Viral-vermittelte Kennzeichnung und Transplantation von Medial Ganglienhügel (MGE) Zellen für<em&gt; In-vivo-</em&gt; Studien

Zusammenfassung

GABAerge kortikalen Internvorläuferzellen zu verteilen, zu entwickeln und synaptisch in eine Wirtsrinde nach der Transplantation zu integrieren. Diese Zellen können leicht vor der Transplantation für in vivo-Studien mit gentechnisch veränderten GABAerge Vorläufer transduziert werden. Hier zeigen wir virale Markierungstechniken auf bestimmte Interngruppen mit bestehenden Linien und Cre Cre-abhängigen Reporter Ziel.

Zusammenfassung

GABAerge kortikale Inter, aus dem embryonalen medialen und kaudalen Ganglien Eminenzen (MGE und CGE) abgeleitet ist, sind funktionell und morphologisch vielfältig. Eingriffe in das Verständnis der Rolle der unterschiedlichen kortikalen Interngruppen hergestellt worden ist, aber es gibt immer noch viele Mechanismen ausgearbeitet werden, die zur Entwicklung und Reifung von verschiedenen Arten von GABAergen Zellen beitragen können. Darüber hinaus kann verändert GABAergen Signalisierung an Phänotypen von Autismus, Schizophrenie und Epilepsie beitragen. Spezifische Cre-Treiberleitungen begonnen, parzellieren die Funktionen einzigartige Interngruppen. Trotz der Fortschritte in Maus-Modellen, ist es oft schwierig, GABAergen kortikalen Intern Progenitoren effizient Studie mit molekularen Ansätzen in vivo. Eine wichtige Technik verwendet, um die Zelle autonom Programmierung dieser Zellen zu studieren, ist die Transplantation von MGE Zellen in Wirts Rinden. Diese transplantierten Zellen wandern ausführlich, zu differenzieren, einend funktional zu integrieren. Zusätzlich kann MGE Zellen effizient mit Lentivirus unmittelbar vor der Transplantation transduziert werden, so dass für eine Vielzahl von molekularen Ansätzen. Hier werden wir ausführlich ein Protokoll zu MGE-Zellen effizient zu transduzieren vor der Transplantation für die in vivo-Analyse, unter Verwendung verfügbarer Cre-Treiberleitungen und Cre-abhängigen Expressionsvektoren. Dieser Ansatz ist vorteilhaft, weil sie vereint präzise genetische Manipulation die Fähigkeit dieser Zellen nach einer Transplantation zu dispergieren, der eine größere Zelltyp-spezifische Auflösung in vivo.

Einleitung

GABAerge kortikalen Interneuronen umfassen ~ 20-30% der Neuronen im Säuger-Neocortex, der Rest entsprechen, glutamatergen Neuronen Haupt exzitatorischen. Inter sind sehr unterschiedlich in elektrophysiologischen Eigenschaften, Axon und Dendriten Morphologie und synaptischen Ziel ¹ und Ungleichgewichte in exzitatorischen / hemmende Ton werden die Hypothese aufgestellt, einige Phänotypen der neurologischen / neuropsychiatrische Störungen einschließlich Autismus, Schizophrenie und Epilepsie ² zugrunde liegen. Das Gesamtziel des hierin beschriebenen Protokolls ist es, eine Einrichtung zu GABAergen kortikalen Intern Progenitoren vor der Transplantation in vivo Analysen effizienter genetisch zu verändern ist.

Kortikale GABAergen Interneuronen sind in den medialen und kaudalen Ganglien Eminenzen (MGE und CGE, beziehungsweise) ^3,4 sowie die präoptischen Bereich ⁵ geboren. Kortikale Intern Vorfahren unterziehen Fern tangentiale Migration gefolgtdurch radiale Migration ihrer endgültigen Ziele zu erreichen. Nach der Ankunft am Zielort, müssen diese kortikale Inter richtig in die bestehende neuronale Netzwerk zu integrieren, und jedes einzelne Interngruppe wird auf kortikale Schaltkreise in spezifischer Weise bei. Vier Hauptgruppen können durch molekulare Marker unterscheiden: MGE-abgeleitete Somatostatin (SST) ⁺ und Parvalbumin (PV) ⁺ Untergruppen und CGE-abgeleitete vasoaktive intestinale Peptid (VIP) ⁺ und Reelin ^+, SST ^{- 6} Untergruppen. Verschiedenen kortikalen Interngruppen werden über verschiedenen Zeiten während der Embryonalentwicklung im MGE und CGE ^{7, 8} getragen. Diese und andere kortikalen GABAergen Intern Marker wurden verwendet, um spezifische Cre-Treiberleitungen für viele dieser Untergruppen ^9-11 zu erzeugen.

Die Transplantation von MGE Vorfahren hat als potenzielle zellbasierte Therapie zu Störungen, die durch Ungleichgewichte verursacht werden können, zu behandeln tauchtin Anregungs- / Hemmung ^12-24. Diese therapeutische Nutzen kann zum Teil auf der einzigartigen Fähigkeit von MGE Vorfahren (zu zerstreuen, zu differenzieren und in eine Wirts Gehirn integriert) oder möglicherweise, weil viele Rand somatischen hemmende PV ⁺ Zellen aus dem MGE abgeleitet sein. MGE Zellen können auch schnell und effizient mit Lentiviren vor der Transplantation ¹⁵ transduziert, so dass Zellen, die in vitro genetisch modifiziert sind, um in vivo untersucht werden. Der Grund für die Entwicklung dieses Ansatzes war es, Hindernisse bei der Untersuchung GABAergen kortikalen Intern Entwicklung und Reifung zu überwinden. Insbesondere erlaubt MGE Transplantation Forscher die Entwicklung von mutierten Zellen in vivo zu untersuchen, wenn das mutierte Maus sonst haben starb in einem frühen Zeitpunkt. Weiterhin kann durch die Einführung von Genen von Interesse vor der Transplantation, die Auswirkungen spezifischer Gene auf einem mutierten Phänotyp könnte in einer eff beurteileniziente Weise.

Hier bieten wir ein ausführliches Protokoll zu MGE Zellen mit Lentiviren vor der Transplantation zu transduzieren. Darüber hinaus zeigen wir, wie diese Technik angepasst werden, um ein Gen von Interesse an bestimmten Interngruppen aus einer heterogenen Gruppe von kortikalen Intern Vorläufer zu exprimieren, mit einer Kombination von Cre-abhängige Expression Lentiviren und verfügbare Cre-Treibermauslinien. Außerdem führt dieses Protokoll Techniken und eine Plattform für Forscher auf genetisch GABAergen kortikalen Intern Vorstufen zur in-vivo-Studien zu modifizieren in einer einzigartigen Weise. Ein Vorteil dieser Technik gegenüber anderen aktuellen Ansätzen ist, dass die transplantierten Zellen MGE wird von der Injektionsstelle zu zerstreuen. Auch im Gegensatz zu Schwervirusinjektionen nach MGE Zellen verteilen ihre Morphologie ist leichter zu beurteilen. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um den Effekt der Einführung von Genen von Interesse in Wildtyp- oder mutierte Zellen, die Einführung eines Zelltyp-spezifische studierenReporter Morphologie beurteilen, oder potentiell, um die Wirkung des Krankheits Allele in vivo zu studieren.

Protokoll

Ethics Statement: Die folgenden Verfahren wurden von unserer Institution und Tier Protokoll genehmigt. Achten Sie darauf, die Genehmigung für alle Verfahren, die das Überleben Operationen vor Beginn der Experimente erhalten und sicherzustellen, dass alle Protokolle sind auf dem neuesten Stand.

1. Lentivirus Vorbereitung (Optionaler Schritt)

1. Aufgeteilt drei 10 cm-Platten von HEK293T Zellen für jede Lentivirus vorgenommen werden soll, in Gegenwart von 10 ml DMEM / 10% FBS, und wachsen auf ~ 60-70% Konfluenz. Wachsen Zellen in einem Brutschrank bei 37 ° C mit 5% CO _2.
2. Transfizieren folgende DNA-Plasmide (10 ug gesamt) in jeder Platte mit jeder Transfektionsreagenz: 6,4 ug CAG-Flex-GFP lentiviralen Vektor (DNA-Vektorsequenz in Tabelle 1), 1,2 ug pMD2.G (kodiert für VSV-G), 1,2 ug pRSV-Rev und 1,2 ug pMDLg / pRRE. Die drei lentiviralen Verpackungsvektoren sind im Handel erhältlich (Tabelle
   Hinweis: Dieser besondere Ansatz nutzt Generation lentivir 3.al-Vektoren, aber der 2. Generation Vektoren und die zugehörigen Plasmide wird auch funktionieren.
3. Bereiten Sie einen Abfallbehälter, der eine 10% Bleichmittel-Lösung in einem BSL2 zertifiziert Haube, alle Lösungen oder Geräte, die kontaktiert oder enthalten Lentivirus inaktivieren. Als nächstes vollständig nach der Transfektion in die Bleichlösung der Medien 4-6 h zu ersetzen mit dem gleichen Volumen der neuen Medien und damit die Zellen zu wachsen.
4. Nach 4 Tagen gesammelt Medium in 50 ml konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 1.000 × g für 15 min, um jede Zelltrümmer zu pelletieren. Als nächstes Den Überstand durch ein 0,45 um Membran. Jede niedrige Proteinbindungsfilter, wie PVDF, funktioniert gut. Achtung: Ort fester und flüssiger Abfälle in die virale Bleichlösung.
5. Last 30 ml filtrierte Überstand in Ultrazentrifugenröhrchen und in einer Ultrazentrifuge. Zentrifugieren bei 100.000 · g für 2,5 h bei 4 ° C. Öffnen Sie die Zentrifugenröhrchen in einem BSL2 Kapuze und Überstand zu entfernen, in 10% Bleichmittel. In ~ 100 ul PBS in die pellet, die Titer von 1x10 ^ 7-8 infektiösen Einheiten / ml ergibt. Aliquot am nächsten Tag und bei -80 ° C. Lentivirus Aliquots bei -80 ° C für mindestens sechs Monate stabil.
6. Wichtiger Aspekt: ​​Viele Institutionen haben jetzt Viruskerne. Erwerben Sie konzentrierte Virus mit einer minimalen Titer von 1x10 ⁷ infektiöse Einheiten / ml, für optimale Ergebnisse.

2. Spender Mäuse für MGE Dissection

1. Erstens, die Einrichtung eines zeitlich Paarung zwischen einem Cre-exprimierenden Linie von Interesse und entweder ein Wildtyp (WT) Maus oder einer Maus, die ein Reporter nach Cre-vermittelte Rekombination äußern wird.
   Hinweis: Viele Cre-Treiberleitungen sind Transgenen und eingehalten werden und in der hemizygot Zustand gezüchtet. Daher wird nur die Hälfte der Embryonen des Cre-Transgen enthalten. DNA kann schnell aus den Embryos für eine kurze PCR, um die Cre-Allel erkennen, hergestellt werden. Die Cre ⁺ Embryonen können dann geerntet, so daß nur die MGE Gewebe des gewünschten Genotyps verwendet wird. Alternatively kann eine Cre-abhängigen Reporter verwendet werden, um die Embryonen für MGE Dissektion und Transplantation zu wählen.
2. Berechnen Sie, welcher Tag um E13.5 entsprechen wird. Wenn Tiere wurden am Abend vor dem gepaarten, dem Tag des Stopfens ist 0,5. Bestellen timed-trächtigen Mäusen oder ein WT Weibchen mit Jungtieren P1, um Zeit mit der postnatalen (P) 1-Mäusen am Tag das Spendergewebe wird E13.5 sein. Alternativ können Sie sich diese Paarung im Haus eine Woche vor der Spendertiere Paarung.
   Hinweis: Die erste Strategie zur Erzeugung von sowohl E13.5 Embryonen und P1 / Welpen am gleichen Tag ist oft schwierig, zuverlässig zu tun.

3. Herstellung der Medien, Geräte und Zubehör.

1. Bereiten Sie die Reagenzien und Instrumente für MGE Zellpräparation (Tabelle 2).
   1. Bereiten Sie eine saubere Fläche und legen sauber Zangen, Scheren und entweder ein mikro Messer oder einer feinen Pinzette (genaue Gewebedissektion) auf der Oberfläche.
   2. Bereiten Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS), foder Dissektion und Dulbeco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinder Surem (FBS), für die Transduktion.
   3. Vorinkubieren 20-30 ml DMEM / 10% FBS in einer 37 ° C Brutschrank für ca. 1 Std. Der Deckel sollte gelöst werden, um für den Gasaustausch und pH-Äquilibrierung des Mediums zu ermöglichen.
      Hinweis: Die Medien Vorinkubation kann nur vor dem Start der Präparation vorbereitet werden.

4. MGE Zellpräparation

1. Opfern die schwangere Maus nach einer genehmigten Tier Protokoll und entfernen Sie die Embryonen in einer 10 cm Petrischale mit eiskaltem HBSS.
2. Entfernen Sie das Gehirn von jedem Embryo mit einem Binokular (gehen Sie zu einer Zeit, so dass der Rest der Embryonen in eiskaltem HBSS) und fahren Sie dann schneiden Sie die MGE Gewebe.
   Hinweis: Detaillierte unten und in Abbildung 1 sind die Schlüsselschritte zeigt, wie die MGE entfernen. Zusätzlich ist, Figur 2 ein Film, die die gesamte PräparationVerfahren.
   1. Positionieren Sie das Gehirn mit Bauchseite nach oben (1A, A '). Hinweis: Es ist auch in Ordnung, haben die dorsalen nach oben zeigt. Schneiden Sie das Gehirn in der Hälfte entlang der Sagittalebene, zwei Stücke zu erzeugen. Ein Beispiel hemiseziert Gehirn gezeigt (1B, B '), feststellen, dass die dorsale (die darüber liegende Hirnrinde) und ventralen Aspekte des Gehirns Abdeckung und umgeben den Ganglienhügel (GE) Gewebe.
   2. Als nächstes wird mit einem dominanten Hand, halten Sie eine sehr feine Pinzette oder eine stabknife (Tabelle 2), während die Immobilisierung der Halbkugel mit einer Pinzette von einem nicht-dominanten Hand. (Medialen Seite der Hemisphäre sollte nach oben). Klappen Sie den dorsalen und ventralen Gewebe mit einer Zange und einen Stich Messer, um die zugrunde liegenden GE Gewebe (1C und 1C 'schematisch dargestellt) zu offenbaren.
      Hinweis: Das Entfernen einige Medien aus dem Sezieren Petrischale können es einfacher machen, um das Gewebe zu stabilisieren, während performing den MGE-Dissektion.
   3. Stellen Sie gerade Schnitte mit dem stabknife oder feinen Pinzette, um die CGE, LGE und Scheidewandgewebe zu trennen (siehe Beispiel Schnitte durch das rote Symbol gestrichelten Linien, Figuren 1D und D '). Diese Schnitte können in beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden.
      Hinweis: Stellen Sie sich die MGE als "Box", die aus dem umgebenden Gewebe geschnitten wird. Dies hilft reproduzierbar machen ähnliche Schnitte für jede Sektion, wodurch Schwankungen der Gewebe Dissektionen reduzieren.
   4. Schließlich drehen Sie das MGE auf die Seite und schneiden Sie die Unterseite (was war der lateralen Seite des Gehirns). Dadurch wird die Mantelzone des MGE (verwerfen in 1E und 1E ') von dem Rest der MGE. Die verbleibende Aspekt MGE enthält in erster Linie ventrikulären Zone und Subventrikularzone Teile der MGE, die fast alle MGE Vorläuferzellen enthält. Fahren Sie mit diesem Gewebe.
3. Wichtige Überlegung: Die Zugabe von Silikon-Gel auf dem Boden einer Petrischale can dienen als hervorragende Präparation Oberfläche schützt die empfindlichen Spitzen der Pinzette und bietet eine weiche Unterlage für Pinning Gewebe mit einer Pinzette.

4.3 Weitere Strategien für MGE Dissection.

1. Schneiden Sie die Haut des Embryos mit einer Pinzette wie eine Schere, um das Gehirn schnell zu entfernen. Da der Embryo legt auf seiner Seite, halten das Gewebe an der Basis des Kopfes mit den zur Herstellung des Gewebeankers Pinzette. Zuerst schneiden vordere Bauch zum Gehirn und hinteren Bauch an das Gehirn, und schließen Sie dann die zwei Schnitte entlang der Seite des Embryos. Dann ergreifen Sie die Klappe der Haut und ziehen Sie sie über die Oberseite des Gehirns. Das Gehirn kann dann schnell von dem verbleibenden Gewebe befreit werden.
2. Alternativ Verankerung des hinteren Teil des gesamten Gehirns hinter dem Kortex. Inzwischen greifen jede Hemisphäre am meisten dorsalen Schwanz Aspekt der Rinde und reißen die Rinde vom verankerten Gewebe in eine Richtung nach vorne. Auf diese Weise werden sowohl cortices kann entfernt werden, und die bilateralen ganglionic Ballen enthüllt werden, noch mit dem Rest der Erhaltung der medial-lateralen Anatomie Gewebe befestigt.
3. Wechseln Sie in die Stich Messer, um präzise Schnitte auf der MGE auf jeder Hemisphäre leisten. Verwenden Sie entweder eine separate saubere Reihe von Pinzette, um die MGE oder einer Pipette mit einer großen Spitze (dh., P1000) zu sammeln.
   Hinweis: Bewahren Sie die gesammelten Gewebe weg von allen anderen seziert Material, wie einige Medien unvermeidbar übertragen, wenn der MGE gesammelt.
4. Sammeln Sie die MGE und legte das Gewebe in ein 1,5 ml Sammelröhrchen, das DMEM / 10% FBS, (ein Volumen von 500 ul ausreicht, um die MGEs sammeln). Wiederholen Sie für die andere Halbkugel und in der gleichen Sammelröhrchen. Halten Sie Proben auf Eis, bis alle Gewebe gesammelt.

5. Lentivirale Kennzeichnung und Transplantation

1. Bewegen Sie die Röhren von MGE Gewebe in einem BSL2 zertifiziert Haube und entfernen Sie die Medien.
   Hinweis: DasMGE Gewebe ist groß genug für das Auge sichtbar zu sein, und wird zu dem Boden des Rohrs so dass für die kalten Medien leicht und schonend entfernt absetzen.
2. Hinzufügen ~ 500 ul DMEM / 10% FBS-Medium, wurde diese in einem 37 ° C Brutschrank vorinkubiert. Als Nächstes fügen Polybren Transduktion in jedes Röhrchen auf eine Endkonzentration von 8 & mgr; g / ml zu erleichtern. Man reibt die MGE Gewebe, um eine Einzelzellsuspension zu schaffen, mit einem P1000 Pipettenspitze. Schließlich fügen ~ 15-20 ul konzentrierter Lentivirus in jedes Röhrchen.
3. Wichtige Überlegung: Ein Verreiben 10-12 mal reicht aus, um von einem einzigen Embryo brechen MGE Gewebe, aber mehr Verreibungen erforderlich, wenn mehrere MGEs werden vereinigt werden. Probieren Sie verschiedene Verreiben Bedingungen, um festzustellen, was am besten funktioniert.
4. Sicher in einem 37 ° C Inkubator schließen jedes Rohr, kehren zu mischen, als Ort, alle Rohre. Inkubieren der Zellen in Lentivirus für mindestens 30 min und bis zu 1 Stunde. Längere Zeiten haben in de FolgeFalten Lebensfähigkeit der Zellen. Drehen Sie die Rohre alle 10 Minuten, bis die Zeit abgelaufen ist.
5. Nach der Inkubation mit Lentiviren, entfernen Sie die Rohre aus dem Brutschrank und Zentrifuge bei ~ 700 xg für 3 Minuten, um die Zellen zu pelletieren. In der BSL2 Haube, den Überstand verwerfen und in 10% Bleichmittel. Als Nächstes fügen Sie 1 ml DMEM / 10% FBS und verreiben das Pellet 2-3 Mal zu waschen, dann zentrifugieren wieder mit der gleichen Geschwindigkeit, um die Zellen zu pelletieren. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 2-3 weitere Male, um überschüssige Virus zu entfernen.
   Anmerkung: Führen Zentrifugationsschritte bei 4 ° C, aber eine verminderte Lebensfähigkeit wurde nicht beobachtet, wenn kurze Spins bei RT.
6. Nach dem letzten Waschen, entfernen Sie so viel wie möglich zu Medien und legte jedes Röhrchen auf Eis. Aufgrund von Restmedium an den Seiten des Rohrs, ~ 2-3 ul Medium wird am Ende für den Zellpellets durch die Zeit der Transplantationsverfahren begonnen.

6. Transplantation und Validierung

1. Erwerben Host P1 Welpen und bereiten das VerfahrenBereich durch Spritzen nach unten mit 70% Ethanol. Um die Sterilität während des Verfahrens aufrecht zu erhalten, wird empfohlen, diese Verfahren in einem speziellen Reinraumverfahren durchzuführen. Darüber hinaus verwenden entweder autoklaviertem chirurgische Instrumente sterilisieren Oberflächen, die Welpen werden in Kontakt mit mit 70% Ethanol. Ein Beispiel eines repräsentativen Geräte benötigt, um die Transplantation und ein repräsentatives Verfahren Bereich durchzuführen, ist in 3 gezeigt.

Hinweis: Obwohl dieses Verfahren eine Einspritzung von kleinen Volumina, und nicht ein chirurgisches Verfahren, ein Einschnitt, offene Wunden oder Nähte erfordern würde, wird es immer noch empfohlen, dass ein neuer Mikropipette wird verwendet für jede Maus injiziert werden. Die Mikropipetten Hitze sterilisiert, wenn es gezogen und auf einer Oberfläche, die mit 70% Ethanol in einem versiegelten Behälter gelagert gesprüht wurde abgeschrägt.

1. Generieren Mikro einen Durchmesser an der Spitze zwischen 40-80 um haben. Im Anschluss an diese Dimensionen wird eine optimale AusbeuteErgebnisse. Wärmesterilisation der Mikropipetten, wenn er gezogen und auf einer abgeschrägten Oberfläche und Spray mit 70% igem Ethanol vor der Lagerung der Mikropipetten in einem versiegelten Behälter.
   Hinweis: Alternativ, wenn Zugang zu den notwendig, um diese Nadeln zu erstellen (Tabelle 2) Geräte zu begrenzen, verwenden Sie eine andere Injektionsvorrichtung. Diese können jedoch nicht so gut geeignet, wie die Mikro aufgrund unterschiedlichen Durchmessern sein.
2. Erstellen Sie Mineralöl in einer 1 ml Spritze und mit einem 30 1/2 G Nadel, füllen Sie die Glaspipette vollständig mit Mineralöl. Anschließend montieren Sie den Kolben auf den stereotaktischen Gerät und dann das Glaspipette zu der stereotaktischen Gerät und Last auf den Kolben. Mit dem hydraulischen Antrieb, bewegen Sie den Kolben etwa zur Hälfte in die Glaspipette, die Beseitigung Mineralöl, das mit einem sauberen einem sauberen Papiertuch heraus schwappt.
   1. Alternativ zur Verwendung einer Spritze, tauchen das hintere Ende der Pipette in Mineralöl und durch Kapillarwirkung gefüllt. Um Luftblasen in der pipett verhinderne, aufrechtzuerhalten positiven Druck auf die Spritze, bis sie vollständig aus dem Glaspipette.
      Hinweis: Andere Geräte können verwendet werden, um erfolgreich zu trans MGE Zellen ¹⁴ werden. Jedes Gerät, das ein Volumen von weniger als oder in der Nähe von 100 nl funktioniert gut für dieses Verfahren liefern kann.
3. Als Nächstes verwenden Sie einen sterilen Papiertuch oder ein absorbierendes Material, mit der Ecke in einer feinen Spitze verdreht, um zart zu entfernen überschüssige Medien über der MGE Zellpellet. Dieser Schritt konzentriert das Zelldichte, die für kleinere Einspritzmengen erzielt werden kann. Als Nächstes verwenden Sie ein geringes Volumen (P2 bevorzugt) Pipette langsam erarbeiten das Zellpellet und verreiben 1-2 mal, bevor die Zellsuspension auf eine hydrophobe Oberfläche. Das Volumen sollte knapp 1 ul sein. Bewegen Sie die Spitze der Nadel in die Zellsuspension und mit dem hydraulischen Antrieb, Erstellung der Zellsuspension in die Pipette.
4. Betäuben eine P1 Welpen über Hypothermie (wickeln Sie in einem Latex-Handschuh und steckte auf Eis ~ 2-4 min).Überprüfen Sie die Wirksamkeit der Anästhesie mit einem schädlichen Reiz. Klemmen Sie die Haut zwischen den Zehen mit feinen Pinzette: der Welpe sollte nicht mehr reagiert, wenn eingeklemmt. Als nächstes legen Sie den Welpen auf eine Form, die im Rahmen der Injektionsvorrichtung ist, dann machen die Haut durch Zurückziehen des Haut auf dem Kopf und die Sicherung mit Standard-Labor Band straff.
   Hinweis: Während der Hypothermie ist sehr effektiv bei neugeborenen Mäusen und führt zu einer geringen Sterblichkeit müssen Verfahren schnell durchgeführt werden, wie Welpen beginnen, unter 10 Minuten erholen. Zusätzlich 4 min auf Eis ist eine obere Grenze dessen, was tolerierbar ist. Versuchen, Hypothermie nur einmal induzieren, wenn eine längere Zeit für Injektionen erforderlich. Allerdings, wenn ein Welpe wieder früh, zunächst damit der Welpe in vollem Umfang vor dem erneuten Induktion von Hypothermie erholen. Zudem ist nur veran Hypothermie ein weiteres Mal, um Injektionen durchzuführen. Welpen werden innerhalb von 5-10 min an Unterkühlung erholen. Dies kann durch die Welpen mit Einstreu und Mama oder indem Sie den Welpen an einem warmen surfac erleichtert werdene sich zu erholen.
5. Mit Hilfe eines stereotaktischen Gerät, positionieren Sie die Spitze der Glaspipette auf der Oberfläche auf den Kopf des Welpen, senkrecht auf der Oberfläche des Kopfes. Wenn die Pipette ist in Kontakt mit dem Kopf, betrachten dies als '0'. Als nächstes drücken Sie die Pipette durch die Oberfläche der Haut und Schädel in die Rinde, dann Ein- und Ausfahren von Pipetten ~ 2 Mal vor dem Anhalten. Für eine optimale Ausrichtung der Zellen in der Großhirnrinde, sind Injektionen durchgeführt, wenn die Mikropipette ist in einer Tiefe von 0,1 mm. Dies sollte jedoch durch den Anwender optimiert werden (siehe Hinweis unten).
   Anmerkung: Obwohl diese Tiefe zuverlässig zielt tiefer neokortikalen Schichten mit den oben beschriebenen Geräten sollte ein paar Tiefen getestet empirisch ermittelt werden. Darüber hinaus sollte ein Bereich von Tiefen, in unterschiedlichen rostro-kaudale und medio-lateralen Position geprüft, um zu bestimmen, welche die optimale Tiefe an jedem Standort werden. Auch sollte die anfängliche Punktion schnell sein, da langsame Eindringen in den Neocortex vermindert die Fähigkeit, cleanly in das Gewebe eindringen. Probieren Sie verschiedene Geschwindigkeiten beim ersten Start dieses Verfahren zu finden, was am besten funktioniert. Zusätzlich zum Testen von Koordinaten, gibt es keine echte Alternative für die Verwendung von markierten Zellen, wie Farbstoffe waren unzuverlässig bezeichnen Position.
6. Sobald die Nadel in Position ist, drehen Sie den hydraulischen Einrichtung, um den Kolben in die Glaspipette zu fördern und schob einen Satz Volumen Zellsuspension in die Rinde. Injizieren 50-70 nls pro Standort. Wiederholen Sie diesen Vorgang bei 3-6 verschiedenen Standorten in unterschiedlichen rostral-kaudale Ebenen, wenn das Ziel ist es, eine breite Verteilung der Zellen im ganzen Neokortex zu erhalten.
   Hinweis: Volumen von 100 nl oder höher können Verletzungen verursachen und zu große Klumpen von injizierten Zellen, die effizient von der Injektionsstelle Migration fehl. So kleineren Injektionsvolumina (~ 70 nl oder weniger) optimal sind, über mehrere Standorte, wenn es die Zeit erlaubt.
7. Bei Injektionen abgeschlossen sind, entfernen Sie die Welpen von der Bühne aus und markieren Sie ihn (Zehen Clipping ist ein zuverlässiger Weg, um die p identifizierenups später). Sobald der Welpe hat sich erholt und ist in der Lage, aus eigener Kraft bewegen (in diesem Fall innerhalb von Minuten von ihnen von der Bühne zu entfernen), setzen Sie ihn wieder mit der Mutter und Wurf.
   Hinweis: Da es sich um ein minimal-invasives Verfahren gibt es keine post-chirurgischen Verfahren, wenn die Welpen frei bewegt und erwärmt. Allerdings sollten Welpen überprüft werden, nicht nur nach dem Eingriff, sondern auch den folgenden Tag, um sicherzustellen, sie keine Anzeichen einer Verschlechterung der Gesundheit haben.
8. Vor dem Start des Verfahrens auf der nächsten Welpen, sprühen Sie den Bereich mit 70% Ethanol, um eine sterile Arbeitsbereich zu halten. Ermöglichen, dass die eingespritzte Welpen zu entwickeln und dann beurteilen die Gewebe an der entsprechenden Entwicklungsstufe (n).

Ergebnisse

Seit MGE Zellen haben die einzigartige Fähigkeit, Migration und Integration, wenn in eine Wirts Neocortex ¹⁶ transplantiert, bieten sie eine ausgezeichnete Modellsystem für die genetische Manipulation vor der in vivo-Studien. Hier zeigen wir, wie man MGE Gewebe von E13.5 Embryonen zu isolieren (1 und 2), die dann mit Lentiviren entweder in vitro oder in einer schnellen Art und Weise vor der Transplantation in vivo Studien transduziert werden kann. Labeling MGE üb...

Diskussion

Die Verwendung von GABAergen kortikalen Internvorstufen aus den embryonalen Ganglien Eminenzen (GES) für Zelltherapien ist vielversprechend für viele Bedingungen ^{12 -1 4.} Präzise molekulare Techniken sind erforderlich, um zu verfolgen und Express Gene von Interesse in bestimmten Interngruppen. Hier stellen wir ein ausführliches Protokoll zur Markierung embryonalen MGE Zellen mit Lentiviren vor der Transplantation, und zeigen, wie diese Technik verwendet werden, um Gene von Interesse in spezifischen kortik...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and equipment for MGE cell transplantation
1 ml syringe	REF 309602	BD, Becton Dickinson and company
30 1/2 G needle	305106	BD, Becton Dickinson and company
Precision bore to deliver 5 µl (comes with plunger)	5-000-1005	Drummond scientific company
Parafilm	PM-999	Polysciences, Inc.
Stereo microscope with boomstand **	MZ6	Leica
Digital just for mice stereotaxic instrument **	51725D	Stoelting company
Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator **	MO-10	Narishige
Diamond coated rotary beveler		made in house
Needle pipette puller	730	Kopf instruments
Mineral oil		Any drug store or pharmacy
Any pipette and tips that can reliaby measure 1 µl of volume
** These are the particular models we use, but many other setups should work
Optional Reagents (for making Lentiviruses)
25 mm, 0.45 µm filter	09-719B	Fisher Scientific
Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm)	344058	Beckman Coulter®
Lipofectamine 2000 (1.5 ml size)	11668019	Invitrogen
Other commercially available supplies
pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol	12251	Addgene
pRSV-Rev plasmid encoding Rev	12253	Addgene
pMD2.G plasmid encoding VSVG	12259	Addgene
pAAV-Flex-GFP	28304	Addgene