وصفها والفيروسية بوساطة زرع الإنسي العقدية سماحة (MGE) خلايا ل<em&gt; في فيفو</em&gt; دراسات

Summary

GABAergic الأسلاف عصبون القشرية تفريق وتطوير وsynaptically الاندماج في القشرة المضيف بعد الزرع. هذه الخلايا يمكن transduced بسهولة قبل الزرع لفي الدراسات المجراة السلائف GABAergic المعدلة وراثيا. هنا، وتبين لنا تقنيات وضع العلامات الفيروسية لاستهداف مجموعات فرعية عصبون محددة باستخدام خطوط جنة المساواة العرقية القائمة وصحفيين لجنة المساواة العرقية التي تعتمد على.

Abstract

GABAergic interneurons القشرية، والمستمدة من الإنسي الجنينية والفضيلة العقدية الذيلية (MGE وفريق الخبراء الاستشاري)، وظيفيا ومتنوعة شكليا. من إحراز تقدم في فهم أدوار متميزة مجموعات فرعية عصبون القشرية، ومع ذلك، لا يزال هناك العديد من الآليات التي عملت بها التي قد تسهم في تطوير ونضوج أنواع مختلفة من الخلايا GABAergic. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تسهم تغيير GABAergic يشير إلى الظواهر التوحد والفصام والصرع. وقد بدأت لجنة المساواة العرقية خطوط سائق محددة للا يتجزأ من مهام فرعية عصبون فريدة من نوعها. وعلى الرغم من التقدم في نماذج الماوس، غالبا ما يكون من الصعب دراسة GABAergic الأسلاف عصبون القشرية بكفاءة مع النهج الجزيئية في الجسم الحي. أسلوب واحد الهامة المستخدمة لدراسة الخلية البرمجة مستقلة من هذه الخلايا هي زرع الخلايا MGE إلى القشور المضيف. هذه الخلايا المزروعة تهاجر على نطاق واسع، تمييز، وهوالثانية دمج وظيفيا. وبالإضافة إلى ذلك، وخلايا MGE يمكن transduced بكفاءة مع الفيروسة البطيئة السابقة على الفور لزراعة الأعضاء، مما يسمح للعديد من الأساليب الجزيئية. نحن هنا بالتفصيل بروتوكول لتنبيغ الخلايا MGE بكفاءة قبل زرع في الجسم الحي التحليل، وذلك باستخدام خطوط جنة المساواة العرقية سائق المتاحة وناقلات التعبير لجنة المساواة العرقية التي تعتمد على. هذا النهج هو مفيد لأنه يجمع بين التلاعب الجيني الدقيق مع قدرة هذه الخلايا لتفريق بعد الزرع، والسماح بمزيد من قرار معين الخلية من نوع في الجسم الحي.

Introduction

تشمل GABAergic interneurons القشرية ~ 20-30٪ من الخلايا العصبية في القشرة المخية الحديثة الثدييات، في حين أن بقية تتوافق مع مثير، الخلايا العصبية الرئيسية glutamatergic. Interneurons ومتنوعة للغاية في الخصائص الكهربية، محور عصبي والتغصنات التشكل ومتشابك استهداف ^1، وافترض الاختلالات في مثير لهجة / المثبطة لتكمن وراء بعض الظواهر من الاضطرابات العصبية والنفسية / العصبية بما في ذلك مرض التوحد والفصام والصرع ^2. الهدف العام للبروتوكول الموصوفة هنا هو توفير وسيلة لتعديل بكفاءة وراثيا GABAergic الأسلاف عصبون القشرية قبل زرع في الجسم الحي التحليلات.

ولدت interneurons القشرية GABAergic في الفضيلة العقدية وسطي والذيلية (MGE وفريق الخبراء الاستشاري، على التوالي) ^3،4 وكذلك الباحة أمام البصرية ^5. الأسلاف عصبون القشرية تخضع جاءت لمسافات طويلة الهجرة عرضيةالهجرة شعاعي للوصول إلى الأهداف النهائية. لدى وصولهم إلى وجهاتهم، يجب هذه interneurons القشرية تدمج بشكل صحيح في شبكة الخلايا العصبية الموجودة، وسيكون على كل عصبون فرعية فريدة تسهم في الدوائر القشرية بطرق محددة. أربع مجموعات فرعية رئيسية يمكن تمييزها بواسطة الواسمات الجزيئية: السوماتوستاتين MGE المشتقة (SST) ⁺ وparvalbumin (PV) ⁺ مجموعات فرعية، وفريق الخبراء الاستشاري المستمدة من الببتيد المعوي الفعال في الأوعية (VIP) ⁺ وريلين reelin ^+. SST ^- مجموعات فرعية ^6. ولدت مختلفة مجموعات فرعية عصبون القشرية على أوقات مختلفة أثناء التطور الجنيني في MGE وفريق الخبراء الاستشاري ^{7 و 8.} وقد استخدمت هذه وغيرها من القشرية GABAergic علامات عصبون لتوليد خطوط جنة المساواة العرقية سائق محددة للعديد من هذه المجموعات الفرعية ^9-11.

برزت زرع الأسلاف MGE كعلاج خلية القاعدة المحتملة لعلاج الاضطرابات التي قد تكون ناجمة عن اختلال التوازنفي الإثارة / تثبيط ^{12 - 24.} قد تكون هذه الفوائد العلاجية يرجع ذلك جزئيا إلى قدرة فريدة من الأسلاف MGE (لتفريق، التفريق والاندماج في الدماغ المضيف)، أو يحتمل أن تكون لأنه يتم الحصول العديد من شبه جسدية PV المثبطة ⁺ الخلايا من MGE. خلايا MGE يمكن أن يكون أيضا بسرعة وكفاءة transduced مع lentiviruses قبل زرع ^15، مما يسمح للخلايا التي يتم تعديلها وراثيا في المختبر ليتم دراستها في الجسم الحي. كان المبرر لتطوير هذا النهج للتغلب على الحواجز في دراسة GABAergic تطوير عصبون القشرية والنضج. على وجه الخصوص، يسمح زرع MGE الباحثين لدراسة تطوير خلايا متحولة في الجسم الحي، عندما الماوس متحولة، لولا ذلك لقوا حتفهم في نقطة الوقت المبكر. وعلاوة على ذلك، من خلال إدخال جينات من الفائدة قبل الزرع، يمكن تقييم آثار جينات معينة على النمط الظاهري متحولة في المؤسسة فكرةالطريقة icient.

هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصلة لتنبيغ الخلايا MGE مع lentiviruses قبل الزرع. وبالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا كيف يمكن تكييف هذه التقنية للتعبير عن الجينات في المصالح في مجموعات فرعية عصبون محددة من مجموعة غير متجانسة من السلائف عصبون القشرية، وذلك باستخدام مزيج من lentiviruses التعبير لجنة المساواة العرقية التي تعتمد على والمتاحة خطوط الماوس لجنة المساواة العرقية سائق. وعلاوة على ذلك، فإن هذا البروتوكول يقدم تقنيات ومنبرا للباحثين لتعديل وراثيا GABAergic السلائف عصبون القشرية لفي الدراسات المجراة بطريقة فريدة من نوعها. ميزة واحدة من هذه التقنية على النهج الحالية الأخرى هي أن الخلايا المزروعة MGE سوف تفريق بعيدا عن موقع الحقن. أيضا، على عكس الحقن الفيروسية التنسيق، بعد تفريق خلايا MGE التشكل هو أسهل لتقييم. هذا النهج يمكن أن تستخدم لدراسة تأثير إدخال جينات من الفائدة في النوع البري أو خلايا متحولة، وإدخال نوع من الخلايا المحددةمراسل لتقييم التشكل، أو يحتمل أن تكون لدراسة تأثير الأليلات المرض في الجسم الحي.

Protocol

بيان الأخلاق: وقد تمت الموافقة على الإجراءات التالية لدينا من قبل المؤسسة والحيوان البروتوكول. تأكد من الحصول على موافقة لجميع الإجراءات التي تنطوي على عملية جراحية البقاء على قيد الحياة قبل بداية التجارب والتحقق من جميع البروتوكولات هي حتى الآن.

1. إعداد الفيروسة البطيئة (خطوة اختيارية)

1. تقسيم ثلاثة 10 سم لوحات الخلايا HEK293T لكل الفيروسة البطيئة يتعين القيام بها، في ظل وجود 10 مل DMEM / 10٪ FBS، وتنمو إلى ~ 60-70٪ التقاء. تنمو الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2.
2. بالنقل البلازميدات التالية DNA (10 ميكروغرام الكل) في كل لوحة باستخدام أي كاشف ترنسفكأيشن: 6.4 ميكروغرام CAG-فليكس GFP ناقلات lentiviral (تسلسل الحمض النووي ناقلات المنصوص عليها في الجدول رقم 1)، و 1.2 ميكروغرام pMD2.G (بترميز VSV-ز)، 1.2 ميكروغرام pRSV-القس، و 1.2 ميكروغرام pMDLg / pRRE. هي ناقلات التعبئة والتغليف lentiviral الثلاثة المتاحة تجاريا (الجدول
   ملاحظة: هذا نهج معين يستخدم الجيل 3 lentivirسوف ناقلات القاعدة لكن ناقلات 2nd جيل والبلازميدات المرتبطة بها تعمل أيضا.
3. إعداد حاوية النفايات التي تحتوي على محلول التبييض 10٪ ضمن BSL2 شهادة غطاء محرك السيارة لتعطيل أي حلول أو الأجهزة التي اتصلت أو تحتوي على الفيروسة البطيئة. وبعد ذلك، إزالة وسائل الإعلام 4-6 ساعة بعد ترنسفكأيشن في محلول التبييض، مع استبدال نفس الحجم من وسائل الإعلام الجديدة، والسماح للخلايا أن تنمو.
4. بعد 4 أيام، وجمع وسائل الاعلام الى 50 مل أنابيب مخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 1،000 x ج لمدة 15 دقيقة لتكوير أي حطام خلية. التالي، تصفية طاف عبر غشاء 0.45 ميكرون. أي منخفض البروتين مرشح ملزم، مثل PVDF، يعمل بشكل جيد. الحذر: مكان كل من النفايات الفيروسية الصلبة والسائلة في محلول التبييض.
5. تحميل 30 مل تصفيتها طاف في أنابيب نابذة فائقة السرعة وإلى نابذة فائقة السرعة. الطرد المركزي في 100،000 x ج لمدة 2.5 ساعة عند 4 درجات مئوية. فتح أنابيب الطرد المركزي في غطاء BSL2 وإزالة طاف في 10٪ التبييض. إضافة ~ 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني إلى المؤسسة العامةllet والتي ينتج التتر من 1X10 ^ 7-8 وحدات المعدية / مل. قسامة اليوم والمخزن التالي في -80 درجة مئوية. مأخوذة الفيروسة البطيئة هي مستقرة في -80 درجة مئوية لمدة ستة أشهر على الأقل.
6. لدينا العديد من المؤسسات الآن النوى الفيروسية: النظر الهامة. اكتساب فيروس مركزة مع الحد الأدنى من عيار 1X10 ⁷ المعدية وحدة / مل، لأفضل النتائج.

2. الفئران المانحة لMGE تشريح

1. أولا، إنشاء التزاوج بين توقيت خط لجنة المساواة العرقية، معربا عن المصالح وإما نوع البرية (WT) الماوس أو الفأرة التي من شأنها التعبير عن مراسل بعد إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية بوساطة.
   ملاحظة: العديد من خطوط جنة المساواة العرقية سائق هي البذور المعدلة وراثيا ويتم الاحتفاظ بها ولدت في ولاية فرداني الزيجوت. وهكذا، فإن نصف فقط من الأجنة تحتوي على التحوير لجنة المساواة العرقية. الحمض النووي يمكن أن يكون مستعدا بسرعة من الأجنة لPCR قصيرة للكشف عن أليل لجنة المساواة العرقية. ومن ثم يمكن حصاد لجنة المساواة العرقية ⁺ الأجنة بحيث يتم استخدام سوى نسيج MGE من النمط الجيني المطلوب. Alternatively، يمكن استخدام مراسل لجنة المساواة العرقية التي تعتمد، لتحديد الأجنة لMGE تشريح وزرعها.
2. حساب أي يوم سوف تتوافق مع E13.5. إذا تم إقران الحيوانات المساء قبل، وهو اليوم من المكونات هو 0.5. ترتيب الفئران توقيت الحوامل أو أنثى WT مع الجراء P1 من أجل وجود الوقت بعد الولادة (P) 1 الفئران في اليوم فإن الأنسجة المانحة يكون E13.5. بدلا من ذلك، إنشاء هذه التزاوج في منزل أسبوع واحد قبل الاقتران الحيوانات المانحة.
   ملاحظة: هذه الاستراتيجية السابقة لتوليد كل من E13.5 والأجنة P1 / الجراء لنفس اليوم في كثير من الأحيان من الصعب القيام به بشكل موثوق.

3. إعداد وسائل الإعلام، وأدوات ومعدات.

1. تحضير الكواشف وأدوات لإعداد خلية MGE (الجدول 2).
   1. إعداد سطح نظيف ووضع ملقط نظيفة، مقص، وإما بسكين المجهرية أو ملقط غرامة (للتشريح الأنسجة الدقيق) على السطح.
   2. إعداد محلول ملحي متوازن هانك (HBSS)، وأو تشريح، ومتوسطة النسر Dulbeco لتعديل و(DMEM) مع 10٪ surem بقري جنيني (FBS)، لالتنبيغ.
   3. يحضن مسبقا 20-30 مل DMEM / 10٪ FBS في 37 ° C الأنسجة ثقافة حاضنة لمدة 1 ساعة. يجب أن خففت غطاء للسماح لتبادل الغاز ودرجة الحموضة موازنة وسائل الإعلام.
      ملاحظة: حضن مسبق سائل الإعلام يمكن أن يكون مستعدا تماما قبل البدء في تشريح.

4. MGE خلية التحضير

1. التضحية الماوس حاملا وفقا لبروتوكول الحيوانية المعتمدة وإزالة الأجنة في طبق بتري 10 سم تحتوي على الجليد الباردة HBSS.
2. إزالة الدماغ من كل جنين باستخدام نطاق تشريح (القيام في وقت واحد، وترك بقية الأجنة في الجليد الباردة HBSS) ومن ثم المضي قدما لقطع الأنسجة MGE.
   ملاحظة: مفصلة أدناه، وفي الشكل 1، هي الخطوات الرئيسية التي تبين كيفية إزالة MGE. وبالإضافة إلى ذلك، الشكل 2 هو فيلم يبين تشريح كاملالإجراء.
   1. ضع الدماغ مع الجانب البطني مواجهة (أرقام 1A، A '). ملاحظة: كما أنها بخير لديك الجانب الظهري مواجهة. قطع المخ في نصف طول الطائرة saggital لتوليد قطعتين. ويرد مثال hemisected الدماغ (أرقام 1B، B ')، لاحظ أن الظهرية (القشرة الفوقية) والجوانب البطنية من غطاء الدماغ وتحيط الأنسجة البارزة العقدية (GE).
   2. وبعد ذلك، مع يد المهيمنة، الاستمرار على أي ملقط غرامة جدا أو stabknife (الجدول 2)، في حين شل حركة نصف الكرة مع ملقط التي عقدت من قبل جهة غير المهيمنة. (الجانب الأنسي ونصف الكرة الغربي يجب أن تواجه متابعة). تتكشف ظهري وبطني الأنسجة مع ملقط وسكين طعنة لكشف الكامنة GE الأنسجة (الشكل 1C بشكل تخطيطي في الشكل 1C).
      ملاحظة: يمكن إزالة بعض وسائل الاعلام من الطبق تشريح بتري يجعل من الاسهل لتحقيق الاستقرار في الأنسجة أثناء بيrforming تشريح MGE.
   3. إجراء تخفيضات على التوالي مع stabknife أو ملقط غرامة لفصل فريق الخبراء الاستشاري، إل جي والأنسجة الحاجز (انظر تخفيضات سبيل المثال الرمز بواسطة أحمر الخطوط المتقطعة، أرقام 1D و D '). هذه التخفيضات يمكن إجراؤها في أي أمر.
      ملاحظة: تخيل MGE ك "مربع" أن يتم قطع من الأنسجة المحيطة بها. القيام بذلك يساعد على جعل بتكاثر تخفيضات مماثلة لكل تشريح، وبالتالي الحد من التقلبات في تشريح الأنسجة.
   4. وأخيرا، وتحويل MGE على جانبها وتقليم قبالة الجزء السفلي (ما كان الجانب الوحشي للدماغ). هذا يزيل منطقة عباءة MGE (تجاهل في أرقام 1E و1E ') من بقية MGE. الجانب المتبقي من MGE يحتوي على منطقة البطين في المقام الأول وأجزاء منطقة subventricular من MGE، الذي يحتوي على ما يقرب من جميع الخلايا الاصلية MGE. المضي قدما في هذا النسيج.
3. اعتبار هام: إضافة هلام السيليكون إلى الجزء السفلي من كاليفورنيا طبق بترين تكون بمثابة سطح تشريح ممتازة كما أنه يحمي نصائح الحساسة من الملقط ويوفر سطح ناعم لتعلق الأنسجة بالملقط.

4.3 استراتيجيات إضافية لMGE تشريح.

1. قطع الجلد للجنين باستخدام ملقط مثل المقص لإزالة بسرعة الدماغ. كما يضع الجنين على جانبها، وعقد الأنسجة في قاعدة الرأس مع ملقط يستخدم لترسيخ الأنسجة. أولا، وقطع الأمامي بطني إلى الدماغ وبطني الخلفي للدماغ، ومن ثم ربط تخفيضات اثنين على طول الجانب من الجنين. ثم الاستيلاء على رفرف من الجلد وتسحبه فوق الجزء العلوي من الدماغ. ويمكن بعد ذلك أن الدماغ تشريح بسرعة بعيدا عن الأنسجة المتبقية.
2. بدلا من ذلك، ترسيخ الجانب الخلفي من الدماغ كله وراء القشرة. وفي الوقت نفسه، فهم كل نصف الكرة على الجانب الذيلية الأكثر الظهري من القشرة وتمزق القشرة بعيدا عن الأنسجة الراسية في اتجاه الأمامي. وبهذه الطريقة، سواء جortices يمكن إزالتها، وكشف عن الفضيلة العقدية الثنائية، لا تزال تعلق على بقية الأنسجة الحفاظ على التشريح وسطي الأطراف.
3. التبديل إلى سكين طعنة لجعل تخفيضات دقيقة حول MGE على كل نصف الكرة الغربي. استخدام أي مجموعة نظيفة منفصل من ملقط لجمع MGE أو ماصة مع طرف كبير (أي.، P1000).
   ملاحظة: الحفاظ على الأنسجة التي تم جمعها بعيدا عن كل مادة تشريح أخرى، كما يتم نقل بعض وسائل الاعلام حتما عندما يتم جمع MGE.
4. جمع MGE ووضع الأنسجة إلى 1.5 مل جمع أنبوب يحتوي DMEM / 10٪ FBS، (وبلغ حجم التداول 500 ميكرولتر كافية لجمع MGEs). تكرار لنصف الكرة الأرضية ومكان أخرى في نفس أنبوب جمع. الاحتفاظ بعينات على الجليد حتى يتم جمع جميع الأنسجة.

5. وضع العلامات Lentiviral وزرع

1. نقل أنابيب من أنسجة MGE إلى BSL2 شهادة غطاء محرك السيارة وإزالة وسائل الإعلام.
   ملاحظة:الأنسجة MGE كبيرة بما يكفي لتكون واضحة للعين، وسوف تستقر في قاع الأنبوب السماح لوسائل الإعلام الباردة لإزالتها بسهولة وبلطف.
2. إضافة ~ 500 من المجاهدين وسائل الاعلام DMEM / 10٪ FBS، التي كانت preincubated في ثقافة حاضنة 37 درجة مئوية الأنسجة. المقبل، إضافة polybrene لتسهيل التنبيغ إلى كل أنبوب بتركيز نهائي من 8 ميكروغرام / مل. يسحن الأنسجة MGE لإنشاء تعليق خلية واحدة، وذلك باستخدام طرف P1000 ماصة. وأخيرا، إضافة ~ 15-20 ميكرولتر من الفيروسة البطيئة المركزة إلى كل أنبوب.
3. الاعتبارات المهمة: A سحن من 10-12 مرة كافية لتفتيت الأنسجة MGE من جنين واحد، ولكن قد تكون هناك حاجة أكثر triturations إذا يتم تجميع MGEs متعددة معا. جرب الظروف سحن مختلفة لتحديد أفضل ما يمكن عمله.
4. آمن إغلاق كل أنبوب، عكس لخلط، من مكان جميع الأنابيب في الحاضنة 37 درجة مئوية. احتضان الخلايا في الفيروسة البطيئة لمدة 30 دقيقة على الأقل، وتصل إلى 1 ساعة. أسفرت مرات أطول في ديبقاء الخلية مجعدة. عكس أنابيب كل 10 دقيقة حتى يحين الوقت.
5. بعد الحضانة مع الفيروسة البطيئة، وإزالة أنابيب من الحاضنة وأجهزة الطرد المركزي في ~ 700 x ج لمدة 3 دقائق لخلايا بيليه. في غطاء محرك السيارة BSL2، وإزالة طاف وتجاهل في التبييض 10٪. المقبل، إضافة 1 مل DMEM / 10٪ FBS ويسحن بيليه 2-3 مرات أن يغسل، ثم الطرد المركزي مرة أخرى في نفس السرعة لخلايا بيليه. كرر هذه الخطوة يغسل 2-3 مرات أكثر لإزالة فيروس الزائد.
   ملاحظة: إجراء الخطوات الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، ومع ذلك، لم وحظ انخفاض الجدوى عندما يتم تنفيذ يدور قصيرة في RT.
6. بعد غسل النهائي، وإزالة وسائل الإعلام قدر الإمكان ووضع كل أنبوب على الجليد. بسبب وسائل الاعلام المتبقية على جانبي الأنبوب، ~ 2-3 ميكرولتر من وسائل الاعلام في نهاية المطاف تغطي الخلية بيليه في الوقت الذي بدأت إجراء الزرع.

6. زرع والتحقق من صحة

1. الحصول على المضيف الجراء P1 وإعداد الإجراءمنطقة عن طريق الرش أسفل مع الايثانول 70٪. للحفاظ على عقم أثناء إجراء فمن المستحسن أن تنفيذ هذه الإجراءات في غرفة الإجراء نظيفة مخصصة. وبالإضافة إلى ذلك، استخدم إحدى الأدوات الجراحية تعقيمها تعقيم الأسطح التي الجراء ستكون على اتصال مع استخدام 70٪ من الإيثانول. ويرد مثال المعدات اللازمة لأداء تمثيلية للزرع ومنطقة الإجراء ممثل في الشكل 3.

ملاحظة: في حين أن هذا الإجراء هو حقن كميات صغيرة، وليس إجراء العمليات الجراحية التي تتطلب شق، جرح مفتوح أو الغرز، لا يزال المستحسن أن يتم استخدام ممص مكروى جديد لكل الماوس ليتم حقنه. على بال micropipettes هي حرارة تعقيم عندما سحبت ومشطوف على سطح الذي تم رش مع 70٪ من الإيثانول يجري تخزينها في حاوية مغلقة.

1. توليد بال micropipettes أن يكون قطره في طرف بين 40-80 ميكرومتر. سوف يلي هذه الأبعاد تسفر الأمثلالنتائج. الحرارة تعقيم بال micropipettes عندما سحبت ومشطوف على سطح ورذاذ مع الايثانول 70٪ قبل تخزين بال micropipettes في حاوية مغلقة.
   ملاحظة: بدلا من ذلك، إذا الوصول إلى الأجهزة اللازمة لإنشاء هذه الإبر (الجدول 2) يحد من استخدام أي جهاز حقن الآخرين. ومع ذلك، هذه قد لا تكون مناسبة كذلك بال micropipettes بسبب أقطار مختلفة.
2. وضع الزيوت المعدنية في حقنة 1 مل، مع وجود إبرة G 30 1/2، وملء ماصة الزجاج تماما مع الزيوت المعدنية. وبعد ذلك، جبل الغطاس على الجهاز التجسيمي، ثم إرفاق ماصة الزجاج إلى الجهاز التجسيمي وتحميل على المكبس. باستخدام محرك هيدروليكي، حرك المكبس في منتصف المسافة تقريبا في ماصة الزجاج، وإزالة الزيوت المعدنية التي تسرب بها مع نظيفة منشفة ورقية نظيفة.
   1. بدلا من ذلك باستخدام حقنة، غمر نهاية الجزء الخلفي من ماصة في الزيوت المعدنية ويشغلها عمل شعري. لمنع فقاعات الهواء في pipettه، والحفاظ على ضغط إيجابي على حقنة حتى تماما من ماصة الزجاج.
      ملاحظة: أجهزة أخرى يمكن استخدامها لزرع خلايا MGE ¹⁴ بنجاح. أي الجهاز الذي يمكن أن يحقق حجم أقل من أو بالقرب منها 100 أعمال نيكولا لانغ جيدا لهذا الإجراء.
3. المقبل، واستخدام منشفة ورقية معقمة، أو أي مواد ماصة، مع زاوية الملتوية الى نقطة غرامة لإزالة بدقة وسائل الإعلام الزائد فوق الخلية بيليه MGE. هذه الخطوة تركز كثافة الخلية بحيث لا يمكن أن يتحقق من حجم الضخ أصغر. المقبل، واستخدام حجم منخفض (ويفضل P2) ماصة لرسم ببطء بيليه الخلية ويسحن 1-2 مرات قبل أن ينتقل تعليق الخلية على سطح مسعور. يجب أن يكون حجم أقل بقليل من 1 ميكرولتر. تحريك رأس الإبرة في تعليق خلية وباستخدام محرك هيدروليكي، ووضع تعليق خلية في ماصة.
4. تخدير الجرو P1 عبر انخفاض حرارة الجسم (لف في القفازات المطاطية ووضع على الجليد ل~ 2-4 دقيقة).تحقق من فعالية التخدير مع التحفيز الضارة. قرصة الجلد بين أصابع القدم مع ملقط غرامة: يجب أن يكون الجرو لا تستجيب إذا مقروص. وبعد ذلك، وضع الجرو على قالب هذا هو تحت جهاز حقن، ثم جعل الجلد مشدود قبل الانسحاب الجلد على الرأس وتأمين مع الشريط المختبر القياسية.
   ملاحظة: على الرغم من انخفاض حرارة الجسم هي فعالة جدا على الفئران حديثي الولادة والنتائج في معدل وفيات منخفض، ويجب أن يتم الإجراءات بسرعة، وسوف تبدأ الجراء لاسترداد في أقل من 10 دقيقة. وبالإضافة إلى ذلك، 4 دقيقة على الجليد هو الحد الأعلى لما يمكن السكوت عليها. محاولة للحث على انخفاض حرارة الجسم مرة واحدة فقط إذا كنت بحاجة لوقت أطول لحقن. ومع ذلك، إذا كان الجرو يتعافى في وقت مبكر، والسماح لأول مرة الجرو حتى يتعافى تماما قبل إحداث انخفاض حرارة الجسم مرة أخرى. وعلاوة على ذلك، حث انخفاض حرارة الجسم واحد فقط مزيدا من الوقت لإجراء الحقن. والجراء على التعافي في غضون 5-10 دقيقة من انخفاض حرارة الجسم. وهذا يمكن أن يتيسر من خلال وضع الجراء مع القمامة وأمي أو عن طريق وضع الجرو على السطحية الدافئةالبريد لاسترداد.
5. باستخدام جهاز التجسيمي، ضع غيض من ماصة الزجاج على السطح على رأس الجرو، وعمودي على سطح الرأس. عندما ماصة على اتصال مع الرأس، واعتبار ذلك "0". وبعد ذلك، دفع ماصة من خلال سطح الجلد والجمجمة في القشرة، ثم أدخل وسحب ماصة ~ 2 مرات قبل التوقف. لأفضل استهداف الخلايا في القشرة المخية الحديثة، يتم تنفيذ الحقن عندما ممص مكروى هو على عمق 0.1 مم. ومع ذلك، وهذا ينبغي أن يكون الأمثل من قبل المستخدم (انظر الملاحظة أدناه).
   ملاحظة: على الرغم من هذا العمق يستهدف موثوق طبقات أعمق القشرة المخية الحديثة مع الأجهزة المذكورة أعلاه، وعدد قليل أعماق ينبغي اختبار تحديد تجريبيا. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي اختبار مجموعة من أعماق في rostro-الذيلية وميديو الاطراف موقفا مختلفا لتحديد ما هي العمق هو الأمثل في كل موقع. أيضا، يجب أن يكون ثقب الأولي السريع، والاختراق بطيئة في القشرة المخية الحديثة يقلل من القدرة على جleanly اختراق الأنسجة. حاول بسرعة مختلفة عندما بدأت لأول مرة هذا الإجراء للعثور على ما يعمل بشكل أفضل. وبالإضافة إلى ذلك، لإحداثيات الاختبار، وليس هناك بديل حقيقي لاستخدام الخلايا المسمى، كما كانت الأصباغ لا يمكن الاعتماد عليها للدلالة على الموقف.
6. وبمجرد أن الإبرة في الموقف، وتناوب الجهاز الهيدروليكي لدفع المكبس في ماصة الزجاج، ودفع حجم مجموعة من تعليق خلية في القشرة. حقن 50-70 NLS في الموقع. كرر هذا الإجراء في 3-6 مواقع مختلفة على مستويات مختلفة منقاري الذيلية إذا كان الهدف هو الحصول على توزيع واسعة من الخلايا في جميع أنحاء القشرة المخية الحديثة.
   ملاحظة: وحدات التخزين من 100 NL أو أكبر يمكن أن تسبب آفات وتؤدي إلى كتل كبيرة من حقن الخلايا التي لا تهاجر بكفاءة من موقع الحقن. وهكذا، وأحجام حقن أصغر (~ 70 NL أو أقل) هي الأمثل، على المزيد من المواقع إذا سمح الوقت.
7. عند اكتمال الحقن، وإزالة الجرو من مرحلة ووضع علامة عليه (اصبع القدم لقطة هو وسيلة يمكن الاعتماد عليها لتحديد صيو بي إس في وقت لاحق). مرة واحدة تعافى الجرو وغير قادرة على التحرك من تلقاء نفسها (يحدث هذا في غضون دقائق من حرمانهم من المرحلة)، ووضعها مرة أخرى مع أمي والقمامة.
   ملاحظة: بما أن هذا هو الإجراء مينيملي لا توجد إجراءات ما بعد الجراحة مرة واحدة الجرو تتحرك بحرية والدفء. ومع ذلك، يجب فحص الجراء ليس فقط بعد إجراء العملية ولكن أيضا في اليوم التالي للتأكد من لديهم أي علامات على تدهور الحالة الصحية.
8. قبل البدء في الإجراء على الجرو المقبل، رش أسفل المنطقة مع الايثانول 70٪ للحفاظ على منطقة عمل معقمة. السماح للالجراء حقن لتطوير وثم تقييم الأنسجة في هذه المرحلة التنموية المناسبة (ق).

النتائج

منذ خلايا MGE لديها قدرة فريدة على الهجرة والاندماج عندما زرعها في القشرة المخية الحديثة المضيف ^16، لأنها توفر نظام نموذجا ممتازا للتلاعب الجيني قبل الدراسات في الجسم الحي. هنا، وتبين لنا كيف يمكن للمرء أن عزل الأنسجة MGE من أجنة E13.5 (الشكلان 1 و 2)، وال...

Discussion

استخدام GABAergic السلائف عصبون القشرية من الفضيلة العقدية الجنينية (غيس) للعلاجات الخلايا استنادا تبدو واعدة للعديد من الحالات ^{12 -1 4.} وهناك حاجة إلى تقنيات جزيئية دقيقة لتتبع، والتعبير عن جينات الفائدة في مجموعات فرعية عصبون محددة. هنا نقدم بروتوكول مفصلة لوصفها ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and equipment for MGE cell transplantation
1 ml syringe	REF 309602	BD, Becton Dickinson and company
30 1/2 G needle	305106	BD, Becton Dickinson and company
Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger)	5-000-1005	Drummond scientific company
Parafilm	PM-999	Polysciences, Inc.
Stereo microscope with boomstand **	MZ6	Leica
Digital just for mice stereotaxic instrument **	51725D	Stoelting company
Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator **	MO-10	Narishige
Diamond coated rotary beveler		made in house
Needle pipette puller	730	Kopf instruments
Mineral oil		Any drug store or pharmacy
Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume
** These are the particular models we use, but many other setups should work
Optional Reagents (for making Lentiviruses)
25 mm, 0.45 µm filter	09-719B	Fisher Scientific
Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm)	344058	Beckman Coulter®
Lipofectamine 2000 (1.5 ml size)	11668019	Invitrogen
Other commercially available supplies
pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol	12251	Addgene
pRSV-Rev plasmid encoding Rev	12253	Addgene
pMD2.G plasmid encoding VSVG	12259	Addgene
pAAV-Flex-GFP	28304	Addgene