تطبيق للDNA محددة وصمة عار الميثيل الأخضر في بطاقات المواد الفلورية الأجنة

Summary

A method for fluorescent staining of fixed biological material with the specific DNA label methyl green is described. Methyl green is used in a diluted aqueous solution and is very resistant to photobleaching. Its far-red emission allows for deep specimen imaging, making it particularly adequate for whole embryos.

Abstract

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored until recently. In this article, we illustrate the method for preparing a methyl green aqueous stock solution, that when diluted can be used as a very convenient fluorescent nuclear label for fixed cells and tissues. Easy procedures to label whole zebrafish and chick embryos are detailed, and examples of images obtained shown. Methyl green is maximally excited by red light, at 633 nm, and emits with a relatively sharp spectrum that peaks at 677 nm. It is very inexpensive, non-toxic, highly stable in solution and very resistant to photobleaching when bound to DNA. Its red emission allows for unaltered high resolution scanning confocal imaging of nuclei in thick specimens. Finally, this methyl green staining protocol is compatible with other cell staining procedures, such as antibody labeling, or actin filaments labeling with fluorophore-conjugated phalloidin.

Introduction

Fluorescent staining of DNA is broadly and routinely used both in biological research and in clinical diagnosis, either for the detailed study of nuclear and chromosomal structure, for counterstaining tissues and cells, or for studying cell cycle parameters¹. Although several DNA stains are available, the most widely used have been those excited by UV light and emitting in blue, which fit in the usual three-filter systems used in most conventional epifluorescence microscopes when combined with green and orange-red-emitting fluorophores, such as fluorescent proteins or small molecules attached to antibodies. Among these blue-emitting DNA stains, the most common are DAPI and Hoechst minor groove-binding agents^2,3. Nonetheless, the incorporation of a wide variety of laser emission lines and spectral detection in laser scanning microscopes, has allowed researchers to choose for the use of far-red-emitting nuclear stains such as propidium iodide (PI) or TO-PRO 3⁴. An advantage of these stains is that they overcome the problem of autofluorescence found in many cells and tissues, particularly in embryos⁵, but many of them have different problems such as having wide emission profiles or being very sensitive to photobleaching⁶.

The Swiss researcher Friedrich Miescher discovered DNA in 1869, extracting it from the nuclei of white blood cells found in pus. He called it nuclein, and showed a few years later that it formed precipitates with the relatively new stain methyl green. Methyl green is composed by three aniline rings, with different degrees of methylation, and has two positive charges that allow it to strongly bind to the major groove of DNA^7,8. DNA staining by methyl green was very early shown to be specific, leading to the development by Unna and Pappenheim of a combined stain with pyronin, which specifically labels RNA. Methyl green-pyronin has since then been extensively used in routine histological technique⁹.

Until recently, very little was known about the fluorescent properties of methyl green. Our previous work, however, has uncovered some of methyl green spectral advantages⁶ such as its excitation at 633 nm, a convenient Stokes shift, its emission on the near-infrared portion of the electromagnetic spectrum, higher photostability than commercially available DNA stains with similar spectral properties and at a very low cost. This is why we decided to test it for being used as a very high affinity and specific fluorescent label for DNA on embryonic tissues and in whole embryos. Furthermore, until now methyl green nuclear staining was performed at low pH, making it difficult to combine with antibody staining. The goal of the method detailed here is to have a protocol for fluorescent nuclear DNA staining which overcomes the aforementioned inconvenience by performing the staining procedure at physiological pH, thus making it a suitable counterstain for immunolabeling on sections and whole tissues.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تنقية للصبغ

1. إعداد محلول مائي 4٪ من اللون الأخضر الميثيل عن طريق إذابة 0.4 غرام من مسحوق صمة عار في 10 مل من الماء المقطر. تخلط جيدا حتى يذوب تماما.
2. تحت الدخان غطاء محرك السيارة، ومزجها مع لا يقل عن 2 أجزاء من الكلوروفورم. من المهم التحقق مسبقا ما إذا كانت الأنابيب هي مقاومة الكلوروفورم.
3. تخلط جيدا وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 2000 x ج لتسريع مرحلة الانفصال.
4. بعد الطرد المركزي، ويتم الحصول على مرحلة العليا المائية مع الأخضر الميثيل ومرحلة العضوية أقل مع الكلوروفورم والمعتاد الملوثات الكريستال البنفسجي.
5. استرداد المرحلة العليا وكرر هذه الخطوة حتى تظهر المرحلة الدنيا خالية تماما من الكريستال البنفسجي.
6. في النهاية، يتم استرداد المرحلة العليا والمخفف في الماء لتركيز النهائي من 2٪ الأخضر الميثيل. هذا المحلول مستقر على طاولة العمل لشهور وليس من الضروري أن تكون محمية من الضوء.

"jove_title"> 2. الفلورسنت تلطيخ النووية من الجامعة الزرد الأجنة باستخدام الميثيل الخضراء

1. إصلاح الأجنة بين عشية وضحاها في 4٪ فورمالدهايد (من امتصاص العرق) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
   ملاحظة: هذا يمكن أن يستغرق من بضع ساعات ليلة وضحاها اعتمادا على سمك الأجنة. في المثال، فإننا الثابتة 48 ساعة بعد الإخصاب (HPF) الأجنة الزرد بين عشية وضحاها.
2. غسل الأجنة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني-T (1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني) لمدة 5 دقائق. تركيز مرتفع من المنظفات permeabilizes بشرة.
3. إعداد 1: 5،000-1: 10،000 حل الأخضر الميثيل (من 2٪ محلول المخزون) في برنامج تلفزيوني-T. وجود المنظفات أثناء الحضانة مفيد لعينات سميكة، مثل الأجنة الزرد واليرقات.
4. احتضان الأجنة في حل للا يقل عن 6 ساعة عند 4 درجات مئوية، مع هزاز لطيف. مرة أخرى، سمك الجنين المعلمة معايرة لمدة الحضانة.
5. غسل الأجنة 3 تيموفاق مع برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة لإزالة الزائدة المنظفات. الميثيل مخضر واضح فقط عند منضمة إلى الحمض النووي، وبالتالي الخلفية من جزيء غير منضم لا يكاد يذكر.
6. جبل على الشريحة حفرها أو غرفة محلية الصنع مع الحل تركيب (75٪ الجلسرين، 0.1 M تريس · حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8).
   ملاحظة: إذا كان تلطيخ النووي التي يتعين القيام بها بعد immunolabeling، يمكن إدراجها الأخضر الميثيل في حل المتصاعدة في تركيز العمل، دون الحاجة إلى غسله.
7. مخزن في الثلاجة أو بدء التصوير مباشرة. أداء التصوير مع متحد البؤر المسح بالليزر (أو مضان آخر) المجهر مع الإثارة في 633 نانومتر، والانبعاثات مجموعة المرشحات للتسجيل في 650-750 نانومتر مع الأخذ بعين الاعتبار أن الميثيل تصل الانبعاثات الأخضر الحد الأقصى في 677 نانومتر.
   ملاحظة: ونحن نقدم البيانات المقاسة من الميثيل الشخصي الانبعاثات الأخضر، ليتم تحميلها في البرنامج الاستحواذ، كمواد إضافية.

3. نيون سانت النوويةaining من الجامعة الفرخ الأجنة باستخدام الميثيل الخضراء

1. احتضان بيض الدجاج المخصب إلى مرحلة الاهتمام. إصلاح الأجنة بين عشية وضحاها في 4٪ فورمالدهايد (من امتصاص العرق) في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية. غسل الأجنة 3 مرات في برنامج تلفزيوني-T لمدة 2 ساعة.
2. إعداد 1: 5،000-1: 10،000 حل الأخضر الميثيل (من 2٪ محلول المخزون) في برنامج تلفزيوني-T. احتضان الأجنة في حل تلطيخ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. غسل الأجنة 3 مرات في برنامج تلفزيوني، 1 ساعة لكل منهما. جبل في غرفة مع 75٪ الجلسرين، 0.1 M تريس، ودرجة الحموضة 8.

4. التصوير Fluorescently المسمى النواة في الأجنة كامل محمولة

1. إعداد غرفة التصوير من خلال إصرارها عدة طبقات من شريط كهربائي على شريحة المجهر وبعناية قطع حفرة في ذلك مع مشرط لوضع الأجنة داخل. وهذا يمنع الأجنة من سحق أثناء التصوير.
2. نقل بعناية الأجنة إلى غرفة التصوير وملء الغرفة إلى الأعلى مع 75٪ الجلسرين، 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة = 8 لتشكيل فقاعة باطلة.
3. مع تغطية # 0 ساترة تجنب أو القضاء تفيض المتوسط. ختم ذلك بطلاء الأظافر.
4. الحصول على صور من العينة على المجهر مضان مجهزة تصفية 633 الإثارة أو خط ليزر.
   ملاحظة: يجب أن المرشحات الانبعاثات تغطية الحد الأقصى 677 انبعاث الأخضر الميثيل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تلطيخ النووي من عينات سميكة. بروتوكول الموصوفة هنا يسمح لتحقيق تلطيخ متجانس من البنى العميقة في أجنة كاملة. وصفت عدسة النوع النامية أنويتها 48 HPF الأجنة الزرد متجانس (الشكل 1).

الميثيل تلطيخ DNA الأخضر يسمح تمييز من دورة الخ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

The progressive development of microscopy techniques in the last decades, with a particular focus in variations of fluorescent microscopy, have led to the possibility of exploring the dynamics and structure of intact tissue samples, including whole embryos^10,11. One major limitation has been, however, the availability of good quality fluorophores that can be used to directly and quickly stain subcellular structures.

The most frequently used fluorescent DNA stains, such as DAPI or H...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Methyl green	Dr. G. Grübler		Also tested Sigma-Aldrich 323829, which is crystal violet-free
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5	Leica Microsystems
Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma-Aldrich	P1951
chloroform	Sigma-Aldrich	372978
Centrifuge 5810 R	eppendorf	5811 000.010
microscope slides	Deltalab	D100004
cover slips	Esco optics	R525025