Иммуноокрашивание визуализировать нервную развития системы мышиный Кишечная

Резюме

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.

Аннотация

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.

Введение

Кишечная функционирует нервная система (ENS), которая контролирует моторику, всасывание питательных веществ, и местный кровоток, имеет важное значение для жизни ^1. ЭНС формируется клеток нервного гребня (НКЦ), которые пролиферируют, мигрируют и колонизировать кишечник, где они дифференцироваться в ганглиев содержащих нейронов и глиальных клеток. Болезнь Гиршпрунга (HSCR, Интернет Законы Менделя в человеке), multigeneic врожденный порок с частотой 1 в 4000 живорожденных, можно считать прототипом для изучения болезни нарушенного образование ENS. В HSCR, НКК не мигрируют и колонизировать переменной длины дистального кишки ^2. Кроме того, другие общие желудочно (GI) пороки развития в педиатрической популяции, такие как аноректальной пороками развития, кишечных atresias и нарушений моторики связаны с нарушениями в основных функций ENS, и, вероятно, связано с тонкими, недооцененных, анатомических изменений и функциональных изменений вENS ^3-6. Таким образом, методы, которые позволяют нам понять детерминанты развития образования ENS может пролить свет на патогенез и потенциального лечения расстройств желудочно-кишечного тракта у детей.

После миграции и колонизации, НКК дифференцируется в нейроны с маркеров, специфических для их фенотипа нейромедиатора. Холинергических нейронов содержат приблизительно 60% кишечных нейронов ^7, и могут быть обнаружены путем окрашивания по холинацетилтрансферазы (ХАТ), синтезирующего фермента на возбуждающий нейротрансмиттер ацетилхолин. Исторически, попытки визуализировать холинергические нейроны смешивать с различной антигенной специфичности антител, направленных против центральной нервной системы (ЦНС) ХАТ в сравнении периферической нервной системы (ПНС) ХАТ ^8-10. Тем не менее, антитела, направленные против плаценты ChAT признать как центральную и периферическую Чат ^11-13, и мы в последнее время описанные методы, которые позволяют visuaлизация из ENS холинергических нейронов с высокой чувствительностью ранее в развитии чем была достигнута с чатом репортер линий ^14.

Здесь мы представляем технику для рассечения, фиксация и иммунное мышиного эмбрионального желудочно-кишечного тракта для визуализации выражение нейромедиатора ENS в нейронах. Для этих исследований, мы использовали мышей Чат CRE повязана с R26R: floxSTOP: tdTomato животных для производства Чат Cre; R26R: floxSTOP: tdTomato мышей (определенные как чат-Cre tdTomato всей рукописи). Эти животные были затем скрещивали с гомозиготных Чат-GFP репортер мышей, чтобы получить мышей, экспрессирующих обе флуоресцентные журналистам, что обнаружить ChAT выражение ^14. Эти два репортер животные на линии C57BL / 6J фоне и коммерчески доступны (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).

протокол

Университет Висконсина уходу и использованию животных комитета утвердил все процедуры.

1. Подготовка решений

1. Использование 1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) в качестве буфера рассечение и промывки раствором.
2. Подготовка 30% сахарозы путем взвешивания 30 г сахарозы и место в бутылку. Добавить 99 мл 1x PBS и добавить 1 мл 10% азид натрия. Тщательно перемешать, пока все сахарозы не растворится. Хранить при 4 ° С до использования.
3. Подготовьте Блокирующий раствор путем смешивания 1X PBS, 3% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,1% Тритон-X-100. Тщательно перемешать и хранить в холодильнике, пока не понадобится.
4. Подготовка 8% параформальдегида (PFA) раствор в 1x PBS путем взвешивания соответствующего количества PFA в 1x PBS, а затем инкубировали при 65 ° С до тех пор, пока полностью не растворится. Магазин в 25 мл аликвотах в -20 ° C морозильнике до использования. Развести до 4% PFA в 1x PBS на день использования.

2. Эмбрион и Гут Рассекитеион

1. В соответствии с институциональной уходу и использованию животных комитета утвержден протоколы, усыпить приуроченный беременную мышь и перенести в матку в 60 мм чашки Петри, содержащей ледяной 1x PBS.
2. Под микроскопом рассечение, используя острые ножницы, разрезать стенки матки открытый, чтобы выставить эмбрионов. Удалить эмбрионов из матки и место в чистой 60 мм чашки Петри, содержащей ледяной холод 1x PBS.
3. Эвтаназии каждый эмбрион, обезглавливание в ледяной 1x PBS. Если вы используете трансгенных мышей, содержащих флуоресцентные белки, под флуоресцентной подсветкой, определить положительные трансгенные эмбрионы.
4. Рассеките желудочно-кишечного тракта от каждого эмбриона с использованием рассечение микроскоп. Использование тонких щипцов, ориентироваться эмбрион таким образом, что левая сторона стороной вверх и правой стороне на дно чашки Петри. Снимите верхнюю стенку тела из эмбрионов, чтобы выставить внутренние органы. Вставьте тонкий пинцет между спинной стенке тела и внутренних органов. Crуги щипцы друг против друга в ножницеобразный, как режущего действия, чтобы удалить внутренние органы от эмбриона.
5. Кроме того суб-рассекать желудочно-кишечного тракта от окружающих органов, а затем поместить каждый желудочно-кишечного тракта в 1,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую ледяной 1X PBS.

3. Фиксация GI урочища

1. Промыть каждый желудочно-кишечного тракта 3 раза охлажденным на льду PBS 1x, а затем заменить 4% PFA. Закрепите GI участки в 1,5 мл микропробирок на качающейся платформе при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Промыть желудочно-трактов 3 раза в течение 5 мин при комнатной температуре, а затем в течение 1 часа на качалке платформы. На этой стадии, сохранять GI тракт при 4 ° С в 30% сахарозы в 1x PBS, содержащим 0,1% азида натрия до тех пор, пока это необходимо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, хранения эмбрионов в 30% сахарозы в течение до одного года без какого-либо влияния на целостность тканей. Хранение образцов в 30% сахарозы позволяет последующую обработку образцов либо для иммунным или в октябре для крио-sectioniнг. Кроме того, приступить к протоколу иммуноокрашивания подробно ниже.

4. Протокол Иммуноокрашивание

1. Если образцы были сохранены в 30% сахарозы, промыть их 3 раза в течение 20 мин в PBS 1x на платформе-качалке.
2. Поместите GI участки в блокировании решения на качающейся платформе в течение 1 часа при комнатной температуре.
3. Удалить блокирующий раствор и инкубировать GI тракт с соответствующим количеством первичных антител разводят в блокирующем растворе для любой 4 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С на ротационном платформы. Использование 1: 1000 разбавление человеческого анти-антитела (Hu сыворотки, полученной от пациента), 1: 1000 разбавление куриного анти-зеленого флуоресцентного белка (GFP) антитела и 1: 100 разбавление козьего анти-ХАТ антитела.
   Примечание: Мы используем человеческого анти-Hu антитело, которое было получено локально от пациента, однако, анти-Hu антитела коммерчески доступны, например, мышиное анти-Hu, (использование при 1: 500 разбавлении).
4. Промыть GI участки в 1x PBS3 раза в течение 5 мин и затем в течение 1 часа при комнатной температуре на ротационном платформы.
5. Заменить 1X PBS с помощью вторичных антител, разведенных 1: 500 в блокирующем растворе на платформе-качалке для любой 4 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С. Использование осла против человеческого амина-реактивный краситель, такой как DyLight, осла против ветряной су2 и осла против козьего Cy5. При использовании мышиное анти-Ху антитела затем используют в разведении 1: 500 осла против мышиного амина-реактивный краситель 405.
   ПРИМЕЧАНИЕ: интенсивность эндогенного GFP и выражения tdTomato и ясности иммуноокрашивания увеличение с возрастом развития. Как правило, мы immunostain эмбриональных кишки индивидуально в 0,2 мл пробирки с 150 мкл окрашивающего раствора, чтобы уменьшить объем используемого антитела, а также обеспечить эффективное окрашивание ткани.
6. Промыть GI тракт в 1X PBS 3 раза в течение 5 мин и затем в течение 1 часа при комнатной температуре на ротационном платформы.
7. Поместите несколько капель флуоресценции монтажа среде с DAPI на предметное стекло. Погрузите GI траКТ в монтажной флуоресценции среды и добавить покровное стекло непосредственно на ткани. Флуоресценции монтажа средней -G является водорастворимым соединением, которое обеспечивает полупостоянного уплотнение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте флуоресценции монтажа носитель, например Vectashield что глицерин основе монтажа среду, предотвращающую выцветания и фотообесцвечивание антител. Оба из этих продуктов позволит ткани должны храниться в течение длительных периодов времени при 4 ° С.
8. Захват изображения каждого из флуорофора с помощью конфокальной микроскопии. Используйте для длин волн возбуждения флуорофоров и фильтров, используемых, представленных в таблице 3.
9. Выполнить анализ изображения с помощью компьютера, используя соответствующее программное обеспечение в зависимости от типа используемого конфокальной захвата изображений.

Результаты

Ранее мы уже описали поколение мышей, экспрессирующих GFP оба и tdTomato флуоресцентные журналистам, что обнаружить ChAT выражение ^14. Вкратце, мышей Чат-Cre были скрещены с R26R: floxSTOP: tdTomato животных для производства Чат Cre; R26R: floxSTOP: tdTomato мышей (так называемые чат-Cre tdTomato). Эти...

Обсуждение

В нашей лаборатории и другие показали, что кишечные дефекты HSCR не ограничивается aganglionic толстой кишки, но распространяется в проксимальном направлении, даже в тонком кишечнике узловатый ^5,15,16. Эти изменения включают изменения в ENS фенотипа нейронов плотности и нейромедиаторов и м?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	Oxoid	BR0014G
Sucrose	Fisher	S2
Sodium azide	Fisher	BP9221
Bovine serum albumin	Fisher	BP1605
Triton X-100	Sigma	X100
Paraformaldehyde	Sigma	158127
60 mm Petri dishes	Fisher	FB0875713A
Fluorescence microscope	Nikon	SMZ-18 stereoscope
Dissection microscope	Nikon	SMZ-18 stereoscope
Fine forceps	Fine science tools	11252-20
1.5 ml Eppendorf tubes	VWR	20170-038
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, AL	0100-01
Glass slides	Fisher	12-550-15
Cover glass	VWR	16004-330
Confocal microscope	Nikon	Nikon A1
Nikon Elements	Nikon