ウイルス媒介標識およびための内側神経節隆起（MGE）の移植は、細胞<em&gt;インビボ</em&gt;研究

要約

GABA作動性皮質介在ニューロンの前駆細胞は、移植後のホスト皮質に統合シナプスの開発と、分散させる。これらの細胞は、容易に遺伝的に改変されたGABA作動性前駆体のインビボでの研究のために、移植前に形質導入することができる。ここでは、既存のCreラインとCre依存レポーターを使用して、特定の介在ニューロンのサブグループをターゲットとするウイルス性標識技術を示している。

要約

胚の内側と尾側神経節隆起（MGE及びCGE）由来のGABA作動性皮質介在ニューロンは、機能的および形態学的に多様である。進出が別個の皮質ニューロンのサブグループの役割を理解する上でなされているが、GABA作動性細胞の異なるタイプの発生および成熟に寄与し得る働いする多くのメカニズムがまだある。また、変更されたGABA作動性シグナル伝達は、自閉症、統合失調症およびてんかんの表現型に寄与し得る。具体的なのCre-ドライバーラインはユニークな介在ニューロンのサブグループの機能を実行小包し始めている。マウスモデルにおける進歩にもかかわらず、効率的に、インビボでの分子アプローチとGABA作動性、皮質介在ニューロン前駆細胞を研究することはしばしば困難である。これらの細胞の細胞自律的なプログラミングを研究するために使用される一つの重要な技術は、宿主皮質にMGE細胞の移植である。これらの移植細胞は、差別化、広範囲に移動するND機能的に統合する。また、MGE細胞を効率的に分子アプローチの多数を可能にする、移植の直前にレンチウイルスで形質導入することができる。ここでは詳細に効率よく利用できるのCreドライバライン及びCre依存の発現ベクターを用いて、in vivoでの分析のために、移植前にMGE細胞を形質導入するためのプロトコル。それは大きなインビボ細胞型特異的解像度を可能にする、移植後に分散させるためにこれらの細胞の能力を正確に遺伝子操作を組み合わせるので、このアプローチは有利で ​​ある。

概要

残りは、興奮性グルタミン酸作動性に主ニューロンに対応しながら、GABA作動性、皮質介在ニューロンは、哺乳動物の新皮質におけるニューロンの〜20-30％を含む。介在ニューロンは^、1をターゲット^に軸索と樹状突起の形態およびシナプス電気生理学的特性において非常に多様であり、興奮性/抑制性トーンの不均衡は、自閉症、統合失調症やてんかん²を含む神経/精神神経疾患のいくつかの表現型の根底にあると仮定される。本明細書に記載されたプロトコルの全体的な目標は、効率的に、遺伝的にin vivoでの分析のために、移植前GABA作動性、皮質介在ニューロン前駆細胞を変更する手段を提供することである。

皮質GABA作動性介在ニューロンは、内側と尾側神経節隆起（MGE及びそれぞれ^CGE、）3,4と同様に視索前野⁵で生まれている。皮質介在ニューロン前駆細胞は、長距離接線の移行が続い受けるラジアル移行により、最終的な目標に到達する。彼らの目的地に到着すると、これらの皮質介在ニューロンが正しく、既存の神経細胞のネットワークに統合する必要があり、それぞれの固有の介在ニューロンのサブグループは、特定の方法で皮質回路に貢献していきます。 4つの主なサブグループは、分子マーカーによって識別することができます。MGE由来ソマトスタチン^（SST）+及びパルブアルブミン^（PV）+サブグループ、およびCGE由来血管作動性腸管ペプチド^（VIP）+とリーリン^+; SST ^-サブグループ^6。異なる皮質介在ニューロンのサブグループは、MGE及びCGE ^7,8における胚発生の間、異なる時間にわたって生まれている。これらおよび他の皮質GABA作動性介在ニューロンのマーカーはこれらのサブグループ^9-11の多くの具体的なCre媒介ドライバラインを生成するために使用されてきた。

MGE前駆細胞の移植は、不均衡によって引き起こされる障害を治療するための潜在的な細胞ベースの治療法として浮上している^{24 - 12を}励起/阻害で。これらの治療効果は、多くの周囲の体阻害PV ⁺細胞はMGEから誘導される（分化し、宿主脳に統合、分散させる）、または潜在的にのでMGE前駆体のユニークな能力に一部起因し得る。 MGE細胞はまた、遺伝的に、インビトロで改変された細胞は、in vivoで研究することを可能にする、迅速かつ効率的に移植する前に^、15レンチウイルスで形質導入することができる。このアプローチを開発するための理論的根拠は、GABA作動性皮質介在ニューロンの発達と成熟を研究する中で障害物を克服することであった。変異マウスは、そうでなければ、早期の時点で死亡していたとき、特に、MGE移植は、研究者が、in vivoで変異細胞の発達を研究することができた。また、移植前に目的の遺伝子を導入することによって、変異体の表現型に特異的な遺伝子の効果はeffはで評価することができるicient方法。

ここでは、移植前にレンチウイルスMGE細胞を形質導入するための詳細なプロトコルを提供する。さらに、この技術はCre依存発現レンチウイルスおよび入手のCreドライバマウス系統の組み合わせを使用して、皮質介在ニューロン前駆体の異種グループから特定のニューロンのサブグループにおいて、目的の遺伝子を発現するように適合させることができるかを示す。遺伝的にユニークな方法でin vivo試験のためのGABA作動性皮質介在ニューロン前駆体を変更するにはまた、このプロトコルは、技術者や研究者のためのプラットフォームを導入しています。他の現在のアプローチに対するこの技術の1つの利点は、移植MGE細胞が離れて注射部位から分散することである。また、焦点のウイルス注射とは異なり、MGE細胞が分散した後、それらの形態は、評価することが容易です。このアプローチは、特定の細胞型を導入する、野生型または変異型の細胞に、目的とする遺伝子を導入することの効果を研究するために使用することができレポーター形態を評価するための、または潜在的にin vivoでの疾患対立遺伝子の効果を研究する。

プロトコル

倫理声明：以下の手順では、私たちの施設や動物プロトコルによって承認されている。実験を開始する前に、生存の手術に関連するすべての手続きの承認を取得することを確認し、すべてのプロトコルが最新であることを確認します。

1.レンチ準備（オプション手順）

1. 10ミリリットルDMEM / 10％FBSの存在下で行われる各レンチウイルスのためのHEK293T細胞の三10cmプレートを分割し、〜60〜70％のコンフルエンスに成長する。 5％CO ₂で37℃のインキュベーター中で細胞を増殖させる。
2. 任意のトランスフェクション試薬を用いて、各プレートに、以下のDNAプラスミド（10μgの合計）をトランスフェクトする：6.4μgのCAGフレックス-GFPレンチウイルスベクター（表1に提供されるDNAベクター配列）、1.2μgのpMD2.G（VSV-グラムをコードする）、1.2 μgののpRSV-REV、および1.2μgの含有pMDLg / pRREに。 3レンチウイルスパッケージングベクターは、市販されている（表
   注意：この特定のアプローチは、第3世代を利用lentivirアルベクトルが、第2世代ベクトルおよび関連するプラスミドも動作します。
3. 連絡またはレンチウイルスを含むすべてのソリューションやデバイスを不活性化するためにBSL2認定フード内で、10％の漂白剤溶液を含む廃棄物容器を準備します。次に、完全に、漂白剤溶液へのトランスフェクション後にメディア4-6時間後に削除する新しいメディアの同じボリュームで置き換え、細胞が成長することができます。
4. 4日後、すべての細胞破片をペレット化し、15分間、1,000×gで50ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機にメディアを集める。次に、0.45μmの膜を通して上清をフィルタリングする。任意の低タンパク質結合フィルターは、PVDFのように、うまく動作します。注意：漂白剤溶液中に場所固体と液体の両方のウイルス無駄。
5. 負荷30 mlの超遠心管に超遠心して上清を濾過した。 4℃で2.5時間100,000×gで遠心し。 BSL2フード内で遠心分離管を開き、10％の漂白剤に上清を除去。 PEへのPBS〜100μlのを追加1×10 ^ 7-8感染単位/ mlの力価が得られllet、。 -80ºCで、次の日と店を分注し。レンチウイルスのアリコートを、少なくとも6ヶ月間、-80℃で安定である。
6. 重要な考慮事項：多くの機関が今、ウイルスのコアを持っている。最適な結果を得るために、1×10 ⁷感染単位/ mlの最小力価で濃縮したウイルスを取得します。

MGE解剖2.ドナーマウス

1. まず、関心のcre発現ラインとのCre媒介組換え後にレポーターを発現する野生型（WT）マウスまたはマウスの間で、時限交配を設定します。
   注：多くのCre-ドライバーラインはトランスジェニックであり、ヘミ接合状態に維持し、飼育されている。このように、胚の半分だけは、Cre導入遺伝子が含まれています。 DNAを迅速にCre対立遺伝子を検出するための短いPCRのための胚から調製することができる。所望の遺伝子型のみMGE組織が ​​使用されるようにCre ⁺胚を回収することができる。 Alternatively、Cre依存レポーターは、MGEの解剖と移植のための胚を選択するために、使用することができる。
2. E13.5に対応することになるどの日計算します。動物が前に夜をペアリングしていた場合、プラグの日は0.5です。ドナー組織はE13.5になる日に、出生後（P）1マウスを有する時間に順番に注文時限妊娠マウスまたはP1仔とWTの女性。また、ドナー動物をペアリングする前に1週間家にこれらの交配を設定します。
   注：同じ日に両方E13.5およびP1胚/子犬の生成元の戦略が確実に行うことが困難であることが多い。

メディア、工具および機器の調製。

1. MGE細胞調製（ 表2）のための試薬 ​​およびツールを準備します。
   1. 清浄な表面を準備し、表面にきれいな鉗子、はさみや顕微ナイフや（正確な組織切開のための）細かい鉗子のいずれかを配置します。
   2. ハンクス平衡塩溶液（HBSS）、Fを準備解剖、および形質導入のために、10％ウシ胎児su​​rem（FBS）を有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、または。
   3. 約1時間37℃の組織培養インキュベーター中でプレインキュベート20〜30ミリリットルDMEM / 10％FBS。蓋は、メディアのガス交換及びpH平衡を可能にするために緩めする必要があります。
      注：メディアプレインキュベーションは、単に切開を開始する前に調製することができる。

4. MGEの細胞調製

1. 承認された動物プロトコルに従って妊娠中のマウスを犠牲にし、氷冷HBSSを含む10センチシャーレに胚を取り除く。
2. （氷のように冷たいHBSS中の胚の残りの部分を残して、一度にいずれかの操作を行います。）解剖スコープを使用して、各胚から脳を取り出した後、MGE組織を切り出すに進みます。
   注：以下の詳細、および図1に、MGEを削除する方法を示した重要なステップである。また、 図2は全体の解剖を示す映画です手順。
   1. 腹側が（ 図1A、A '）を上にして脳を置きます。注：それは背側面が上を向くようにすることも大丈夫です。 2ピースを生成するために矢状面に沿って半分に脳をカット。例等分脳（ 図1B、B '）は、その背側（上に重なる皮質）および脳カバーの腹側面に気づくと神経節隆起（GE）組織を取り囲むが示されている。
   2. 非利き手で保持鉗子で半球を固定しながら、次に、利き手で、非常に微細鉗子またはstabknife（ 表2）のいずれかを保持する。 （半球の内側面は上向きにする必要があります）。根底にあるGE組織（ 図1C及び図1C」に図解を）明らかにするために、背側と腹側組織鉗子でと刺すナイフを展開。
      注：解剖ペトリ皿から一部のメディアを削除すると、それが簡単にPEながら組織を安定させることができますMGE郭清をrforming。
   3. CGE、LGEと中隔組織を分離するためにstabknife又は微細鉗子でストレートカットを作る（赤で示さ例のカットは破線参照、1DおよびD 'は図 ）。これらのカットは、任意の順序で行うことができる。
      注：周囲の組織から切断された「ボックス」とMGEを想像してみてください。そうするため、組織解剖の変動を低減し、再現性良く、各解剖のために同じようなカットを作るのに役立ちます。
   4. 最後に、その側面にMGEをオンにし、（脳の左右側面何だった）の底を切り落とす。これはMGEの残りの部分からMGEのマントルゾーンを（ 図1Eおよび1Eに捨てる」）を削除します。 MGEの残りの側面は、主に脳室帯とほぼすべてのMGE前駆細胞が含まれているMGE、の脳室下帯部分が含まれています。この組織を続行します。
3. 重要な考慮事項：シャーレcaのの下にシリコーンゲルの添加それは鉗子の微妙なヒントを保護し、鉗子で組織を固定するためのソフト面を提供するように、n優れた解剖面となる。

MGE解剖4.3さらなる戦略。

1. すぐに脳を削除するにはハサミのように鉗子を使用して胚の皮膚をカット。胚が横に産むとして、組織を固定するために使用鉗子で頭の基部に組織を保持する。まず、脳に脳と後部腹に腹側前部切断し、その後、胚の側面に沿って2つのカットを接続します。その後、皮膚のフラップをつかみ、脳の上に引き出します。脳はその後すぐに残りの組織から離れて解剖することができます。
2. また、皮質の背後にある脳全体の後面を固定。一方、皮質の最も背側尾側側面に各半球を把握し、前方方向に離れてアンカー組織から皮質を引き裂く。このように、双方のCorticesを除去することができ、二国間の神経節隆起はまだ内側 - 外側解剖学を維持する組織の残りの部分に結合して、明らかにされている。
3. 各半球にMGE周りに正確なカットを作るために刺すナイフに切り替えます。大先端（ すなわち 、P1000）でMGEまたはピペットを収集するために鉗子の別々のクリーンセットのいずれかを使用してください。
   注：MGEが収集されたときにいくつかのメディアが不可避的に転送されるように、離れて他のすべての解剖材料から採取された組織にしてください。
4. MGEを収集し、DMEM / 10％FBS、（500μlの容量がMGESを収集するのに十分である）を含む1.5 mlのコレクションチューブに組織を置く。同じコレクションチューブに他の半球と場所について、この手順を繰り返します。すべての組織が収集されるまで、サンプルを氷上で保管してください。

5.レンチウイルス標識および移植

1. BSL2認定フードにMGE組織のチューブを移動し、メディアを取り出します。
   注意：MGE組織は、目に見えるである可能と冷たいメディアは簡単にかつ優しく除去することが可能にするチューブの底に沈殿します十分な大きさである。
2. DMEM / 10％FBS培地〜500μlのを追加し、それを37℃の組織培養インキュベーター中でプレインキュベートした。次に、8μg/ mlの最終濃度を各チューブに形質導入​​を容易にするためにポリブレンを追加する。 P1000のピペットチップを用いて、単一細胞懸濁液を作成するためにMGE組織を粉砕する。最後に、各チューブに集中レンチウイルスの〜15〜20μlを添加する。
3. 重要な考慮事項：10〜12回のトリチュレーションは、単一の胚からMGE組織を破壊するのに十分であるが、複数のMGESが一緒にプールされている場合、よりtriturationsが必要になることがあります。最適なものを決定するために、別の磨砕条件を試してみてください。
4. 確実に37℃のインキュベーターで場所よりも、混合して反転させ、すべてのチューブを各チューブを閉じます。少なくとも30分間、1時間までのレンチウイルスで細胞をインキュベートする。長い時間がデもたらした細胞生存率を折り目。タイムアップまでのチューブを10分ごとに反転します。
5. レンチウイルスとのインキュベーション後、細胞をペレットに3分間〜700×gでインキュベーターと遠心分離機からチューブを取り外します。 BSL2フードでは、上清を除去し、10％の漂白剤に捨てる。次に、1ミリリットルのDMEM / 10％FBSを追加し、細胞をペレット化するために、同じ速度で再び遠心その後、洗浄するためにペレットを2〜3回粉砕する。過剰ウイルスを削除するには、この洗浄ステップを2-3回繰り返します。
   注：短いスピンは、室温で行われた場合、4℃で遠心分離工程を実行したが、生存率の低下が観察されていない。
6. 最後の洗浄の後、可能な限り多くのメディアを取り出し、氷上で各チューブを置く。 、チューブの側面に残留メディアに、メディアの〜2-3μlを移植手順が開始された時間によって細胞ペレットをカバーすることになります。

6.移植と検証

1. ホストP1仔を取得手続きを準備70％エタノールでダウンスプレーによる面積。手順の間に無菌性を維持するためには、専用の清潔な処置室でこれらの手順を実行することをお勧めします。また、オートクレーブ手術ツールのいずれかを使用するには、子犬は70％エタノールを使用してと接触する表面を殺菌する。移植を実行するために必要な代表的な装置および手順の代表領域の一例を図3に示されている。

注：この手順は、小容量の注入ではなく、切開、開いた傷や縫合を必要とする外科的処置であるが、それはまだ、各マウスが注入されるために新しいマイクロピペットを使用することをお勧めします。密閉容器に格納され、70％エタノールを噴霧した面上に引っ張られたときに面取りマイクロピペットは、熱滅菌である。

1. 40〜80ミクロンの間に先端の直径を有するようにマイクロピペットを生成します。これらの寸法に従うことで、最適得られます結果。ヒート引っ張られたときにマイクロピペットを殺菌し、表面に面取りし、密封容器にマイクロピペットを格納する前に、70％エタノールでスプレー。
   注：（ 表2）、これらの針を作成するために必要なデバイスへのアクセスを制限する場合、代わりに任意の他の注入装置を使用する。しかし、これらは、異なる直径のためにマイクロピペットとして同様に適していないかもしれない。
2. 1mlシリンジに鉱油を策定し、30 1/2 Gの針を、鉱油で完全にガラスピペットを埋める。次に、プランジャー上に定位デバイスと負荷にガラスピペットを取り付けた後、定位固定装置にプランジャーをマウントします。油圧駆動装置を用いて、ガラスピペットに約半分のプランジャを移動させる、きれいな清潔なペーパータオルでこぼれ鉱物油を除去する。
   1. あるいは注射器を使用して、鉱油中ピペットの後端を水没し、毛管作用により充填。 pipett中の気泡を防止するためにE、完全にガラスピペットの外まで注射器の正圧を維持する。
      注：他のデバイスが正常にMGE細胞^14を移植するために使用することができる。この手順のためにもボリューム以下近い100 NLの作品を提供することができます任意のデバイス。
3. 次に、微妙にMGE細胞ペレットの上に余分なメディアを削除するには細かい点にねじれコーナーで、無菌のペーパータオル、または任意の吸収性材料を使用しています。このステップは、より小さな注入体積を達成することができるように、細胞密度を集中させる。次に、ゆっくりと細胞ペレットを策定し、疎水性表面上に細胞懸濁液を移動する前に1〜2回粉砕するために、ピペット（P2が好ましい）低容量を使用しています。ボリュームは、すぐ下に1μLにする必要があります。細胞懸濁液に針の先端を移動し、油圧ドライブを使用して、ピペットに細胞懸濁液を策定する。
4. （ラテックス手袋で包んで〜2-4分間氷上に置く）低体温を経由して、P1の子犬を麻酔し。侵害刺激による麻酔の有効性を確認してください。細かい鉗子で指の間の皮膚をつまん：挟まれた場合に子犬が応答しなければならない。次に、頭の上に皮膚を引き戻すと、標準的な実験用テープで固定することにより、肌がピンと張っ作るその後、注入装置の下にある金型の上に子犬を置く。
   注：低体温、低死亡率の新生仔マウスと結果に非常に効果的であるが、手続きを迅速に行う必要があり、子犬は10分の下で回復し始めますように。加えて、氷上で4分間は、許容可能なものの上限である。より長い時間が注射に必要な場合に一度だけ低体温を誘導してみてください。しかし、子犬が早期に回復した場合、最初の子犬を再び完全に低体温症を誘発する前に回復することができます。また、唯一の注入を実行するための低体温をもう一度引き起こす。子犬は、低体温の5〜10分以内に回復します。これは、ゴミやママと子犬を置くことによって、または温surfacに子犬を配置することによって容易にすることができるeは回復する。
5. 定位固定装置を用いて、ヘッドの表面に対して垂直に、子犬の頭の面にガラスピペットの先端を位置決めする。ピペットヘッドに接触しているときは、「0」として、これを考慮する。次に、挿入した後、皮質への皮膚と頭蓋骨の表面を通ってピペットを押して停止する前に1〜2回ピペットを撤回。マイクロピペットは、0.1mmの深さにあるときに新皮質への細胞の最適な標的化のために、注射が行われる。しかし、これは、ユーザーが最適化されるべきである（下記の注を参照のこと）。
   注：この深さは確実に、上記のデバイスとのより深い新皮質層をターゲットにしている間、いくつかの深さは、経験的に決定テストする必要があります。また、別の吻側 - 尾及び内外方向位置の深さの範囲は、各サイトで最適なものを深さを決定するためにテストする必要があります。新皮質にゆっくり浸透​​がCに能力を減少させるように。また、初期のパンクは、迅速であるべきであるleanly組織を貫通する。最初の最適なものを見つけるために、この手順を開始する際に異なる速度を試してみてください。染料は、位置を示すために信頼できていたようにまた、検査座標の、標識された細胞を使用するための本当の代替物は存在しない。
6. 針が所定位置になったら、皮質への細胞懸濁液の設定容積を押し、ガラスピペット内にプランジャを前進させる油圧装置を回転させる。サイトごとに50〜70 NLSを注入。目標は、新皮質全体の細胞の広い分布を得ることである場合は、別の吻側 - 尾側レベルでの3-6の異なる部位で、この手順を繰り返します。
   注：100 nlの以上のボリュームは、病変を引き起こし、効率的に注射部位から移動することができない注入された細胞の大きな塊をもたらすことができる。このように、より小さな注入量（〜70 NL以下）は、時間が許せば複数のサイト上で、最適である。
7. 注射が完了すると、つま先のクリッピングは、pを識別するための信頼性の高い方法である（段階から子犬を削除し、それをマーク後でUPS）。子犬を回収し、自力で移動することができるしたら、ママとごみとそれを元に戻す（これは段階からそれらを除去する分以内に起こる）。
   注意：これは低侵襲的処置であることから子犬が自由に移動して温められたら何手術後の手順ではありません。しかし、子犬は、彼らが健康状態の悪化の兆候がない保証するために、手順の後だけでなく、次の日だけでなく、チェックする必要があります。
8. 次の子犬に手順を開始する前に、無菌の作業領域を維持するために、70％エタノールでエリアを下にスプレー。注入された子犬を開発し、適切な発達段階（s）で組織を評価できるようにする。

結果

MGE細胞は¹⁶新皮質宿主に移植する際の移行と統合するためのユニークな能力を持っているので、それらはin vivo試験の前に遺伝子操作のための優れたモデルシステムを提供する。ここで、我々はその後、インビボ研究のために、移植前にインビトロまたは迅速な方法のいずれかにおいてレンチウイルスで形質導入することができます（ 図1,2）、1はE13.5?...

ディスカッション

細胞ベースの治療のための胚性神経節隆起（GES）からGABA作動性皮質介在ニューロンの前駆体の使用は、多くの条件^{12 -1 4}のための約束を示している。正確な分子技術を追跡し、特定のニューロンのサブグループ内の対象の遺伝子を発現するために必要とされる。ここでは、移植前にレンチウイルス胚MGE細胞を標識するための詳細なプロトコルを提供し、この技術は、 インビボでの<...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and equipment for MGE cell transplantation
1 ml syringe	REF 309602	BD, Becton Dickinson and company
30 1/2 G needle	305106	BD, Becton Dickinson and company
Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger)	5-000-1005	Drummond scientific company
Parafilm	PM-999	Polysciences, Inc.
Stereo microscope with boomstand **	MZ6	Leica
Digital just for mice stereotaxic instrument **	51725D	Stoelting company
Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator **	MO-10	Narishige
Diamond coated rotary beveler		made in house
Needle pipette puller	730	Kopf instruments
Mineral oil		Any drug store or pharmacy
Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume
** These are the particular models we use, but many other setups should work
Optional Reagents (for making Lentiviruses)
25 mm, 0.45 µm filter	09-719B	Fisher Scientific
Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm)	344058	Beckman Coulter®
Lipofectamine 2000 (1.5 ml size)	11668019	Invitrogen
Other commercially available supplies
pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol	12251	Addgene
pRSV-Rev plasmid encoding Rev	12253	Addgene
pMD2.G plasmid encoding VSVG	12259	Addgene
pAAV-Flex-GFP	28304	Addgene