المناعية لتصور الفئران المعوية العصبي تطوير النظام

Summary

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.

Abstract

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.

Introduction

ويعمل الجهاز العصبي المعوي (ENS) التي تسيطر على الحركة، وامتصاص المواد الغذائية، وتدفق الدم المحلي، أمر ضروري في الحياة ^1. يتم تشكيل ENS من قبل خلايا قمة العصبية (NCC) التي تتكاثر، الهجرة واستعمار القناة الهضمية، حيث تفرق في العقد تحتوي على الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. مرض هيرشسبرونغ (HSCR، الانترنت وراثة مندلية في مان)، وهو اضطراب خلقي multigeneic مع حدوث 1 في 4000 ولادة حية، يمكن اعتبار المرض prototypic لدراسة تشكيل ENS تعطلت. في HSCR، NCC تفشل في الهجرة إلى استعمار وأطوال مختلفة بين المعى المؤخر القاصي ^2. بالإضافة إلى ذلك، ترتبط الجهاز الهضمي المشتركة الأخرى (GI) وجود عيوب التنموية في عدد من الأطفال، مثل التشوهات الشرجية، atresias المعوية، واضطرابات الحركة مع اضطرابات في وظائف ENS الأساسية، وعلى الأرجح يرتبط خفية، لا تقدر حق قدرها، والتغيرات التشريحية وتغييرات وظيفية في^3-6 ENS. لذلك، قد التقنيات التي تسمح لنا لفهم المحددات التنموية لتشكيل ENS تسليط الضوء على المرضية والعلاج المحتملة للاضطرابات الجهاز الهضمي للأطفال.

وبعد الهجرة والاستعمار، NCC يفرق في الخلايا العصبية مع علامات محددة لالنمط الظاهري العصبي بهم. تتكون الخلايا العصبية كوليني ما يقرب من 60٪ من الخلايا العصبية المعوية ^7، ويمكن الكشف عنها بواسطة تلطيخ للأسيتيل كولين (الدردشة)، الانزيم توليف لالناقل العصبي الأسيتيل كولين مثير. تاريخيا، يحاول تصور ومرتبك الخلايا العصبية الكوليني التي كتبها اختلاف مستضد خصوصية الأجسام المضادة الموجهة ضد النظام العصبي المركزي (CNS) دردشة مقابل الجهاز العصبي المحيطي (السندات الإذنية) دردشة ^8-10. ومع ذلك، الأجسام المضادة الموجهة ضد المشيمة دردشة تعترف كل من دردشة المركزية والطرفية ^11-13، ولدينا تقنيات وصفها مؤخرا التي تسمح للvisualization من ENS الخلايا العصبية الكوليني مع حساسية عالية في التنمية في وقت سابق من تحقق مع خطوط مراسل دردشة ^14.

هنا، نقدم تقنية لتشريح، وتحديد والمناعية من الفئران الجنينية GI الجهاز لتصور ENS العصبي التعبير في الخلايا العصبية. لهذه الدراسات، ولقد استخدمت الفئران دردشة لجنة المساواة العرقية تزاوج مع R26R: الحيوانات tdTomato لإنتاج دردشة لجنة المساواة العرقية؛ R26R: floxSTOP الفئران tdTomato (كما هو موضح دردشة لجنة المساواة العرقية tdTomato في جميع أنحاء المخطوط): floxSTOP. ثم تم تزاوج هذه الحيوانات مع متماثل الفئران مراسل دردشة GFP، للحصول على الفئران التعبير عن كل صحفيين الفلورسنت التي تكشف عن التعبير دردشة ^14. هذه الحيوانات مراسل هما على خلفية C57BL / 6J ومتاحة تجاريا (مختبرات جاكسون، بار هاربور، ME).

Protocol

وافقت جامعة ويسكونسن رعاية الحيوان واستخدام اللجنة كافة الإجراءات.

1. إعداد حلول

1. استخدام 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) كما عازلة تشريح وحل الشطف.
2. إعداد 30٪ سكروز عن طريق وزن 30 غرام من السكروز ومكان في زجاجة. إضافة 99 مل من برنامج تلفزيوني 1X وإضافة 1 مل 10٪ أزيد الصوديوم. تخلط جيدا حتى يذوب كل من السكروز. تخزينها في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة.
3. إعداد عرقلة الحل عن طريق خلط 1X PBS، 3٪ ألبومين المصل البقري (BSA) و 0.1٪ تريتون-X-100. تخلط جيدا وتخزينها في الثلاجة لحين الحاجة إليها.
4. إعداد 8٪ امتصاص العرق (PFA) حل في برنامج تلفزيوني 1X عن طريق وزن كمية مناسبة من PFA في برنامج تلفزيوني 1X ثم احتضان عند 65 درجة مئوية حتى يذوب تماما. متجر في 25 مل قسامات في -20 ° C الفريزر لحين الحاجة إليها. تمييع إلى 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني 1X في يوم من الاستخدام.

2. الأجنة والوتر تشريحأيون

1. وفقا لرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة وافقت البروتوكولات، الموت ببطء توقيت الماوس الحوامل ونقل الرحم إلى 60 مم طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X.
2. تحت المجهر تشريح باستخدام مقص حاد، وقطع جدار الرحم مفتوح لفضح الأجنة. إزالة الأجنة من الرحم والمكان إلى بيئة نظيفة 60 مم طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X.
3. الموت ببطء كل ​​الجنين عن طريق قطع الرأس في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X. إذا كنت تستخدم الفئران المعدلة وراثيا تحتوي على البروتينات الفلورية، تحت إضاءة مضان، وتحديد الأجنة وراثيا إيجابية.
4. تشريح الجهاز الهضمي من كل جنين باستخدام مجهر تشريح. باستخدام ملقط غرامة، توجيه الجنين مثل أن الجانب الأيسر ومتجهة لأعلى وعلى الجانب الأيمن هو ضد الجزء السفلي من طبق بيتري. إزالة جدار الجزء العلوي من الجسم من الجنين لفضح الأعضاء الداخلية. إدراج ملقط غرامة بين جدار الجسم الظهري والأعضاء الداخلية. كرتابعنا ملقط ضد بعضها البعض في عمل قطع مثل مقص لإزالة الأعضاء الداخلية من الجنين.
5. مزيد من دون تشريح الجهاز الهضمي بعيدا عن الأجهزة المحيطة ومن ثم وضع كل الجهاز الهضمي في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل تحتوي على الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X.

3. تثبيت للGI شيتاغونغ

1. شطف كل الجهاز الهضمي 3 مرات مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني 1X ثم قم باستبدال مع 4٪ PFA. إصلاح مساحات GI في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge على منصة هزاز في RT لمدة 1.5 ساعة. شطف مساحات GI 3 مرات لمدة 5 دقائق على RT ثم لمدة 1 ساعة على منصة هزاز. في هذه المرحلة، وتخزين مساحات GI في 4 ° C في 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 0.1٪ أزيد الصوديوم لحين الحاجة إليها.
   ملاحظة: بدلا من ذلك، تخزين الأجنة في 30٪ سكروز لمدة تصل إلى واحد من دون أي تأثير على سلامة الأنسجة. تخزين العينات في 30٪ سكروز يسمح معالجة لاحق من العينات إما لالمناعية أو إلى أكتوبر لالبرد sectioniنانوغرام. بدلا من ذلك، المضي قدما في بروتوكول المناعية المفصلة أدناه.

4. بروتوكول المناعية

1. إذا تم تخزينها العينات في 30٪ سكروز، شطف لهم 3 مرات لمدة 20 دقيقة في برنامج تلفزيوني 1X على منصة هزاز.
2. وضع مساحات GI إلى عرقلة الحل على منصة هزاز ل1H في RT.
3. إزالة حل الحجب واحتضان مساحات GI مع كمية مناسبة من الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة الحل إما 4 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجات مئوية على منصة هزاز. استخدام 1: 1000 تخفيف البشرية الأضداد المضادة هو جين تاو (المصل تم الحصول عليها من المريض)، 1: 1000 تخفيف من الدجاج مكافحة الأخضر بروتين فلوري (GFP) الأجسام المضادة و 1: 100 التخفيف من الماعز الأجسام المضادة لمكافحة الدردشة.
   ملاحظة: علينا الاستفادة من الأجسام المضادة لمكافحة البشري هو جين تاو التي تم الحصول عليها محليا من المريض، ومع ذلك، هي أضداد هو جين تاو المتاحة تجاريا، على سبيل المثال، والماوس المضادة للهو جين تاو، (استخدام في 1: 500 تمييع).
4. شطف مساحات GI في برنامج تلفزيوني 1X3 مرات لمدة 5 دقائق ثم لمدة 1 ساعة على RT على منصة هزاز.
5. استبدال برنامج تلفزيوني 1X مع الأجسام المضادة الثانوية المخفف 1: 500 في عرقلة الحل على منصة هزاز إما 4 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجات مئوية. استخدام حمار مكافحة الإنسان وأمين صبغ رد الفعل مثل Dylight، حمار Cy2 مكافحة الدجاج وحمار المضادة للماعز Cy5. إذا باستخدام الماوس المضادة للهو الضد ثم استخدم 1: 500 التخفيف من حمار مكافحة الماوس أمين صبغ رد الفعل 405.
   ملاحظة: كثافة GFP الذاتية وtdTomato التعبير ووضوح المناعية الزيادة مع التقدم في العمر التنموي. نحن immunostain عادة الشجاعة الجنينية بشكل فردي في 0.2 مل الأنابيب مع 150 ميكرولتر من الحل تلطيخ من أجل الحد من حجم الأجسام المضادة المستخدمة وأيضا لضمان كفاءة تلطيخ من الأنسجة.
6. شطف مساحات GI في برنامج تلفزيوني 1X 3 مرات لمدة 5 دقائق ثم لمدة 1 ساعة على RT على منصة هزاز.
7. ضع بضع قطرات من مضان تصاعد المتوسطة مع دابي على شريحة زجاجية. تزج هيئة تنظيم الاتصالات GIط م في المتوسط ​​مضان تركيب وإضافة غطاء زجاجي مباشرة على الجزء العلوي من الأنسجة. مضان تصاعد -G المتوسطة هو مركب للذوبان في الماء الذي يوفر ختم شبه دائم.
   ملاحظة: استخدام مضان المتوسطة المتزايدة مثل Vectashield وهو الجلسرين المستندة إلى تصاعد المتوسط ​​الذي يمنع يتلاشى وphotobleaching من الأجسام المضادة. كل من هذه المنتجات تمكين الأنسجة ليتم تخزينها لفترات طويلة من الزمن في 4 ° C.
8. التقاط الصور من كل من fluorophore باستخدام مجهر متحد البؤر. استخدام موجات الإثارة لfluorophores والفلاتر المستخدمة الواردة في الجدول 3.
9. لتحليل صورة بمساعدة الكمبيوتر باستخدام البرمجيات المناسبة تبعا لنوع من متحد البؤر استخدامها لالتقاط الصور.

النتائج

وصفناها سابقا جيل من الفئران التعبير عن كل GFP وtdTomato للصحفيين الفلورسنت التي تكشف عن التعبير دردشة ^14. باختصار، كانت تزاوج الفئران دردشة لجنة المساواة العرقية مع R26R: floxSTOP: الحيوانات tdTomato لإنتاج دردشة لجنة المساواة العرقية؛ R26R: الفئران tdTomato

Discussion

وقد أظهرت مختبرنا وغيرها من الجهات التي عيوب المعوية في HSCR لا تقتصر على القولون بانعدام العقد ولكن تمديد قريب، حتى في الأمعاء الدقيقة عقدي ^5،15،16. وتشمل هذه التغيرات تغيرات في الخلايا العصبية ENS الكثافة والعصبي النمط الظاهري وربما تمثل dysmotility التي لوحظت في المرض...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	Oxoid	BR0014G
Sucrose	Fisher	S2
Sodium azide	Fisher	BP9221
Bovine serum albumin	Fisher	BP1605
Triton X-100	Sigma	X100
Paraformaldehyde	Sigma	158127
60 mm Petri dishes	Fisher	FB0875713A
Fluorescence microscope	Nikon	SMZ-18 stereoscope
Dissection microscope	Nikon	SMZ-18 stereoscope
Fine forceps	Fine science tools	11252-20
1.5 ml Eppendorf tubes	VWR	20170-038
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, AL	0100-01
Glass slides	Fisher	12-550-15
Cover glass	VWR	16004-330
Confocal microscope	Nikon	Nikon A1
Nikon Elements	Nikon