Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln

Zusammenfassung

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Lepr^db and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Zusammenfassung

Typ 2-Diabetes ist eine chronische Krankheit, die 382 Millionen Menschen im Jahr 2013 und wird voraussichtlich bis zu 592 Mio. im Jahr 2035 ¹ steigen. In den letzten 2 Jahrzehnten die Rolle der Beta-Zell-Dysfunktion bei Typ 2 Diabetes wurde klar festgelegt ^2. Forschung Fortschritte Methoden zur Isolierung von Langerhans-Inseln erforderlich. Das Protokoll der Inselisolierung hier präsentierten viele gemeinsame Schritte mit Protokollen von anderen Gruppen, mit einigen Änderungen, um die Ausbeute und Qualität der isolierten Inseln sowohl aus dem Wildtyp und diabetischen Lepr ^db (db / db) Mäusen zu verbessern. Ein Live-Zelle der 2-Photonen-Abbildungsverfahren wird dann präsentiert, die verwendet werden können, um die Kontrolle der Insulinsekretion in Inseln zu untersuchen.

Einleitung

Die Rolle der Betazelldysfunktion bei Krankheiten ist allgemein anerkannt, ^3,4. Zelllinien, wie der MIN6 und INS-1 sind nützliche Werkzeuge, um die Biologie von Beta-Zell-Verhalten zu verstehen. Allerdings ist die physiologische Kontrolle der Insulinsekretion findet innerhalb der Langerhans-Inseln. Diese Inseln enthalten Tausenden eng gepackten Beta-Zellen, sowie Blutgefäße und anderen endokrinen Zelltypen. Diese Umgebung innerhalb des Insel beeinflusst Insulinsekretion und dürfte bei Diabetes wichtig. Um daher die physiologischen Kontrolle der Insulinsekretion und die Pathophysiologie der Erkrankung zu verstehen, ist es wichtig, intakte Inseln studieren.

Inselisolierung

Live menschlichen Inselchen und insbesondere menschlichen Inselzellen vom Typ 2-Diabetes-Patienten sind schwer zu bekommen. Darüber hinaus haben die menschliche Inselzellen begrenzte Möglichkeiten für experimentelle molekulare Manipulation. Forscher haben daher eingesetztekönnen aus Tieren und Tiermodellen des Typ 2 Diabetes. Ein solcher Krankheitsmodell ist der db / db-Maus. Dies ist eine spontane Mutation, die Models Typ-2-Diabetes mit einem Phänotyp Progression, die menschliche Krankheit ^5,6 eng Parallelen. Die für die Inselisolierung aus diabetischen db / db Mäusen hier vorgestellten Protokoll hat viele Schritte gemeinsam mit anderen Gruppen mit einigen Verfeinerungen für bessere Ausbeute, Reinigung und verbesserte Insellebens.

2 Photonen-Imaging

Die Live-cell 2-Photonen-Assay hier beschriebenen ermöglicht es Forschern, um die Anzahl zu quantifizieren und zu bewerten die Merkmale der einzelnen insulinhaltigen Granulat aus vielen Zellen der diabetischen ⁷ und Wildtyp-Inselchen ^8,9.

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Protokoll

HINWEIS: Alle vorliegenden Experimenten wurden nach den örtlichen Tierethik Verfahren der University of Queensland (von der University of Queensland, Anatomisches Biosciences Ethikkommission genehmigt) durchgeführt.

1. Islet Isolation

1. Vorbereitung der Reagenzien
   1. Enzymgemisch,
      1. Für die Pankreasverdauung, eine Mischung aus Liberase und Collagenase Typ IV. Verdünnen Liberase TL (Thermo niedrig) 1 Fläschchen 5 mg mit 26 ml DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium).
      2. Vorbereitung Collagenase Typ IV in Hanks-Puffer bei einer Konzentration von 0,5 mg / ml, mit 5 mM HEPES, 0,5 mM CaCl _2, 0,1 mg / ml DNAse und 1 mg / ml Rinderserumalbumin.
      3. Mischen den Liberase TL und Collagenase-Lösungen in einem Verhältnis von 4: 1 (nach Volumen), das heißt, 4 ml Liberase TL + 1 ml Kollagenase. Aliquot der Mischung von Enzymen zu jedem und bei -20 ° C 2,5 ml.
         HINWEIS: Die Gewebe Inkubationszeiten vary ein wenig zwischen den Chargen des Enzyms (30 sec bis 1 min-Differenz). Daher kann ein Batch-Test erforderlich.
   2. RPMI Isolation Medien
      1. Lösen Sie eine Phiole mit RPMI 1640-Pulver in 1 l Wasser bei Raumtemperatur und zu ergänzen, mit 2 g NaHCO _3, 4,02 g HEPES.
      2. Kombinieren Sie die RPMI Isolationsmedien in einer großen Erlenmeyerkolben, der mit einem Magnetrührer mischen, auf pH 7,4 mit NaOH, Filter zu sterilisieren und bei 4 ° C.
   3. RPMI Kulturmedien
   4. Verwenden RPMI Kulturmedium, mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Antibiotika (dh, Penicillin 100 U / ml, Streptomycin 100 ug / ml).
2. Islet Isolation und Kultivierung
   1. Tieropfer
      1. Opfern Mäuse durch Genickbruch oder CO ₂ Ersticken nach Ethik Verfahren der lokalen Institution. Sprühen Sie die Maus Körper gründlich mit 70% Ethanol.
   2. Pancreatic Perfusion
      1. Use 2 lange Schnitte seitlich durch die Bauchhaut und Bauchfell, um eine V-förmige Klappe zu machen. Ziehen Sie die Klappe der Haut bis zu den gesamten Bauchraum aufzudecken, beiseite den Darm und die Leber zu halten anstelle von einem gefalteten Seidenpapier, um den Gallengang zu offenbaren (Abbildungen 1 und 2). Setzen Sie das Tier, so dass der Kopf in Richtung der Chirurg und der Schwanz vom Chirurgen.
      2. Anwenden einer Gefäßklemme an der Ampulle an der Wand, um den Zwölffingerdarm injiziert, Enzyme aus der Eingabe in das Duodenum (Figur 1) zu blockieren.
         Hinweis: Dies ist ein wichtiger Schritt, da sie bestimmt, ob die injizierten Enzyme werden in den Pankreasgang gehen und durchströmen die Bauchspeicheldrüse oder Rücklauf auf die Injektionsstelle (über Klemme) oder gehen Sie in den Zwölffingerdarm (unter Klemme).
      3. Kanülieren den Gallengang mit einer 31 G-Nadel in der Nähe der Kreuzung der Ductus hepaticus und cysticus (Abbildung 1) und lassen Raum für eine zweite Injektion, wenn the Pankreas versagt, das erste Mal durchströmen. Langsam (~ 10 sec) zu injizieren etwa 2 ml kaltem Enzymgemisch in die Maus Gallengang.
         ANMERKUNG: Das Pankreas wird schnell perfundiert, wenn sich die Klammer in der richtigen Position ist.
      4. Stellen Sie die Klemmposition, wenn die Nadel in den Gallengang, sondern kann die Bauchspeicheldrüse nicht Perfusion (dh., Nach oben die Klammer ein wenig weg von der Leber, wenn überspannt oder verschieben Sie sie ein wenig nach unten in die Leber, wenn im Rahmen eingespannt).
         HINWEIS: Die Nadel geht manchmal in die umgebende Kapsel eher als das Lumen der Leitung. Eine sinnvolle Zeichen zu überprüfen, ob die Nadel innerhalb der Gallengang ist die Erweiterung des Kanals bei der Injektion. Wenn die Bauchspeicheldrüse nicht zu durchströmen, ist eine Alternative die Enzymmischung konnte auf mehrere Standorte der Bauchspeicheldrüse mit geringeren Ausbeute erwartet injiziert werden. Die Perfusion der linken Seite der Bauchspeicheldrüse (Lobus Splenicus) ist wichtig für die Maximierung der Inselausbeute.
      5. Nachdem der Bauchspeicheldrüse ist perfused, schnell die Bauchspeicheldrüse zu entfernen, legen Sie sie in einem Fläschchen (~ 20 ml Glas) und Inkubation für ~ 19 min in einem 37 ° C Wasserbad.
         HINWEIS: Die Inkubationszeit kann ein wenig abhängig von der Mausstamm und Alter variieren.
      6. Nach der Inkubationszeit, stoppen die Verdauung durch Zugabe von ~ 20 ml kaltem Isolationsmedien. Schütteln Sie die Durchstechflasche vorsichtig, um die Bauchspeicheldrüse zu stören und gießen Sie sie durch eine normale Teesieb (Porendurchmesser von 1 mm) in ein steriles 50 ml Tube. Füllen Sie das Rohr mit Isolierung Medien und Zentrifuge bei 400 xg für 1 min bei 4 ° C mit Bremse ab.
      7. Lösen Sie das Pellet in der Isolierung Medium erneut und übertragen, um zwei 15-ml-Röhrchen, dann bei 400 xg zentrifugieren für 1 min bei 4 ° C mit Bremse ab. Nach dem Absaugen der Überstand, mischen Sie die beiden Pellets auch mit 6 ml Dichtegradient Zellseparationsmedium (Histopaque 1077 Lösung) pro Röhrchen durch Vortexen oder Auf-und Abpipettieren. Dann vorsichtig hinzu ~ 6 ml der Isolierungsmedien zur Seite des Rohres überDer Dichtegradient Trennmedien und zentrifugiert bei 100 g für 15 min bei 4 ° C mit Bremse ausgeschaltet.
      8. Sammeln Sie den Überstand in der oberen (Isolationsmedien), mittleren und unteren (Dichtegradienten Zelltrennmedien) Schicht in 3 separate Küche. Interpreten Sie die Inseln in diesen 3 Gerichte, mit einer Pipette unter einem Binokular.
         HINWEIS: Die mittlere Schicht die meisten der Inseln enthält. Inseln werden als kompakte Strukturen von ~ 50 bis 500 um in der Größe (Figur 3) erkannt wird. Wir erhalten ~ 200 Inseln in WT-Mäusen und 300- <100 Inseln in db / db-Mäusen.
   3. Islet Kultivierung
      1. Um die Inseln zu gewinnen aus dem Enzymverdau Kulturgruppen von 40 Inseln in einer 25 cm Petrischale mit 6 ml RPMI-Kulturmedium (10 mM Glukose) bei 37 ° C, 5% / 95% CO ₂ / O ₂ für ₂ Tage vor der Live -Zelle 2-Photonen-Bildgebung. Ändern Sie den Kulturmedien täglich.

2. Live Cell 2-Photonen-Imaging

1. Vorbereitung der Reagenzien
   1. Extrazelluläre Puffer
      1. Vorbereitung der extrazellulären Natriumpuffer für die 2-Photonen-Assay mit 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl _2, 1 mM MgCl _2, 5 mM NaHCO ₃ und 10 mM HEPES.
   2. Extrazelluläre Dye
      1. Für die 2-Photonen-Test vorbereiten stock SRB 8 mM in extrazellulären Puffer, aliquoten in kleine Rohre und bei -20 ° C. Von der Stamm SRB 1:10 in frischem extrazellulären Puffer auf eine Arbeitskonzentration von 0,8 mm zu erhalten.
2. Photonen-Imaging
   1. Erste, vorge inkubieren 2 Tage kultivierte Inseln in 3 mM Glucose extrazelluläre Puffer für 30 min.
      HINWEIS: Wir verwenden Inselchen zwischen 2 und 5 Tagen in Kultur.
   2. Dann legen Sie eine Objektträger auf die auf dem Mikroskoptisch montiert thermo-Steuerkammer. Verwenden Sie Fett auf das Austreten von Lösung zu verhindern.
   3. Decken Sie die Kammer mit 500 ul extradere Puffer, enthaltend 0,8 mM SRB mit unterschiedlichen Glukosekonzentrationen (3 mm, 6 mm, 15 mm und 20 mM Glucose).
   4. Als nächstes legen Sie die vorinkubierten kleine Insel in der Mitte der Kammer und konzentrieren sich auf 3-4 Zellschichten in der kleinen Insel, wo, in Nagetier Inselchen, Immunfärbung für Insulin zeigt, dass die meisten Zellen sind beta-Zellen.
      HINWEIS: Die SRB alle die Zellmembran der Insel schnell zu skizzieren und die kleine Insel ist bereit, image.
   5. Verwenden Sie eine 2-Photonen-Mikroskop mit einem 60x Ölimmersionsobjektiv (NA 1,42) und Imaging-Software (z. B. scanimage ^11). Abbildung 4 zeigt eine typische Anordnung Mikroskopie. Bild Exozytose-Ereignisse mit SRB als Membran impermeante Fluoreszenzextrazellulären Marker durch Femtosekundenlaserpulsen bei 880 nm angeregt, mit Fluoreszenz bei 550-650 nm detektiert. Notieren Sie die Antworten auf die Insel Stimulation.
   6. Identifizieren Sie einzelne Exozytose-Ereignisse durch das plötzliche Erscheinen eines kleinen fluoreszierenden Flecks (Auflösung 10 Pixel /1, m) und bestätigen Sie mit der schnell ansteigenden Phase des Fluoreszenzsignals über einen Bereich von Interesse (~ 0,78 um ^2).

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Ergebnisse

Islet Ausbeute und Reinigung

Für eine normale Wildtyp-Maus, werden etwa 200 kleine Inseln erwartet. Gesunde Inseln aussehen hell, rund geformt und haben einen glatten Rand. Eine Über verdaut Isolierung Charge hat in der Regel klein und Fuzzy-Inseln, während ein Unter verdaut Charge hat weniger kleine Inseln und Inselchen Azinuszelltumoren angebracht (Abbildung 3). Für diabetischen db / db-Mäuse, die kleine Insel Ausbeute und Aussehen abhängig von der Krankheitsprogress...

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Diskussion

Der wichtigste Faktor für die Inselisolierung ist die anfängliche Durchblutung des Pankreas; ein unter perfundierten Pankreas führt zu einem erheblich niedrigeren Inselausbeute. Andere Faktoren, die auch Auswirkungen auf die Isolierung Qualität wie die Aufschlusszeit und der Höhe der Erschütterung, die teilweise für die Höhe der Durchblutung zu kompensieren könnte. Zum Beispiel wird ein voll durchströmten Bauchspeicheldrüse müssen bei 37 ° C für ~ 18 min 30 sec inkubiert werden unter leichtem Schütteln im...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liberase TL 5 mg	Roche	-5401020001
Collagenase type IV-1g	Gibco-Life Technologies	17104-019
Histopaque 1077 500 ml	Sigma Aldrich	10771
RPMI 1640 Medium (10x) 1L	Sigma Aldrich	R1383	to prepare isolation media
RPMI 1640 (1x) 500 ml	Gibco-Life Technologies	21870-076	to prepare cultured media
Penicillin-Streptomycin 100 ml	Gibco-Life Technologies	15140-122	to prepare cultured media
Fetal bovine serum 500 ml	Gibco-Life Technologies	10099-141	to prepare cultured media
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco-Life Technologies	11966-025	to dilute the liberase
Metamorph program	Molecular Devices, USA		to analyze the 2-photon images