Lepr<sup&gt; ديسيبل</sup&gt; نموذج الفأر من النوع 2 من مرض السكري: البنكرياس عزل جزيرة وتعيش خلية 2 فوتون التصوير من الجزر سليمة

Summary

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Lepr^db and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Abstract

داء السكري من النوع 2 هو مرض مزمن يؤثر على 382 مليون شخص في عام 2013، ومن المتوقع أن يرتفع إلى 592،000،000 بحلول عام 2035 ^1. وخلال العقود الماضية 2، ودور ضعف خلايا بيتا في داء السكري من النوع 2 تم تأسيس بوضوح ^2. وقد تطلب تقدم البحوث طرق لعزل الجزر البنكرياسية. بروتوكول للعزلة جزيرة قدم هنا أسهم العديد من الخطوات المشتركة مع البروتوكولات من المجموعات الأخرى، مع بعض التعديلات لتحسين المحصول وجودة من الجزر المعزولة من كل من النوع البري والسكري ^ديسيبل Lepr (ديسيبل / ديسيبل) الفئران. ثم ويرد الخلية الحية 2-الفوتون طريقة التصوير التي يمكن استخدامها لتحقيق السيطرة على إفراز الأنسولين داخل الجزر.

Introduction

دور ضعف خلايا بيتا في المرض وقد تم الاعتراف على نطاق واسع ^3،4. خطوط الخلايا مثل MIN6 وINS-1 هي أدوات مفيدة لفهم بيولوجيا السلوك خلايا بيتا. ومع ذلك، التحكم الفسيولوجية لإفراز الأنسولين تجري داخل جزر لانجرهانز. هذه الجزر تحتوي على الآلاف من خلايا بيتا معبأة بإحكام، وكذلك الأوعية الدموية وغيرها من أنواع الخلايا في الغدد الصماء. هذه البيئة داخل جزيرة يؤثر إفراز الأنسولين، ومن المرجح أن تكون مهمة في مرض السكري. لذلك، لفهم السيطرة الفسيولوجية لإفراز الأنسولين، والفيزيولوجيا المرضية للمرض، فمن الضروري لدراسة الجزر سليمة.

جزيرة العزلة

الجزر الإنسان الحي و، ولا سيما الجزر الإنسان من مرضى داء السكري من النوع 2 ويصعب الحصول عليها. بالإضافة إلى ذلك، الجزر البشرية لديها إمكانيات محدودة للتلاعب الجزيئية التجريبية. لذا استخدم الباحثون هويتيح من الحيوانات والنماذج الحيوانية من مرض السكري من النوع 2. نموذج واحد من هذا القبيل هو مرض الماوس ديسيبل / ديسيبل. هذا هو طفرة تلقائية أن النماذج داء السكري من النوع 2 مع تطور النمط الظاهري الذي يوازي بشكل وثيق الأمراض التي تصيب البشر ^5،6. بروتوكول المعروضة هنا للجزيرة بمعزل عن السكري الفئران ديسيبل / ديسيبل لديه العديد من الخطوات المشتركة مع المجموعات الأخرى مع بعض التحسينات لأفضل عائد وتنقية وتعزيز بقاء الجزيرة.

التصوير 2 الفوتون

الخلية الحية فحص 2 الفوتون هو موضح هنا تمكن الباحثين من تحديد عدد وتقييم خصائص الحبيبات التي تحتوي على الانسولين واحدة من العديد من الخلايا من السكري ⁷ والنوع البري الجزر ^8،9.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: تم إجراء جميع التجارب الحالية وفقا للإجراءات الأخلاق الحيوانية المحلية من جامعة كوينزلاند (التي وافقت عليها جامعة كوينزلاند، تشريحي جنة الأخلاقيات العلوم البيولوجية).

1. جزيرة العزلة

1. إعداد كاشف
   1. مزيج من الإنزيمات
      1. لهضم البنكرياس، واستخدام خليط من liberase وكولاجيناز النوع الرابع. تمييع TL liberase (منخفض thermolysin) 1 قنينة من 5 ملغ مع 26 مل من DMEM (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة).
      2. إعداد كولاجيناز النوع الرابع في المخزن هانك بتركيز 0.5mg / مل، على أن تستكمل مع 5MM HEPES، 0.5MM CaCl _2، 0.1mg / مل الدناز و1mg / مل ألبومين المصل البقري.
      3. خلط TL liberase والحلول كولاجيناز في نسبة 4: 1 (من حيث الحجم)، أي 4 مل liberase TL + 1 مل كولاجيناز. قسامة مزيج من الأنزيمات ل2.5ML كل وتخزينها في -20 ° C.
         ملاحظة: حضانة مرات الأنسجة الخامسآرى قليلا بين دفعات من انزيم (30 ثانية إلى 1 دقيقة الفرق). لذلك، قد تكون هناك حاجة إلى اختبار دفعة واحدة.
   2. RPMI عزل وسائل الإعلام
      1. حل قنينة واحدة من RPMI 1640 المسحوق في 1 لتر من الماء في RT وتكملة مع 2 غرام NaHCO _3، 4.02 غرام HEPES.
      2. الجمع بين وسائل الإعلام العزلة RPMI في قارورة مخروطية كبيرة، مع مزيج النمام المغناطيسي، والتكيف مع درجة الحموضة 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم، فلتر تعقيم وتخزين عند 4 درجات مئوية.
   3. RPMI الثقافة وسائل الإعلام
   4. استخدام RPMI سائل الإعلام والثقافة، مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ المضادات الحيوية (مثل البنسلين 100 U / مل، الستربتومايسين 100 ميكروغرام / مل).
2. عزل جزيرة والتثقيف
   1. التضحية الحيوانية
      1. التضحية الفئران عن طريق التفكك عنق الرحم أو CO ₂ الخنق وفقا للإجراءات أخلاقيات المؤسسة المحلية. رش جسم الفأر تماما مع الايثانول 70٪.
   2. الإرواء البنكرياس
      1. USE 2 التخفيضات طويلة أفقيا من خلال الجلد في منطقة البطن والصفاق لجعل رفرف على شكل حرف V. سحب رفرف من الجلد حتى كشف تجويف البطن بأكمله، وضعت جانبا الأمعاء والحفاظ على الكبد في مكان من المناديل الورقية المطوية للكشف عن القناة الصفراوية المشتركة (الشكلان 1 و 2). وضع الحيوان بحيث اتجه نحو الجراح والذيل بعيدا عن الجراح.
      2. تطبيق المشبك الأوعية الدموية في أمبولة على الحائط الاثني عشر لمنع الانزيمات حقن من دخول العفج (الشكل 1).
         ملاحظة: هذه خطوة مهمة لأنها تحدد ما إذا كانت الإنزيمات حقن سيذهب إلى القناة البنكرياسية ويروي البنكرياس أو الجزر إلى موقع الحقن (أكثر من الشبك) أو الخوض في الاثني عشر (تحت المشبك).
      3. يقني؛ يدخل القنية القناة الصفراوية المشتركة مع G إبرة 31 بالقرب من تقاطع القناة الكبدية المشتركة والقناة المرارية (الشكل 1)، وتترك مجالا لحقن الثاني إذا عشرفشل البريد البنكرياس ليروي للمرة الأولى. ببطء (أكثر من ~ 10 ثانية) ضخ حوالي 2 مل من خليط انزيم البارد في الماوس القناة الصفراوية المشتركة.
         ملاحظة: سيتم perfused لالبنكرياس بسرعة إذا المشبك هو في المكان المناسب.
      4. ضبط الموقف المشبك إذا كانت إبرة داخل القناة الصفراوية المشتركة ولكن لا يمكن أن يروي البنكرياس (أي، نقل ما يصل المشبك قليلا بعيدا عن الكبد إذا كان أكثر من فرضت أو تحريكه لأسفل قليلا إلى الكبد إذا فرضت تحت).
         ملاحظة: إبرة يذهب في بعض الأحيان إلى الكبسولة المحيطة بدلا من تجويف القناة. وهناك علامة مفيدة للتحقق ما إذا كانت الإبرة داخل القناة الصفراوية المشتركة هو تمدد القناة عند حقن. إذا فشل البنكرياس ليروي، والبديل هو يمكن حقن خليط انزيم إلى مواقع متعددة من البنكرياس مع انخفاض العائد المتوقع. نضح الموقع الأيسر من البنكرياس (الفص الطحال) مهم لتعظيم العائد جزيرة.
      5. بعد البنكرياس صerfused، بسرعة إزالة البنكرياس، ووضعها في قارورة (~ 20 مل، والزجاج)، واحتضان ل~ 19 دقيقة في 37 ° C حمام الماء.
         ملاحظة: فترة حضانة يمكن أن تختلف قليلا اعتمادا على سلالة الماوس والعمر.
      6. بعد فترة حضانة، إيقاف عملية الهضم عن طريق إضافة ~ 20 مل من وسائل الإعلام العزلة الباردة. هزة القارورة بلطف لتعطيل البنكرياس وتصب عليه من خلال غربال الشاي العادي (قطر المسام من 1 ملم) في أنبوب معقم 50 مل. ملأ الأنبوب مع وسائل الإعلام العزل والطرد المركزي في 400 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية مع قبالة الفرامل.
      7. حل بيليه في وسائل الإعلام العزلة مرة أخرى، ونقل إلى اثنين من 15 مل أنابيب، ثم الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية مع قبالة الفرامل. بعد تطلع طاف، مزج الكريات اثنين بشكل جيد مع 6 مل من وسائل الإعلام كثافة الفصل المتدرج الخلية (Histopaque 1077 الحل) في أنبوب من قبل vortexing أو pipetting صعودا وهبوطا. ثم إضافة بلطف ~ 6 مل من وسائل الإعلام العزلة إلى جانب أنبوب على رأسوسائل الاعلام فصل التدرج الكثافة وأجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية مع قبالة الفرامل.
      8. جمع طاف في الأعلى (وسائل الإعلام العزلة)، الوسطى والدنيا (كثافة الخلية التدرج وسائل الاعلام فصل) طبقة في 3 أطباق منفصلة. انتقاء الجزر في هذه الأطباق 3، وذلك باستخدام ماصة تحت المجهر تشريح.
         ملاحظة: الطبقة الوسطى يحتوي على معظم الجزر. يتم الاعتراف الجزر عن الهياكل المدمجة من ~ 50-500 ميكرون في الحجم (الشكل 3). نحصل ~ 200 الجزر في الفئران WT و300- 100 <الجزر في الفئران ديسيبل / ديسيبل.
   3. جزيرة التثقيف
      1. لمساعدة الجزر على التعافي من انزيم الهضم والجماعات ثقافة 40 الجزر في 25 سم طبق بتري مع 6ML RPMI سائل الإعلام والثقافة (10MM الجلوكوز) عند 37 درجة مئوية، و 5٪ / 95٪ CO ₂ / O ₂ ل2 قبل أيام من العيش -cell 2 الفوتون التصوير. تغيير ثقافة وسائل الإعلام يوميا.

2. يعيش الخلية 2 فوتون التصوير

1. إعداد كاشف
   1. خارج الخلية العازلة
      1. إعداد الصوديوم خارج الخلية غنية عازلة للمقايسة 2 الفوتون مع 140 ملي كلوريد الصوديوم، 5 مم بوكل، 2.5 ملي CaCl _2، 1 ملم MgCl _2، 5 ملي NaHCO ₃ و 10 ملي HEPES.
   2. خارج الخلية صبغ
      1. للمقايسة 2 الفوتون، وإعداد الأوراق المالية SRB 8 ملم في المخزن خارج الخلية، قسامة في أنابيب صغيرة وتخزينها في -20 ° C. تمييع SRB الأسهم 01:10 العازلة في الخلية الطازجة للحصول على تركيز العمل من 0.8 ملم.
2. التصوير الفوتون
   1. أولا، قبل احتضان الجزر مثقف 2 يوما في 3 ملي العازلة خارج الخلية الجلوكوز لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: نحن نستخدم الجزر بين 2 و 5 أيام في الثقافة.
   2. ثم، ضع شريحة زجاجية على غرفة التحكم الحرارية التي شنت على المسرح المجهر. استخدام الشحوم لمنع تسريب حل.
   3. تغطية غرفة مع 500 ميكرولتر من extracellجزيئية العازلة التي تحتوي على 0.8 ملي SRB مع تركيزات الجلوكوز مختلفة (3 ملم، 6 ملم، 15 ملم و 20 ملم الجلوكوز).
   4. بعد ذلك، وضع جزيرة قبل المحتضنة في منتصف الغرفة والتركيز على 3-4 طبقات الخلايا في جزيرة حيث، في الجزر القوارض، المناعية للأنسولين يدل على أن معظم الخلايا هي خلايا بيتا.
      ملاحظة: سيتم SRB الخطوط العريضة عن غشاء الخلية للجزيرة بسرعة وجزيرة جاهز للصورة.
   5. استخدام المجهر 2 الفوتون مع الهدف 60X الغمر النفط (NA 1.42) وبرامج التصوير (على سبيل المثال، ScanImage ^11). الشكل 4 يوضح ترتيب المجهر نموذجي. صورة أحداث exocytic باستخدام SRB كما غشاء impermeant علامة خارج الخلية الفلورسنت متحمس بواسطة نبضات ليزر الفيمتو ثانية في 880 نانومتر، مع مضان الكشف على 550-650 نانومتر. تسجيل استجابات جزيرة لتحفيز.
   6. تحديد الأحداث exocytic واحدة من قبل الظهور المفاجئ لبقعة صغيرة الفلورسنت (القرار 10 بكسل /1؛ م) وتأكيد من قبل مرحلة ارتفاع سريع للإشارة الفلورسنت على المنطقة ذات الاهتمام (~ 0.78 ميكرون ^2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

العائد جزيرة وتنقية

لالعادي النوع البري الماوس، ومن المتوقع حوالي 200 الجزر. الجزر صحية تبدو مشرقة، على شكل دائري ولها حدود على نحو سلس. دفعة العزلة على هضم عادة الجزر الصغيرة وغامض في حين أن دفعة هضمها تحت ديها عدد أقل من الجزر وال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

العامل الأكثر أهمية في عزلة جزيرة هو نضح الأولي من البنكرياس. وتحت perfused لنتائج البنكرياس في أقل من ذلك بكثير العائد جزيرة. عوامل أخرى تؤثر أيضا على جودة العزل مثل الوقت الهضم ومستوى الهز الذي يمكن أن يعوض جزئيا عن مستوى التروية. على سبيل المثال، سوف تحتاج إلى البنك...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liberase TL 5 mg	Roche	-5401020001
Collagenase type IV-1g	Gibco-Life Technologies	17104-019
Histopaque 1077 500 ml	Sigma Aldrich	10771
RPMI 1640 Medium (10x) 1L	Sigma Aldrich	R1383	to prepare isolation media
RPMI 1640 (1x) 500 ml	Gibco-Life Technologies	21870-076	to prepare cultured media
Penicillin-Streptomycin 100 ml	Gibco-Life Technologies	15140-122	to prepare cultured media
Fetal bovine serum 500 ml	Gibco-Life Technologies	10099-141	to prepare cultured media
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco-Life Technologies	11966-025	to dilute the liberase
Metamorph program	Molecular Devices, USA		to analyze the 2-photon images