائر الحمراء تشير bioparticles التي تم استردادها لمحة، الدوائر السوداء تشير bioparticles التي لم يعثر على الملف الشخصي). ويظهر الانتعاش في المئة أليل (عدد الأليلات لوحظ من الممكن 30) أعلاه صورة bioparticle الذي تم انتشال ملف تعريف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7: تجمعت bioparticles في عينة طوق القميص تم انتشال Bioparticles باستخدام هلام فيلم من داخل طوق القميص الذي ترتديه إحدى الجهات المانحة الذكور. كانت ملطخة bioparticles باستخدام الأزرق التريبان والصور من عشرين bioparticles تجمعت مختلفة تم تحديدها في العينة ترد. في كل صورة، وحلقت في bioparticle التي تم جمعها (الدوائر الحمراء تشير bioparticles التي تم استردادها لمحة، الدوائر السوداء تشير bioparticles التي لمحة لم يعثر على الانتعاش في المئة أليل (عدد الأليلات لوحظ من الممكن 30). ويظهر لكل bioparticle الذي تم انتشال ملف تعريف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

رقيقة الصفحة = "دائما">
الرقم 8: نبذة عن جسمي STR تم الحصول عليها من bioparticle احد من طوق القميص الذكور وتم الحصول على البيانات الشخصية جسمية STR من bioparticle احد (كما هو موضح على اليسار) باستخدام 5 ميكرولتر تحلل المباشر / رد فعل التضخيم. تم تحديد دقة هذا الملف من خلال المقارنة على عينة مرجعية المانحة. خمسة عشر جسمية STR مواضع وأميلوجينين (تحديد الجنس) هم شارك في تضخيم في رد فعل واحد، ومفصولة الكهربائي الشعري. يتم عرض النتائج هنا باعتبارها رحلاني. أرقام أليل هي تسمية أسفل كل الذروة في كل مكان. يمثل محور س حجم جزء (أزواج القواعد، بي بي) والمحور العمودي يمثل كثافة إشارة (RFU وحدات مضان النسبي؛ شريطة تحت كل رقم أليل المقابلة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 9: نبذة عن جسمي STR تم الحصول عليها من bioparticle تجمعت من طوق القميص الذكور وتم الحصول على البيانات الشخصية جسمية STR من bioparticle تجمعت (كما هو موضح على اليسار) باستخدام 5 ميكرولتر تحلل المباشر / رد فعل التضخيم. تم تحديد دقة هذا الملف من خلال المقارنة على عينة مرجعية المانحة. خمسة عشر جسمية STR مواضع وأميلوجينين (تحديد الجنس) هم شارك في تضخيم في رد فعل واحد، ومفصولة الكهربائي الشعري. يتم عرض النتائج هنا باعتبارها رحلاني. أرقام أليل هي تسمية أسفل كل الذروة في كل مكان. يمثل محور س حجم جزء (أزواج القواعد، بي بي) والمحور العمودي يمثل كثافة إشارة (RFU وحدات مضان النسبي؛ شريطة تحت كل رقم أليل المقابلة).خريج "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 10: مثال لعدم الحصول على لمحة جسمية STR تم الحصول عليها من bioparticle جمع bioparticle الفرد الذي يظهر على اليسار تم جمعها من طوق القميص عينة هلام الفيلم. كما يمكن أن يرى من التشكيل الجانبي STR الناتجة (كما هو موضح على اليمين)، تم الحصول على أليل واحد فقط (من أصل 30 ممكنة). أرقام أليل هي تسمية أسفل كل الذروة في كل مكان. يمثل محور س حجم جزء (أزواج القواعد، بي بي) والمحور العمودي يمثل كثافة إشارة (RFU وحدات مضان النسبي؛ شريطة تحت كل رقم أليل المقابلة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

هنا وصفناها أساليب لجمع وتعزيز التحليل الجيني للbioparticles تعافى من أدلة الحمض النووي اللمس. النهج المتقدمة يشمل ما يلي: 1) مجموعة من المواد البيولوجية (أي bioparticles) عن طريق هلام فيلم من الأشياء لمست والسطوح، والملابس البالية أو الجلد البشري المباشر، 2) الفحص المجهري للمواد البيولوجية تعافى لضمان جمع من إمكانات المواد البشرية البيولوجية، و3) المجهرية من bioparticles واحد أو عدد قليل باستخدام مادة لاصقة للذوبان في الماء، و4) التنميط جسمية DNA-STR من bioparticles جمعها باستخدام microvolume (5 ميكرولتر) من خطوة واحدة تحلل / رد فعل التضخيم. استخدام خطوة واحدة أنبوب مغلق رد فعل يقلل من احتمال تلوث العينة وخسارة من التلاعب عينة إضافية أو نقلها إلى أنابيب رد فعل الأخرى. لتعزيز خطوة واحدة microvolume (5 ميكرولتر) تحلل / ردود فعل التضخيم STR تسمح استرداد كامل أو probativالبريد STR ملامح من الجهات المانحة للbioparticles واحد أو عدد قليل. وقد تم تطوير هذا النهج للحصول على واحدة ملامح STR مصدر من لمسة أدلة الحمض النووي المفرد ومتعددة المصادر (مثل البنود البالية الملابس والأدوات المنزلية الأخرى، لمست / الأجسام التعامل معها والسطوح، مخاليط الجلد / الجلد). وقد تم بنجاح استخدامه للكشف عن الجهة المانحة الذكور في محاكاة عينات خليط الاعتداء الجسدي.

ويمكن زيادة تقييم هذا النهج في سيناريوهات إضافية خليط الجسم السوائل / الأنسجة مثل ضحية الخدش له / لها المعتدي، والذي سوى عدد قليل من bioparticles من المعتدي أن تكون موجودة بين مبلغ هائل من المواد البيولوجية من الضحية. بالإضافة إلى ذلك، لأن هذا النهج المتقدمة في الدراسة الحالية يسمح التحليل على مستوى bioparticle واحد، يمكن استخدامها للحصول على فهم أفضل لطبيعة ومدى نقل الثانوي ^14-19، التي وسيط ينقل لمحة DNA على المعالم، الكائن أو الشخص إلى كائن آخر السطحية أو شخص ^20. قد تفشل نهج أعمى ينظف لتحليل نقل الثانوي لتحديد كميات ضئيلة من المواد المتبرع الثانوي. النهج وضعت هنا يسمح تحليل bioparticles واحد أو عدد قليل، وبالتالي لا مرتبك النتائج وفقا لوجود الكم الهائل من المواد البيولوجية من الجهات المانحة الأساسية. المنهجيات التي وضعت في هذا العمل قد يكون لها أيضا آثار على تحليل المواد البيولوجية أثر في حالات الاعتداء الجنسي مثل تلك التي تنطوي على اختراق الرقمية من المهبل حيث تحديد الإيجابي لكميات ضئيلة من خلايا الجلد من الجاني يمكن أن يكون حاسما لإثبات أن الاتصال الجنسي وقعت.

في حين جمع bioparticles من عينة هلام الفيلم لا تنطوي على التلاعب صعبة ومعقدة، وهناك خطوات حاسمة في هذا الإجراء الذي يجب أن تنجز بعناية كبيرة لضمان سونقل ccessful من bioparticles إلى وعاء التفاعل المصب. جمع bioparticles مع لاصقة للذوبان في الماء يجب أن ينظر مجهريا (أي stereomicroscope في تضخم عالية (~ 200-300X) لضمان أن فقط bioparticles من الفائدة التي تم جمعها. واعتمادا على حجم لاصقة "الكرة" المستخدمة، هناك هي القدرة على جمع المواد المحيطة إضافية والتي قد تشمل المواد على حد سواء البيولوجية وغير البيولوجية (على سبيل المثال، والألياف، وغيرها من الحطام). قد يؤدي جمع bioparticles إضافية غير مقصود في الانتعاش من الحمض النووي ممزوجة، وجمع المواد غير البيولوجية قد يعرض مثبطات في تحلل الصغيرة الحجم / ردود الفعل STR. إذا تم جمعها bioparticles متعددة مع نفس اصقة "الكرة"، هناك إمكانية لbioparticles تم جمعها سابقا لتصبح غير مرتبط من المواد اللاصقة. لا وحظ هذا في كثير من الأحيان، ولكن يمكن أن يحدث عندما أعداد أكبر من bioparticlوفاق يتم جمع (على سبيل المثال، أكثر من 50) مع مادة لاصقة "الكرة" واحدة. إذا استهدفت عدد كبير من bioparticles، فمن المستحسن أن يتم إجراء مجموعات متعددة من عدد أقل من bioparticles ولكن كل نقلها في نفس أنبوب 0.2 مل. مرة واحدة تم جمعها bioparticles، يجب توخي الحذر أثناء إزالة الشريحة هلام فيلم من مرحلة المجهر ووضع أنبوب 0.2 مل بحيث لا تشعر بالانزعاج غيض من الإبرة. أثناء وضع غيض من الإبرة في مزيج التضخيم في الجزء السفلي من الأنبوب 0.2 مل، ينبغي أن رأس الإبرة لا اجراء اتصالات مع الجانبين من أنبوب من أجل تجنب فقدان المواد على جانبي الأنبوب. في حين أن الإذابة لاصقة سريع عادة (~ 30 ثانية أو أقل اعتمادا على حجم لاصقة "الكرة")، ويمكن رصدها خلال الفحص المجهري، ورأس الإبرة يجب إزالة ببطء من مزيج التضخيم لضمان كاملة الإذابةلاصقة تم إنجازه. إذا لاصقة لم حلت تماما، ويمكن إرجاع الإبرة إلى السائل للسماح بحل كاملة.

وقد تم تحسين البروتوكولات وصفها هنا للاستخدام مع bioparticles والخلايا البشرية من الأدلة البيولوجية الطب الشرعي. المخزن المؤقت تحلل المحدد هو متوافق مع DNA-STR التضخيم مجموعة مختارة. بينما قد يكون هناك مناسبة مخازن تحلل البديلة، يجب التحقق من كفاءتها من حيث تحلل الخلايا والتوافق مع تحليل المصب من قبل المستخدم. بالإضافة إلى ذلك، وقد تم تحسين عدد عدة STR التضخيم ودورة التضخيم الموصوفة في هذا البروتوكول للاستخدام مع bioparticles واحد أو عدد قليل. تم اختيار الجيل القادم عدة STR التضخيم مع ذكرت زيادة متانة والحساسية وتم التدليل على أن يؤدي انتعاش ملامح STR جودة عالية من bioparticles واحد أو عدد قليل. بينما العديد من مجموعات STR أخرى، مع اختلاف amplifi الموصى بهاأرقام دورة الموجبة، المتاحة، فإنها قد لا تمتلك حساسية مناسبة، وبالتالي سوف تحتاج إلى تقييم صحيح قبل استخدامها في هذه البروتوكولات.

وعلى الرغم من نجاح استخدام الأساليب المذكورة لمحات الانتعاش STR من bioparticles واحد أو عدد قليل، فإن نسبة نجاح الانتعاش الشخصية لا يكون 100٪. لذلك، بالنسبة لبعض عينات DNA لمحة جزئي محدود أو لا يوجد ملف تعريف يمكن ملاحظة. لا يمكن تجنب هذا بسبب عدم القدرة على تحديد قاطع بصريا معظم bioparticles كمادة الخلوية، والدولة المتدهورة المحتملة من المواد النووية في bioparticles أو فقدان المواد عينة من المواد اللاصقة التي تم جمعها قبل نقل إلى وعاء التفاعل. ولذلك، لا ينصح تحليل عينة bioparticle واحدة لكل عنصر DNA التي تعمل باللمس. ونحن في كثير من الأحيان جمع 20 عينة مجموعات من عينة هلام فيلم الفردية وسوف جمع مجموعات عينة إضافية حسب الحاجة إذا لم يتم الحصول على لمحة STR مناسبة. تيوالقيد الوحيد لمجموعات هي كمية المواد البيولوجية موجودة على عينة هلام فيلم (وعلى الأرجح تكلفة التحليل، على الرغم من أن ردود الفعل microvolume توفر الفرصة لجمع عينات إضافية بتكلفة مماثلة أو أقل كوحدة تخزين رد فعل موحد واحد ( على سبيل المثال، 25 ميكرولتر).

أساليب التنميط DNA وضعت تصف هنا توفر النهج القائم على الجزيئي على توصيف وتحليل وتفسير المواد البيولوجية أثر تعافى من عينات DNA التي تعمل باللمس. ومع ذلك، هناك معلومات وراثية الإضافية التي يمكن الحصول عليها من bioparticles تعافى بالإضافة إلى تحديد الجهات المانحة (أي، لمحة STR) الجهة المانحة للمواد البيولوجية. مصدر السائل الأنسجة أو هيئة من أصل (على سبيل المثال، والجلد مقابل اللعاب) قد توفر معلومات سياقية حاسمة لتحقيق جنائي. بدون مثل هذا القرار، غموض المصدر الأنسجة الأصلية يمكن EXPLOكما ited الظروف بديلة للجريمة (على سبيل المثال، كيف قد أودعت السوائل في الجسم) يمكن اقتراحها. البروتوكولات جمع bioparticle والعزلة الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم لجمع bioparticles أو خلايا أخرى (على سبيل المثال، الشدق، المهبل) لاستخدامها في تحديد مصدر الأنسجة (مرنا التنميط ^21-30) الاستراتيجية التي ينطوي الصغيرة الحجم عكس النسخ (RT) و ردود الفعل التضخيم. مع مزيد من التحسين قد يكون من الممكن أيضا لتطوير / RNA استراتيجية التعاون عزل الحمض النووي للسماح نوع من الخلايا تحديد (RNA) والتنميط STR من نفس العينة، بما في ذلك bioparticles من أدلة الحمض النووي التي تعمل باللمس.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
SealRite 1.5 mL natural microcentrifuge tubes, sterile	USA Scientific	1615-5510	numerous altnerative suppliers are available, but tubes should be sterile
0.2 mL PCR tubes with flat cap, natural	Phenix Research	MPX-200F	or equivalent
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666 and/or 06-666-11C
Alcohol prep pads	Fisher Scientific	06-669-62	alternative is 06-665-24 (Fisher Sci); canister of larger alcohol wipes rather than individual pads
Sterile water			18.2 mega-ohm, autoclaved
Glass microscope slides, frosted, 3" x 1": 1mm	Fisher Scientific	12-544-3	alternative brands or sizes are acceptable
Disposable transfer pipet	Fisher Scientific	13-711-9D	alternatives are acceptable
Trypan blue solution	Sigma	T8154
Pipets: 0.2-2, 2-20, 10-100, 100-1,1000 mL	various
Sterile, aerosol-resistant pipet tips	various
Mini-centrifuge	various
Stereomicroscope	Leica	M205C	others are suitable, but must be capable of magifications up to 350X
GeneAmp PCR system 9700 thermal cycle (silver or gold block)	Life Technologies	N8050200 or 4314878	other models and manufacturers can be used, but performance with the STR amplification kit must be verified
3130 Genetic Analyzer	Life Technologies	3130-01	Alternatives: 310 or 3500 Genetic Aanlyzers (Life Technologies)
GeneMapper software	Life Technologies	various	Various versions of the software are available and can be used
WF Gel-Film , x8 retention level	Gel-Pak	WF-40-x8-A	4" x 4" wafer film; can be ordered in other size specifications
Double sided tape	various
Glass block, 3" x 1.5" x 3/8"	McCrone Microscopes and Accessories	370-2	or equivalent
Tungsten needle with holder	McCrone Microscopes and Accessories	106
3M  water soluble wave solder tape, 5414 transparent	Allied Electronics	70113977
Lysis buffer (forensicGEM Saliva, Zygem)	VWR	95043-992	Lysis buffer is prepared in 10 ml portions (prepare additional master mix portions as needed to accommodate the desired number of samples). 1.5 ml is used for each sample. To prepare 10 ml of lysis buffer (sufficient for ~6 samples): 6.9 mL sterile water, 2.1 mL 10x buffer - blue, 1 mL forensicGEM.
STR Amplification kit, AmpFlSTR Identifiler Plus PCR amplification kit	Life Technologies	4427368	Alternative STR amplification kits can be used, but performance would have to be verified by user. The amplification mix is prepared as follows (volumes per sample): 2.2 ml PCR reaction mix, 1.1 ml Primer set, 0.2 ml (1U) AmpliTaq Gold DNA polymerase. A master mix sufficient for the desired number of samples should be prepared. 3.5 ml of the prepared mix is added to the 0.2 mL tube for bio-particle collection.
AmpliTaq Gold DNA polymerase	Life Technologies	N808-0245
HiDi formamide	Life Technologies	4311320
GeneScan 500 LIZ size standard	Life Technologies	4322682
96 well optical reaction plates	Life Technologies	N8010560
Plate septa, 96 well	Life Technologies	4315933
Performance-optimized polymer, POP-7	Life Technologies	4363785	Alternatives such as POP-4 are acceptable