Analyse génétique accrue des simples bioparticules droits récupérés par micromanipulation simplifié du Forensic Evidence 'Touch ADN'

Résumé

Nous décrivons ici une stratégie de retrait optimisée et efficace pour la collecte des bio-particules présentes dans «toucher ADN 'échantillons, avec un protocole d'amplification amélioré impliquant une seule étape 5 ul micro-volume de lyse / STR amplification, pour permettre la récupération de répétition courte en tandem (STR) des profils de donneur (s) bio-particules.

Résumé

profils d'ADN peuvent être obtenus à partir de preuves «toucher l'ADN», qui comprend des traces microscopiques de matériel biologique humain. Les méthodes actuelles pour la récupération de l'ADN de trace écouvillons emploi de coton ou de ruban adhésif de goûter à une zone d'intérêt. Cependant, une telle approche «aveugle pistonnage 'co-échantillon de matériau cellulaire à partir des différents individus, même si les cellules des individus se trouvent dans des endroits géographiquement distincts sur ce point. Ainsi, certains des mélanges d'ADN rencontrées dans les échantillons d'ADN tactiles sont créés artificiellement par lui-même le pistonnage. Dans certains cas, l'ADN de la victime peut être trouvée dans excès significatif masquant ainsi l'ADN de tout auteur potentiel.

Afin de contourner les défis avec les méthodes de récupération et d'analyse standard, nous avons développé un moindre coût, la méthode «d'analyse intelligente» qui se traduit par l'analyse génétique amélioré de preuves d'ADN tactile. Nous décrivons une une optimiséd une stratégie efficace de récupération de micromanipulation pour la collecte des bio-particules présentes dans des échantillons d'ADN de contact, ainsi que d'une stratégie d'amplification renforcée impliquant une seule étape 5 pi microvolume lyse / STR amplification pour permettre le recouvrement des profils STR du donneur bio-particules (s). L'utilisation de la personne ou peu (ce est à dire, "bouquets") bioparticules résultats dans la capacité d'obtenir des profils de source unique. Ces procédures représentent des techniques améliorées de rechange pour l'isolement et l'analyse des bioparticules simples de la preuve d'ADN médico-légale tactile. Bien que pas nécessaire dans chaque enquête médico-légale, la méthode pourrait être très bénéfique pour la récupération d'un profil d'ADN source d'auteur unique dans les cas d'agression physique (par exemple, la strangulation) qui peuvent ne pas être possible en utilisant des techniques d'analyse standard. En outre, les stratégies développées ici offrent la possibilité d'obtenir de l'information génétique au niveau de la cellule unique à partir d'une variété de other trace non-légale matériel biologique.

Introduction

ADN Touch est une forme de trace preuves biologiques qui est le transfert direct de matériel cellulaire (par exemple, éliminer les cellules de la peau) d'un individu à un objet ou une autre personne lors d'un contact physique ^1. La capacité d'obtenir des profils d'ADN à partir d'une variété d'objets touchés (documents, literie, chaussures, armes à feu, des conteneurs de boissons, stylos, porte-documents à la main) a été rapporté dans la littérature ^2-9.

Un facteur critique dans l'analyse de la preuve d'ADN tactile est la reprise réussie de la trace du matériel biologique présente. Touchez preuves génétiques sont habituellement recueillies en tamponnant la zone suspecte avec un coton-tige stérile (appelé «aveugle pistonnage"). En utilisant cette approche, la nature de la matière biologique prélevé ne est pas connue et l'échantillonnage d'une zone généralisée est effectuée. La présence de rainures de surface ou des crevasses peut entraver la réussite de la relance souvent déjà petite quantité de bigique matériau présente. En outre, une approche «aveugle-décolmatage« volonté matériau cellulaire nécessairement co-échantillon des différents individus dont les cellules sont présentes sur ce point, même si les cellules des individus se trouvent dans des endroits spatialement distincts sur ce point. La reprise des profils ADN mélangés, qui sont souvent difficiles à résoudre en particulier avec des échantillons d'ADN de faible gabarit, est fréquemment observée ^8,10,11 et dans de nombreux cas sera un artefact conséquence du processus de tamponnage lui-même. Si seulement une petite quantité de matériau était présent de l'un des bailleurs de fonds, les techniques d'extraction et d'analyse standard peuvent ne parviennent pas à récupérer un profil du contributeur mineur. En outre, le type de tampon ou se il a été utilisé à sec ou humide (pré-humidifié avec de l'eau stérile) peut influencer la quantité de matériel biologique qui est recueillie en raison des différences d'absorption et adsorption et l'efficacité de la libération de la matière biologique ^12. Sméthodes d'extraction TANDARD peuvent entraîner supplémentaire perte d'échantillon due à la manipulation physique requise de l'échantillon ou de transfert de l'échantillon étapes.

Comme décrit ci-dessus, les techniques de pistonnage simples pour la récupération de matériel biologique peuvent entraîner la perte de traces de l'échantillon biologique ainsi qu'une fréquence accrue de profils mélangées en raison d'une incapacité à séparer les composants biologiques individuelles. Par conséquent, nous avons cherché à développer des stratégies plus sélectives et efficaces de récupération pour la collecte de microparticules cellulaires présents sur des objets touchés. La stratégie développée pour l'analyse du matériel biologique de la preuve d'ADN de contact (appelé ici "bioparticules" en raison du fait que le noyau ne est pas toujours visible car la majorité des cellules présentes dans la couche épidermique externe de la peau sont morts ou mourants kératinocytes ¹³⁾ implique ce qui suit: 1) collecte de matériel biologique (c.-à-bioparticules) via gel film from touché des objets et des surfaces, des vêtements usés ou de la peau humaine directe, 2) l'examen microscopique de la matière biologique récupéré pour assurer la collecte de matériel potentiel biologique humaine, et 3) micromanipulation de bio-particules simples ou quelques utilisant un adhésif soluble dans l'eau, et 4) autosomique ADN-STR profilage des bio-particules collectées au moyen d'un micro-volume (5 ul) une étape de lyse / réaction d'amplification.

Cette procédure offre de nombreux avantages par rapport aux méthodes d'analyse utilisées traditionnellement. Récupération des particules biologiques à l'aide du gel à film permet un examen microscopique de la matière biologique présente dans l'échantillon avant l'analyse. Bien que la majorité des bioparticules récupérés de la preuve d'ADN tactile peut ne pas être cellules nucléées qui rend plus difficile de déterminer qui ou combien de bio-particules devraient être choisis, l'examen microscopique de ces échantillons avant l'analyse fournit à l'opportunité de rechercher des cellules nucléées ainsi maximizment la probabilité de profil ADN récupération. La collection de bioparticules utilisant soluble dans l'eau micromanipulation assisté adhésif permet le transfert direct de bioparticules ciblées dans des tubes de réaction. Cette procédure est visualisée sous le microscope pour assurer un transfert réussi de la matière biologique. La réaction réduit ou augmente la sensibilité microvolume tout en réduisant le coût de l'analyse par échantillon. Cela permet l'analyse de l'augmentation du nombre d'échantillons à partir d'une pièce individuelle de la preuve. En raison de la gamme dans l'état génétique de bio-particules en contact preuves d'ADN, plusieurs prélèvements à partir d'éléments individuels sont recommandés.

Ici, nous démontrons l'utilisation réussie des protocoles développés d'obtenir des profils génétiques extrêmement probante de la donneurs de matériel biologique à des preuves d'ADN tactile. Les méthodes de profilage de collecte de bioparticule développé et ADN fournissent une complète «intelligent» (ce est à dire, spécifiques, mesurables, attaapproche basée inable, réalistes et opportuns) à la caractérisation moléculaire, l'analyse et l'interprétation du matériel biologique de trace. Bien que développé à l'origine pour l'application à l'analyse médico-légale de la preuve d'ADN de contact, les stratégies développées ici peuvent être appliqués à d'autres sources de matériel biologique et offrent la possibilité d'obtenir des informations d'identification individuelle au niveau de la cellule unique.

Protocole

REMARQUE: Les fluides corporels ont été recueillies par des bénévoles en utilisant des procédures approuvées par l'Université de l'Institutional Review Board de la Floride centrale. Le consentement écrit a été obtenu de chaque donneur.

1. Collecte de bioparticules aux objets et surfaces Touched

1. Couper le gel-film à la taille souhaitée. Assurez-vous que ce est la taille appropriée pour la lame de microscope en verre est utilisé comme support solide. Par exemple, pour un "x 1" slide 3 de verre, utilisez une taille gel film de 2 "x 0,75".
   REMARQUE: La longueur et la largeur du matériau peut être réduite, si on le souhaite, mais ne doit pas dépasser cette taille.
2. Retirez la pellicule blanche du gel-film et de fixer le gel-film à la lame de microscope (figure 1A). Appuyez fermement pour assurer une fixation complète.
   NOTE: Il est une couche de protection supérieure transparente qui ne devrait pas être retiré pour permettre à la pression à appliquer le long de la pièce de gel-film sans contaminer la surface de gel-film. Diapositives gel film préparé (avec couche de protection fixé) peuvent être conservés à température ambiante jusqu'à ce que nécessaire.
3. Retirez le film protecteur de finition transparente à partir du gel-film à l'aide des pinces stériles lorsque vous êtes prêt à utiliser (figure 1B) L'échantillon de gel-film. Placez la surface de gel-film en contact direct avec l'objet désiré touché ou de la surface (Figure 2). Appliquez une petite quantité de pression pour assurer un transfert efficace de bio-particules au gel-film.
   NOTE: Si trop de pression est appliquée, la lame de verre pourrait se briser.
   REMARQUE: échantillonnages multiples du même objet ou la surface peuvent être collectées sur le même morceau de gel-film.
4. Confirmer le transfert de bio-particules sur le gel-film (Figure 3) en plaçant la lame sur une stéréomicroscope (trans ou épi-éclairage peuvent être utilisés). Utilisez grossissement de 20X ~ pour un meilleur affichage de plus grandes zones du gel film, et le grossissement d'environ 200X pour mieux viindividuels bio-particules Ewing.
5. Conserver l'échantillon diaporama gel de film à température ambiante dans une boîte de diapositives couverte ou utiliser immédiatement pour la coloration et la collecte / ou bio-particules.

2. coloration facultative de bioparticules pour aider à la visualisation

1. Placer l'échantillon diaporama gel de film préparé à l'étape 1 sur un chariot porte-coloration dessus d'un évier.
2. En utilisant une pipette de transfert jetable, couvrir toute la surface du gel-film avec bleuissement trypan (figure 4A). Incuber à température ambiante pendant 1 à 2 min.
3. Retirer l'excès de colorant en inclinant la lame pour permettre la tache de se écouler dans l'évier (figure 4B).
   REMARQUE: La lame peut être rincé par les inondations douce à l'eau stérile en utilisant une pipette de transfert jetable si nécessaire (figure 4C).
4. Laisser la lame sécher à l'air avant de procéder à l'isolement de bio-particules. Voir le diaporama en utilisant un stéréomicroscope (~ 20X pour la visualisation globale et ~ 200-300X à vIEW bioparticules individuels) pour assurer une bonne coloration (figure 4D-E).
   REMARQUE: La lame peut être conservé à température ambiante dans une boîte de diapositives couverte.

3. Isolement de bioparticules d'intérêt pour l'analyse

1. Placer le nombre approprié de 0,2 ml tubes PCR dans un rack et étiqueter les tubes de façon appropriée.
2. Préparer le mélange STR ​​d'amplification (voir la liste des matériaux) dans une amplification PCR hotte désigné ou enceinte de sécurité biologique. Vortex mélange maître bien et centrifuger brièvement dans une mini-centrifugeuse.
   1. Le volume d'amplification mélange nécessaire par échantillon est de 3,5 pi; préparer un volume approprié de mélange maître pour le nombre désiré d'échantillons.
3. Pipet 3,5 ul d'amplification mélange dans chaque tube de 0,2 ml. Cap chaque tube lâche.
4. Placez un morceau de ruban adhésif double sur une lame de microscope en verre propre ou directement sur un bloc de verre.
   NOTE: Ce sera utilisé pour maintenir leTube de 0,2 ml en place lors de la collecte de l'échantillon.
5. Placez un morceau de ruban adhésif double sur une lame de microscope en verre propre. Placez un morceau de ruban de soudure à la vague soluble dans l'eau au-dessus du ruban adhésif double.
   REMARQUE: Cette glissière peut être stocké dans un dessiccateur pour une utilisation future.
6. Placez le premier tube de 0,2 ml sur la lame de ruban adhésif double ou bloc préparé à l'étape 3.4. Réglez ce tube de côté jusqu'à l'échantillon est recueilli.
7. Placez la soudure à la vague bande diaporama soluble dans l'eau sous le microscope (faible grossissement). Avec la pointe d'une aiguille de tungstène, grattez délicatement la surface de la bande afin de recueillir une petite quantité (ou "boule") d'adhésif à la fin de l'aiguille (figure 5A).
   REMARQUE: La taille de la balle peut être réalisée petite ou grande, selon le nombre de particules biologiques qui seront collectées.
8. Retirez délicatement l'aiguille de tungstène avec de la colle sous le microscope sans perturber la pointe de l'aiguille. L'aiguille peutêtre placé dans un rack si vous le souhaitez lors de la pose de l'échantillon.
9. Placer l'échantillon préparé gel film (des étapes 1 et 2) sur la platine du microscope. Réglez la mise et le grossissement jusqu'à ce que les bioparticules peuvent être facilement consultés. Identifier les bio-particules qui seront collectées.
   REMARQUE: Un bloc de verre peut être utilisé pour soutenir la diapositive si nécessaire.
10. Récupérer l'aiguille de tungstène avec de l'adhésif boule, et placez l'aiguille sur la surface du gel-film où se trouvent les bio-particules d'intérêt. Appuyez sur la pointe de l'aiguille (avec adhésif) vers le bas de sorte qu'il est en contact avec le bio-particules (figure 5B). Soulevez l'aiguille pour se assurer que la bio-particules ont été recueillies. Répétez ce processus jusqu'à ce que le nombre souhaité de bio-particules ont été recueillies.
11. Placez le tube de PCR 0,2 ml préparé sur la platine du microscope. Réglez l'agrandissement de sorte que le fond du tube contenant le mélange d'amplification est mis au point.
12. Insérez soigneusement le needl de tungstènee dans le tube de 0,2 ml PCR jusqu'à la pointe de l'aiguille est dans le mélange d'amplification.
    NOTE: Ce est préférable d'effectuer tout en regardant à travers le microscope.
13. Tenez l'aiguille dans le mélange d'amplification jusqu'à dissolution adhésifs et les bioparticules sont libérés dans la solution (Figure 5C). Retirez l'aiguille, placer les 0,2 ml verticale et lâche plafonner le tube.
14. Répétez la procédure de collecte des échantillons supplémentaires. Nettoyez l'aiguille de tungstène avec de l'alcool pré-humidifié (isopropanol) lingettes entre les échantillons.

4. Isolation combinée Microvolume Nucleic Acid (Direct Lysis) et Short Tandem Repeat autosomique (STR) Profilage

1. Préparer le tampon de lyse (voir Matériaux) dans une amplification PCR hotte désigné ou enceinte de sécurité biologique. Ajouter 1,5 pi de tampon de lyse dans chaque tube pour un volume de réaction total de 5 ul. Fermer le tube couvercles hermétiquement.
   REMARQUE: Les tubes de 0,2 ml contiennent déjà 3,5 pi de laamplification mélange et de la collection bio-particules de l'étape 3.
2. Placer les échantillons dans le thermocycleur et amplifier les échantillons en utilisant les conditions de cyclage suivantes: 75 ° C pendant 15 min; 95 ° C pendant 11 min; 34 cycles de 94 ° C pendant 20 sec et 59 ° C pendant 3 min; 60 ° C pendant 10 min; et 4 ° C attente.
   1. produits d'amplification de magasin à 4 ° C pour le stockage à court terme.

5. Détection de produit - électrophorèse capillaire (CE)

1. Dans une plaque à 96 puits, ajouter 10 pi de mélange (CE consécutive 9,7 ul de formamide désionisée et 0,3 pi de taille standard, voir Matériaux). Ajouter 1 pi de produit amplifié ou une échelle allélique pour chaque puits.
   ATTENTION: Le formamide est un mutagène potentiel et doit être manipulé dans une hotte chimique tout en portant un équipement de protection individuelle approprié.
2. Utilisez conditions électrophorétiques spécifiées par le fabricant dans le manuel du kit d'amplification ou internally validé conditions.
3. Analyser les données brutes avec un logiciel d'analyse de STR.

Résultats

Des images représentatives de bioparticules individuels et agglomérés qui ont été récupérés à partir d'un col de chemise (100% polyester) porté par un donneur mâle sont présentés dans la figure 6 (bioparticules individuels) et la figure 7 (Les bioparticules agglomérés). Les bioparticules ont été récupérés à partir du col de chemise en utilisant le protocole décrit ici: transfert de bioparticules du col de chemise de gel-film à travers un contact direct, coloration des bioparticules récupérés avec du bleu trypan, la collecte d'échantillons de bioparticule aide d'une aiguille de tungstène et de l'adhésif soluble dans l'eau et l'analyse STR ​​en utilisant l'amplification 5 pi micro-volume de lyse / STR. Figures 6 et 7 représentent un échantillon typique de bioparticules qui seraient analysées à partir d'un élément de l'ADN de touche individuelle (20 simples bioparticules individuels / 20 et bioparticules bouquets). Le bioparticule (s) recueillies dans chaque image sont étiquetés avec longueur et largeur des mesures (en microns). Le percentage d'allèles STR récupérés de chacun des bioparticule (s) collecté est prévu sur chaque image individuelle pour démontrer les degrés variables de succès qui peut se attendre à être obtenu à partir bioparticules avec ce type de preuve. Les particules biologiques récupérés à partir d'échantillons d'ADN tactiles sont en grande partie les kératinocytes morts ou mourants et donc un profil de STR ​​probante ne est pas obtenue à partir de chaque bioparticule recueillies, comme on peut le voir sur les figures 6 et 7. Pour cette chemise échantillon de collier, les profils ont été obtenus à partir de STR 14/20 (70%) des particules biologiques particuliers et 15/20 (75%) agglomérées particules biologiques. Cependant, chacun des profils récupérés gammes de valeur probante: récupération de l'allèle 3-97% pour les profils individuels de bioparticules et 3-100% de récupération de l'allèle pour les profils bioparticule agglomérées. En raison de la variabilité des taux de réussite, la collecte de nombreux bioparticules de chaque élément d'ADN tactile est recommandé. Cela garantit une meilleure chance d'obtenir un très probative profil STR.

Le profil de STR ​​obtenu à partir de l'un des échantillons individuels de la bioparticule du col de la chemise est représenté en figure 8 (la bioparticule d'où est originaire le profil est représenté sur la gauche). Près d'un profil de STR complète (28 sur 30 allèles, un locus abandonnent, la précision du profil obtenu vérifié par rapport à un profil de référence) a été obtenu à partir de ce bioparticule individu. Le profil obtenu est de haute qualité avec les hauteurs des pics entre locus raisonnablement équilibrés et ne allélique abandonnent. Allélique abandonnent et asymétriques artefacts de hauteur de pic sont tous deux fréquemment observée avec des échantillons d'ADN de faible gabarit. Le profil de STR ​​obtenu à partir de l'un des échantillons de bioparticule agglomérées du col de la chemise est représenté en figure 9. Un profil complet de STR ​​(30/30 allèles, la précision du profil obtenu vérifié par rapport à un profil de référence) a été obtenu. Comme mentionné précédemment, un profil de STR ne est pas récupéré de jamaisy bioparticule recueillies. Un exemple d'échec profilage d'ADN d'un seul bioparticule (allèle de récupération de 3%, 1/30 allèles) est illustré à la figure 10 (de bioparticule individuel). Bien que cette bioparticule personne n'a pas réussi, profils STR extrêmement probante de la donneuse des bioparticules de cet échantillon ont été obtenues à partir d'autres bioparticules récupérées à partir du même échantillon. Cela illustre la nécessité d'effectuer plusieurs prélèvements seule cellule / Clump du même objet.

Les méthodes développées «intelligents» d'analyse décrites ici pour toucher des preuves d'ADN ont été utilisés avec succès pour récupérer les profils source unique probants de simple et bioparticules «agglomérées» de diverses touché des objets et des articles d'habillement (par exemple, les accoudoirs de chaise, les volants de voiture, téléphones cellulaires, tasses à café, cigarettes, stylos, chemises, shorts, chandails et). Cependant, plus important, cette approche a aussi été utilisée pour la détection et le profilage de d mâleonor ADN (source unique) dans les échantillons de mélange physique de contact / d'assaut simulées (par exemple, l'auteur saisissant le poignet, le cou ou les vêtements, ou le contact de la victime avec la literie de la victime comme dans les agressions sexuelles).

Figure 1: Préparation des lames gel films pour la collecte de bioparticule. (A) Le capot de protection dos blanc est enlevé à l'aide de pinces stériles la pièce de gel-film pour exposer le support adhésif. Le gel-film est ensuite collée à une lame de microscope en verre avec une pression ferme. (B) Lorsque l'échantillon de gel-film est prêt à être utilisé pour la collecte de bioparticule, le film protecteur transparent supérieur est retiré en utilisant des pinces stériles.

Figure 2: collection bioparticule utilisant du gelstretch de divers substrats. Les lames gel-film peut être utilisé pour collecter des particules biologiques à partir d'une variété de surfaces. Le gel-film est placé en contact direct avec l'objet ou de la surface d'intérêt. Une légère pression est appliquée afin de transférer bioparticules sur la surface du gel-film. Collection de bioparticules de (A) les articles portés de vêtements (manteau de cols), (B) touché objets (café Voyage tasse) et (C) de la peau humaine directe (de poignet masculin) sont représentés.

Figure 3:. Bioparticules sur un article de friperie (à l'intérieur du pantalon) bioparticules sont transférés au gel-film à travers un contact direct avec la surface de l'objet. Bioparticules peuvent être trouvés comme des «bouquets» ou bioparticules simples / individuels (indiquées par des flèches rouges).

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Figure 4:. Coloration facultative de bioparticules sur diapositives gel de film Pour une meilleure visualisation des bioparticules, des échantillons de gel-film peuvent être colorées avec bleuissement trypan. La surface entière de gel-film est couverte par du bleu trypan (A). Après 1 à 2 min de la coloration, la lame est légèrement inclinée pour permettre à l'excès de colorant de se écouler du chariot (B). Inondations doux avec de l'eau stérile (C) peut être utilisé pour éliminer l'excès de colorant. Après la diapositive est séché à l'air, la diapositive peut être consulté sous le microscope pour assurer une bonne coloration (D, E). Remarque:. Pas tous bioparticules apparaîtront teinté (c., de couleur bleue) Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 5: collecte et l'analyse bioparticule. (A) Une petite quantité (ou "boule") de la bande de soudure à la vague soluble dans l'eau ("adhésif") sont collectées à la pointe d'une aiguille de tungstène en grattant délicatement. (B) L'adhésif est ensuite touché au gel- surface du film afin de recueillir les bioparticules d'intérêt. Bioparticules individuels ou multiples peuvent être recueillies avec un seul ballon adhésif. (C) Une fois les bioparticules désirées ont été recueillies, la pointe de l'aiguille est placée dans l'amplification mélange dans un tube de 0,2 ml PCR. L'aiguille est maintenue dans le liquide jusqu'à ce qu'il se dissout et la libération de particules biologiques en solution est observé. Toutes les étapes du processus de collecte sont effectuées et visualisés au microscope pour assurer la collecte de bioparticule succès et le transfert. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une larversion ger de ce chiffre.

Figure 6:. Bioparticules individuelles dans un échantillon chemise col particules biologiques ont été récupérées en utilisant un gel-film à partir de l'intérieur d'un col de chemise portée par un donneur mâle. Les bioparticules ont été colorées au bleu trypan et des images de vingt différents bioparticules individuels identifiés dans l'échantillon sont représentés. Dans chaque image, le bioparticule qui a été recueilli est encerclé (cercles rouges indiquant bioparticules dans lequel un profil a été récupéré; cercles noirs indiquant bioparticules dans lequel un profil n'a pas été récupéré). La reprise pour cent de l'allèle (nombre d'allèles observés sur une possibilité de 30) est indiqué ci-dessus l'image de bioparticule à partir de laquelle un profil a été récupéré. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7: bouquets bioparticules dans un échantillon chemise à col bioparticules ont été récupérés en utilisant un gel-film à partir de l'intérieur d'un col de chemise portée par un donneur mâle.. Les bioparticules ont été colorées au bleu trypan et des images de vingt bioparticules bouquets différents identifiés dans l'échantillon sont représentés. Dans chaque image, le bioparticule qui a été recueilli est encerclé (cercles rouges indiquant bioparticules dans lequel un profil a été récupéré; cercles noirs indiquant bioparticules dans lequel un profil n'a pas été récupérée La reprise pour cent de l'allèle (nombre d'allèles observés sur une possibilité de 30). est indiqué pour chaque bioparticule à partir de laquelle un profil a été récupéré. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 8: profil autosomique STR ​​obtenu à partir d'une seule bioparticule d'un col de chemise masculine Un profil autosomique STR ​​a été obtenu à partir d'un seul bioparticule (montré à gauche) en utilisant les 5 pi de lyse directe / de réaction d'amplification.. La précision de ce profil a été déterminée par comparaison avec un échantillon de référence du donneur. Quinze autosomique STR loci et amélogénine (détermination du sexe) sont co-amplifiés dans une réaction unique et séparé par électrophorèse capillaire. Les résultats sont affichés ici comme un électrophérogramme. Numéros allèles sont désignation ci-dessous chaque pic à chaque locus. L'axe des abscisses représente la taille du fragment (paires de bases, pb) et l'axe y représente l'intensité du signal (RFU unités de fluorescence relative; fourni sous chaque numéro de allèle correspondante). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de ce chiffre.

Figure 9: profil autosomique STR ​​obtenu à partir d'un bioparticule groupée d'un col de chemise masculine Un profil autosomique STR ​​a été obtenu à partir d'un bioparticule groupée (montré à gauche) en utilisant les 5 pi de lyse directe / de réaction d'amplification.. La précision de ce profil a été déterminée par comparaison avec un échantillon de référence du donneur. Quinze autosomique STR loci et amélogénine (détermination du sexe) sont co-amplifiés dans une réaction unique et séparé par électrophorèse capillaire. Les résultats sont affichés ici comme un électrophérogramme. Numéros allèles sont désignation ci-dessous chaque pic à chaque locus. L'axe des abscisses représente la taille des fragments (paires de bases, pb) et l'axe des y représente l'intensité de signal (RFU des unités de fluorescence relative; disponible sous chaque numéro d'allèle correspondant).pg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 10:. Exemple d'un échec à obtenir un profil autosomique STR ​​obtenu à partir d'un bioparticule recueillies Le bioparticule individuelle montré à gauche ont été recueillies auprès d'un échantillon de gel du film col de chemise. Comme on peut le voir à partir du profil résultant STR (représenté à droite), un seul allèle (sur 30 possible) a été obtenu. Numéros allèles sont désignation ci-dessous chaque pic à chaque locus. L'axe des abscisses représente la taille du fragment (paires de bases, pb) et l'axe y représente l'intensité du signal (RFU des unités de fluorescence relative; fourni sous chaque numéro de allèle correspondante). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Ici, nous avons décrit les méthodes pour la collecte et l'analyse génétique améliorée de bioparticules récupérés de la preuve d'ADN tactile. L'approche développée comprend les éléments suivants: 1) la collecte de matériel biologique (c.-à-bioparticules) via gel film à partir d'objets touchés et des surfaces, des vêtements usés ou de la peau humaine directe, 2) l'examen microscopique de la matière biologique récupéré pour assurer une collection du potentiel matériau biologique humain, et 3) de micromanipulation seul ou quelques particules biologiques en utilisant un adhésif soluble dans l'eau, et 4) autosomique ADN-STR profilage des particules biologiques collectées en utilisant un micro-volume (5 ul) une étape de lyse / réaction d'amplification. L'utilisation d'une réaction de tube fermé en une seule étape réduit le risque de contamination et de l'échantillon perte de manipulations des échantillons supplémentaires ou le transfert à d'autres tubes de réaction. Le microvolume une étape renforcée (5 ul) de lyse / STR réactions d'amplification permet la récupération de la pleine ou probative STR profils de donneur de bioparticules seul ou quelques. Cette approche a été développée pour obtenir des profils source de STR ​​simples de toucher l'ADN preuves mono et multi-source (par exemple, les articles portés de vêtements et d'autres articles ménagers, touché / objets et les surfaces traitées, mélanges peau / peau). Il a été utilisé avec succès pour la détection du donneur mâle dans les échantillons de mélange d'assaut physiques simulées.

Cette approche pourrait être évaluée dans d'autres scénarios de mélange fluide corporel / de tissus comme une victime grattant / son agresseur, dans lequel seuls quelques bioparticules de l'agresseur serait présent parmi une quantité énorme de matériel biologique de la victime. En outre, puisque cette approche développée dans l'étude actuelle permet l'analyse au niveau de bioparticule unique, il pourrait être utilisé pour acquérir une meilleure compréhension de la nature et l'étendue de transfert secondaire ^{de 14 à 19,} dans lequel un intermédiaire transfère un profil d'ADN sur une surfaCE, objet ou une personne à un autre objet de la surface ou de la personne ^20. Une approche aveugle décolmatage à l'analyse de transfert secondaire peut échouer à identifier des traces de matériel du donneur secondaire. L'approche développée ici permet l'analyse des bioparticules seul ou quelques et donc les résultats ne sont pas confondu par la présence d'une quantité énorme de matériel biologique du donneur primaire. Les méthodologies développées dans ce travail peut aussi avoir des implications pour l'analyse de traces de matériel biologique dans les cas d'agression sexuelle tels que ceux impliquant la pénétration du numérique du vagin où l'identification positive de l'état de traces de cellules de la peau de l'auteur pourrait être cruciale pour établir que le contact sexuel est produite.

Bien que la collecte de l'échantillon bioparticules de gel-film ne implique pas manipulations difficiles et complexes, il ya des étapes critiques dans cette procédure qui doivent être effectuées avec grand soin pour assurer la successful transfert de particules biologiques dans le récipient de réaction en aval. La collecte de particules biologiques avec l'adhésif soluble dans l'eau doit être considérée au microscope (par exemple, microscope stéréoscopique à un grossissement élevé (~ 200-300X) pour se assurer que seules les particules biologiques d'intérêt sont recueillies. Selon la taille de l'adhésif "balle" utilisé, il est le potentiel de recueillir du matériel environnant supplémentaire qui peut inclure à la fois le matériel biologique et non biologique (fibres par exemple, d'autres débris). La collection de bioparticules supplémentaires involontaires peut entraîner la reprise des profils ADN mélangés. La collection de matériel non biologique peut introduire des inhibiteurs dans la lyse des micro-volumes / réactions Str. Si plusieurs particules biologiques sont collectées avec le même adhésif "balle", il existe un potentiel de particules biologiques collectées antérieurement à devenir détaché de l'adhésif. Ce ne est pas souvent observée, mais peut se produire où un grand nombre de bioparticles sont recueillies (plus de 50 par exemple) avec un adhésif single "balle". Si un grand nombre de particules biologiques sont ciblés, il est recommandé que plusieurs collections de moins de particules biologiques sont faites mais tous transférés dans le même tube de 0,2 ml. Une fois particules biologiques ont été recueillies, il faut veiller lors de l'enlèvement de la lame de gel-film de la platine du microscope et le placement du tube de 0,2 ml de sorte que la pointe de l'aiguille ne est pas perturbé. Pendant le placement de la pointe de l'aiguille dans le mélange d'amplification à la partie inférieure du tube de 0,2 ml, la pointe de l'aiguille ne doit pas entrer en contact avec les parois du tube afin d'éviter la perte de matière sur les parois du tube. Bien que la solubilisation de l'adhésif est généralement rapide (~ 30 s ou moins en fonction de la taille de l'adhésif "balle") et peut surveiller lors de l'examen microscopique, la pointe de l'aiguille doit être retirée lentement à partir du mélange d'amplification pour se assurer que toutes solubilisationde l'adhésif qui a été réalisé. Si l'adhésif ne se est pas complètement dissous, l'aiguille peut être retourné au liquide pour permettre une dissolution complète.

Les protocoles décrits ici ont été optimisés pour une utilisation avec bioparticules et cellules humaines de preuves biologiques légale. Le tampon de lyse sélectionné est compatible avec le kit d'amplification d'ADN-STR sélectionné. Bien qu'il y ait des tampons de lyse de remplacement appropriées, leur efficacité en termes de lyse cellulaire et la compatibilité avec l'analyse en aval doit être vérifiée par l'utilisateur. En outre, le nombre de STR kit d'amplification et cycle d'amplification décrites dans ce protocole ont été optimisés pour une utilisation avec bioparticules seul ou quelques. Un kit STR d'amplification de la prochaine génération avec rapporté une robustesse accrue et la sensibilité a été sélectionné et a été démontré que conduire à la reprise des profils de STR haute qualité à partir bioparticules seul ou quelques. Alors que de nombreux autres kits STR, avec plus ou amplifi recommandéenombre de cycles de cations, sont disponibles, ils peuvent ne pas posséder la sensibilité appropriée et donc devraient être correctement évalués avant de les utiliser dans ces protocoles.

Malgré l'utilisation réussie des méthodes décrites pour les profils de STR de récupération de bioparticules seul ou quelques, le taux de récupération de profil succès ne sera pas 100%. Par conséquent, pour certains échantillons un profil d'ADN partielle limitée ou pas de profil peuvent être observées. Cela ne peut pas être évitée en raison de l'incapacité d'identifier de façon concluante visuellement la plupart bioparticules comme matériau cellulaire, l'état de dégradation potentielle de la matière nucléaire dans les bioparticules ou perte de matière de l'échantillon de l'adhésif recueillies avant le transfert dans le récipient de réaction. Par conséquent, l'analyse d'un seul échantillon de bioparticule pour chaque élément de l'ADN contact ne est pas recommandé. Nous recueillons souvent 20 ensembles d'échantillons à partir d'un échantillon individuel gel cinéma et recueillerons ensembles d'échantillons supplémentaires au besoin si un profil STR appropriée ne est pas obtenue. Til limitation que pour les collections est la quantité de matériel biologique présent sur l'échantillon gel-film (et probablement le coût d'analyse, bien que les réactions de microvolumes permettent de prélever des échantillons supplémentaires pour un coût similaire ou inférieur comme un seul volume de réaction standard ( par exemple, 25 ul).

Les méthodes de profilage d'ADN développés décrivent ici fournissent une approche fondée sur la caractérisation moléculaire, l'analyse et l'interprétation du matériel biologique de trace récupéré à partir d'échantillons d'ADN tactiles. Cependant, il existe une information génétique supplémentaire qui peut être obtenu à partir des particules biologiques récupérés, en plus de la détermination du donneur (c.-à profil STR) du donneur de la matière biologique. La source de fluide tissu ou corps d'origine (par exemple, la peau contre la salive) peut fournir des informations contextuelles cruciale d'une enquête criminelle. Sans une telle détermination, l'ambiguïté de la source d'origine de tissu peut être Exploité que les circonstances du crime alternatives (par exemple, comment le fluide corporel peut avoir été déposé) pourrait être suggéré. Les protocoles de collecte et d'isolement bioparticule décrits ici peuvent être utilisés pour recueillir des particules biologiques ou d'autres cellules (par exemple, buccale, vaginale) à utiliser dans l'identification de la source de tissu (ARNm profilage ^21-30) stratégie qui consiste à micro-volume de transcription (RT) inversée et réactions d'amplification. Avec une optimisation plus poussée il peut également être possible de développer un / stratégie de co-ARN d'isolement de l'ADN pour permettre l'identification du type de cellules (ARN) et STR profilage partir du même échantillon, y compris bioparticules de preuve d'ADN tactile.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
SealRite 1.5 mL natural microcentrifuge tubes, sterile	USA Scientific	1615-5510	numerous altnerative suppliers are available, but tubes should be sterile
0.2 mL PCR tubes with flat cap, natural	Phenix Research	MPX-200F	or equivalent
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666 and/or 06-666-11C
Alcohol prep pads	Fisher Scientific	06-669-62	alternative is 06-665-24 (Fisher Sci); canister of larger alcohol wipes rather than individual pads
Sterile water			18.2 mega-ohm, autoclaved
Glass microscope slides, frosted, 3" x 1": 1mm	Fisher Scientific	12-544-3	alternative brands or sizes are acceptable
Disposable transfer pipet	Fisher Scientific	13-711-9D	alternatives are acceptable
Trypan blue solution	Sigma	T8154
Pipets: 0.2-2, 2-20, 10-100, 100-1,1000 mL	various
Sterile, aerosol-resistant pipet tips	various
Mini-centrifuge	various
Stereomicroscope	Leica	M205C	others are suitable, but must be capable of magifications up to 350X
GeneAmp PCR system 9700 thermal cycle (silver or gold block)	Life Technologies	N8050200 or 4314878	other models and manufacturers can be used, but performance with the STR amplification kit must be verified
3130 Genetic Analyzer	Life Technologies	3130-01	Alternatives: 310 or 3500 Genetic Aanlyzers (Life Technologies)
GeneMapper software	Life Technologies	various	Various versions of the software are available and can be used
WF Gel-Film , x8 retention level	Gel-Pak	WF-40-x8-A	4" x 4" wafer film; can be ordered in other size specifications
Double sided tape	various
Glass block, 3" x 1.5" x 3/8"	McCrone Microscopes and Accessories	370-2	or equivalent
Tungsten needle with holder	McCrone Microscopes and Accessories	106
3M  water soluble wave solder tape, 5414 transparent	Allied Electronics	70113977
Lysis buffer (forensicGEM Saliva, Zygem)	VWR	95043-992	Lysis buffer is prepared in 10 ml portions (prepare additional master mix portions as needed to accommodate the desired number of samples). 1.5 ml is used for each sample. To prepare 10 ml of lysis buffer (sufficient for ~6 samples): 6.9 mL sterile water, 2.1 mL 10x buffer - blue, 1 mL forensicGEM.
STR Amplification kit, AmpFlSTR Identifiler Plus PCR amplification kit	Life Technologies	4427368	Alternative STR amplification kits can be used, but performance would have to be verified by user. The amplification mix is prepared as follows (volumes per sample): 2.2 ml PCR reaction mix, 1.1 ml Primer set, 0.2 ml (1U) AmpliTaq Gold DNA polymerase. A master mix sufficient for the desired number of samples should be prepared. 3.5 ml of the prepared mix is added to the 0.2 mL tube for bio-particle collection.
AmpliTaq Gold DNA polymerase	Life Technologies	N808-0245
HiDi formamide	Life Technologies	4311320
GeneScan 500 LIZ size standard	Life Technologies	4322682
96 well optical reaction plates	Life Technologies	N8010560
Plate septa, 96 well	Life Technologies	4315933
Performance-optimized polymer, POP-7	Life Technologies	4363785	Alternatives such as POP-4 are acceptable