Lepr<sup&gt; DB</sup&gt; 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징

요약

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Lepr^db and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

초록

2 형 당뇨병은 2013 년 382,000,000명에 영향을 미치는 만성 질환이며, 지난 2 년 동안. 2035 ¹ 592000000에 ^{명확하게이} 설립 된 제 2 형 당뇨병에서 베타 세포 기능 장애의 역할을 증가 할 것으로 예상된다. 연구 진행은 췌장 섬의 분리 방법을 요구하고있다. 섬 분리의 프로토콜은 야생형과 당뇨병 Lepr의 ^데시벨 (dB / DB) 마우스 모두에서 고립 된 섬의 수율과 품질을 개선하기 위해 일부 수정과 함께 공유 여기 다른 그룹의 프로토콜과 많은 일반적인 단계를 제시했다. 라이브 셀 2 광자 이미징 법은 아일렛 내에서 인슐린 분비의 조절을 조사하기 위하여 사용될 수 제시된다.

서문

질병의 베타 - 세포 기능 부전의 역할은 광범위 ^3,4-을 인식하고있다. 이러한 MIN6와 INS-1 등의 세포주는 베타 세포 행동의 생물학을 이해하기 위해 유용한 도구이다. 그러나, 인슐린 분비의 생리적 제어는 랑게르한스의 섬 내에서 일어난다. 이 섬은 단단히 포장 베타 세포의 수천뿐만 아니라 혈관 및 기타 내분비 세포 유형이 포함되어 있습니다. 아일렛이 환경 내의 인슐린 분비에 영향을 당뇨병에 중요한 것으로 예상된다. 따라서, 인슐린 분비의 생리 학적 제어하고 질환의 병태 생리를 이해하기 위해서는 본래 아일렛을 연구하는 것이 필수적이다.

섬 격리

2 형 당뇨병 환자, 특히 인간의 아일렛 라이브 인간 섬과는 얻는 것이 곤란하다. 또한, 인간의 독도 실험 분자 조작에 대한 제한 가능성이 있습니다. 연구원은 그러므로 고용 한동물과 제 2 형 당뇨병 동물 모델에서 할 수 있습니다. 하나는 이러한 질병 모델은 DB / DB 마우스입니다. 이 모델은 밀접하게 인간의 질병 ^5,6 평행 표현형의 진행과 2 형 당뇨병 자발적인 돌연변이입니다. 당뇨병 DB / db 마우스에서 섬의​​ 격리를 위해 여기에 제시된 프로토콜은 더 나은 수율, 정화 및 강화 섬의 생존을위한 몇 가지 정련 다른 그룹과 공통점이 많은 단계가 있습니다.

2 광자 이미징

여기에 설명 된 라이브 셀 2 광자 분석법을 계량 숫자 ^7과 야생형 당뇨병은 ^8,9 아일렛의 많은 세포로부터 인슐린 단일 - 함유 과립의 특성을 평가하기 위해 연구를 가능하게한다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

참고 : 모든 현재 실험 (퀸즐랜드 대학의 해부학 생명 과학 윤리위원회의 승인) 퀸즐랜드 대학의 지역 동물 윤리 절차에 따라 수행되었다.

1. 작은 섬 격리

1. 시약 준비
   1. 효소의 혼합물
      1. 췌장 소화를 들어, liberase과 콜라겐 IV 형의 혼합물을 사용합니다. (써모 낮음) liberase의 TL DMEM 26 ㎖ (둘 베코의 수정 이글 중간) 5 mg을 1 병을 희석.
      2. 된 5mm HEPES가 보충 된 0.5 ㎎ / ㎖의 농도에서 행크 버퍼 콜라게나 제 IV 형을 준비 후 0.5mM 염화칼슘 _2를 0.1 mg / ㎖의 DNase 및 1 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민.
      3. 즉, (체적) 한 TL + 1 ㎖의 콜라게나 제 용액 liberase 4 : 4의 비율로 liberase의 TL과 콜라겐 용액을 섞는다. -20 ℃에서 각각 저장을 2.5ml를 효소의 혼합물 나누어지는.
         참고 : 조직 배양 시간이 v에효소의 배치 사이의 비트 (30 초에 1 분 차이)을 당하고. 따라서, 일괄 테스트가 필요할 수있다.
   2. RPMI 격리 미디어
      1. 실온에서 물 1 L에 RPMI 1640 분말의 한 유리 병을 녹여와 2g의 _NaHCO3, 4.02 G의 HEPES과 보충.
      2. , 자석 교반기로 혼합, 대형 삼각 플라스크에 RPMI 분리 미디어를 결합 NaOH로 pH를 7.4로 조정, 필터는 살균 및 4 ℃에서 저장.
   3. RPMI 문화 미디어
   4. 10 % 소 태아 혈청 및 1 % 항생 물질 (예, 페니실린 100 U / ㎖, 스트렙토 마이신 100 μg의 / ㎖), RPMI 배양 배지를 사용한다.
2. 섬의 분리 및 배양
   1. 동물 희생
      1. 지역 기관의 윤리 절차에 따라 자궁 경부 전위 또는 CO ₂ 질식하여 쥐를 희생. 70 % 에탄올로 충분히 마우스 본체 스프레이.
   2. 췌장 관류
      1. 유측면 복부 피부와 복막을 통해 자체 2 긴 인하 V 자형 플랩을 확인합니다. 전체 복강을 밝히기 위해서 피부 최대의 플랩을 당기고 장을 따로 넣어 담관을 공개 접힌 휴지에 의해 장소에 간 유지 (그림 1, 2). 동물을 넣어 외과 의사 멀리 외과에서 꼬리쪽으로 머리 있도록.
      2. 십이지장 (그림 1)를 입력에서 주입 된 효소를 차단하는 십이지장 벽에 팽대부에서 혈관 클램프를 적용합니다.
         참고 : 주입 된 효소가 췌장 관에 가서 (클램프 이상) 주사 부위에 췌장 또는 역류를 관류 또는 (클램프 아래) 십이지장으로 이동할지 여부는 결정으로이 중요한 단계입니다.
      3. 일반적인 간 덕트 및 담낭 관 (그림 1)의 교차점 근처에 31 G 바늘과 담관을 Cannulate 및 제 주입을위한 공간을 남겨 일 경우즉 췌장은 처음 관류 못한다. 천천히 (이상 ~ 10 초) 마우스 담관에 약 2 ml의 차가운 효소 혼합물의 주입.
         주 : 클램프 우측 위치에있는 경우 췌장 신속 관류한다.
      4. 바늘이 담관 내에 있지만 췌장 관류 할 수없는 경우 (예. 고정 이상의 경우 간에서 조금 떨어진 클램프를 이동하거나 고정 아래의 경우 간으로 조금 아래로 이동) 클램프 위치를 조정합니다.
         주 : 바늘 가끔 둘러싸 캡슐보다는 덕트의 루멘으로 간다. 유용한 기호 담관이 주입 관의 팽창은 내부 바늘이 있는지 여부를 확인한다. 췌장 관류 못하면 대안 효소 혼합물이 예상보다 낮은 수율과 췌장의 여러 부위로 주입 될 수있다. 췌장 (비장 엽)의 왼쪽 사이트의 관류는 섬 수율의 극대화를 위해 중요하다.
      5. 췌장은 P가되면erfused, 신속, 췌장을 제거 유리 병 (~ 20 ㎖, 유리)에 넣고 37 ° C의 물을 욕조에서 ~ 19 분을 품어.
         주 : 배양 시간이 마우스 변형 및 나이에 따라 약간 다를 수 있습니다.
      6. 배양 시간 후, 냉 ~ 분리 매체 20 ㎖를 첨가하여 소화 과정을 정지. 췌장을 방해하고 멸균 50 ㎖ 튜브에 일반 차 체 (1mm의 구멍 직경)를 통해 부어 부드럽게 병을 흔들어. 브레이크 오프 4 ° C에서 1 분 동안 400 XG에 격리 매체와 원심 분리기와 튜브를 최고.
      7. 다시 분리 미디어에서 펠렛을 해산 한 후 브레이크 해제와 함께 4 ℃에서 1 분 동안 400 XG에 원심 분리기,이 15 ml의 튜브에 전송할 수 있습니다. 흡인 뜨는 후, 텍싱 또는 최대 피펫 아래로 튜브 당 밀도 구배 세포 분리 매체의 6 ㎖ (Histopaque 1077 용액)을 잘 두 개의 알약을 섞는다. 부드럽게 위에 튜브의 측면에 격리 매체 ~ 6를 가하여브레이크 오프 4 ° C에서 15 분 동안 100 XG에 밀도 구배 분리 매체와 원심 분리기.
      8. 상단 (격리 미디어)의 상층 액 3 별도의 요리, 중간 및 하부 (밀도 구배 세포 분리 미디어) 레이어를 수집합니다. 해부 현미경 피펫을 사용하여,이 3 요리의 섬을 따다.
         주 : 중간 층이 섬의 대부분을 포함하고 있습니다. 섬의 크기는 ~ 50 μm의 500의 컴팩트 한 구조 (그림 3)으로 인식하고 있습니다. 우리는 (WT) 쥐에 ~ 200 섬과 DB / db 마우스에서 300- <100 섬을 구하십시오.
   3. 섬의 배양
      1. 독도는 37 ℃, 5 %, 효소 소화에서 6ml를 RPMI 배양액 (10 mM이 포도당)와 25cm 배양 접시에 40 섬의 문화 그룹을 복구 할 수 있도록하려면 / 95 % 라이브 전에 2 일간 CO ₂ / O ₂ -cell 2 광자 영상화. 매일 문화 미디어를 변경합니다.

(2). 라이브 셀 2 광자 이미징

1. 시약 준비
   1. 세포 외 버퍼
      1. 140 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을, 2.5 mM의 염화칼슘 _2, 1 mM의의 MgCl _2, 5 mM의 _NaHCO3를 10 mM의 HEPES와 2 광자 분석의 나트륨이 풍부한 세포 외 버퍼를 준비합니다.
   2. 세포 외 염료
      1. 2 광자 분석의 경우, -20 ° C에서 세포 외 버퍼, 나누어지는 작은 튜브에 저장에 스톡 SRB 8 mm로 준비합니다. 0.8 mm의 작업 농도를 얻기 위해 신선한 세포 외 버퍼에 주식 SRB 1:10 희석.
2. 광자 이미징
   1. 먼저, 30 분 동안 3 mM의 글루코오스 외 버퍼에서 2 일간 배양 아일렛 사전 부화.
      참고 : 우리는 문화에 2 오일 사이에 독도를 사용합니다.
   2. 이어서, 현미경 스테이지 상에 열 제어실 상 유리 슬라이드를 배치. 용액의 누출을 방지하기 위해 그리스를 사용합니다.
   3. extracell 500 μL와 챔버 커버다른 포도당 농도 (3 mm의 6 mm의 15 mM의 20 mM의 포도당)와 0.8 mM의 SRB를 포함 울라 버퍼입니다.
   4. 다음에, 챔버의 중앙으로 미리 인큐베이션 아일렛 놓고 설치류 아일렛의 인슐린 면역 염색하여 가장 세포가 베타 세포 인 것을 나타내고, 췌도 세포로 3-4 층에 초점을 맞춘다.
      주 : SRB 신속 아일렛 모든 세포막 윤곽 것이며 아일렛 이미지를 준비한다.
   5. (예., ScanImage ^11). 60X 오일 침지 대물 (NA 1.42) 및 이미징 소프트웨어와 2 광자 현미경을 사용하여 4 현미경 전형적인 배열을 도시한다. 형광으로 막 880 nm에서 펨토초 레이저 펄스에 의해 여기 impermeant 형광 세포 마커로 SRB를 사용하여 이미지 exocytic 이벤트, 550-650 nm에서 검출. 자극에 섬의 응답을 기록합니다.
   6. 작은 형광 자리의 갑작스러운 출현에 의해 단일 ​​exocytic 이벤트를 식별 (해상도 10 픽셀 /1, M)와 관심 영역 (~ 0.78 μm의 ^2)을 통해 형광 신호의 빠른 상승 단계에 의해 확인합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

섬 수율 및 정화

정상적인 야생형 마우스의 200 아일렛이 예상된다. 건강한 섬은 둥근 모양, 밝은 모양과 부드러운 테두리가. 아래의 소화 배치가 적은 섬과 선방 세포 부착 섬 (그림 3)이 때 과열 소화 분리 배치는 일반적으로 작은 퍼지 섬이있다. 더 나은 혈당 마우스 (100) 아래 (반투명 외관과 작은 섬이 악화 혈당 쥐에 비해 (300 섬에) 더 큰, 더 밝고 섬이 당뇨병 D...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

아일렛 분리에 가장 중요한 요인은 췌장의 초기 관류이고; 아래는 상당히 낮은 섬 수율 췌장 결과를 관류. 다른 인자는 또한 소화 시간 부분적 관류의 레벨을 보정 할 수 진탕 레벨로 분리 품질에 영향을 미친다. 예를 들어, 완전히 관류 췌장 부드럽게 진탕하면서 아래에서 췌장 세게 진탕 ~ 20 분 소화가 필요할 수 소화 반대로, 18 분 30 초 ~ 37 ° C에서 배양해야한다. 우리의 손에 두 개의 소화 효소?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liberase TL 5 mg	Roche	-5401020001
Collagenase type IV-1g	Gibco-Life Technologies	17104-019
Histopaque 1077 500 ml	Sigma Aldrich	10771
RPMI 1640 Medium (10x) 1L	Sigma Aldrich	R1383	to prepare isolation media
RPMI 1640 (1x) 500 ml	Gibco-Life Technologies	21870-076	to prepare cultured media
Penicillin-Streptomycin 100 ml	Gibco-Life Technologies	15140-122	to prepare cultured media
Fetal bovine serum 500 ml	Gibco-Life Technologies	10099-141	to prepare cultured media
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco-Life Technologies	11966-025	to dilute the liberase
Metamorph program	Molecular Devices, USA		to analyze the 2-photon images