Anwendung der DNA-spezifisches Färbemittel, Methyl Green in der Fluoreszenzmarkierung von Embryos

Zusammenfassung

A method for fluorescent staining of fixed biological material with the specific DNA label methyl green is described. Methyl green is used in a diluted aqueous solution and is very resistant to photobleaching. Its far-red emission allows for deep specimen imaging, making it particularly adequate for whole embryos.

Zusammenfassung

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored until recently. In this article, we illustrate the method for preparing a methyl green aqueous stock solution, that when diluted can be used as a very convenient fluorescent nuclear label for fixed cells and tissues. Easy procedures to label whole zebrafish and chick embryos are detailed, and examples of images obtained shown. Methyl green is maximally excited by red light, at 633 nm, and emits with a relatively sharp spectrum that peaks at 677 nm. It is very inexpensive, non-toxic, highly stable in solution and very resistant to photobleaching when bound to DNA. Its red emission allows for unaltered high resolution scanning confocal imaging of nuclei in thick specimens. Finally, this methyl green staining protocol is compatible with other cell staining procedures, such as antibody labeling, or actin filaments labeling with fluorophore-conjugated phalloidin.

Einleitung

Fluorescent staining of DNA is broadly and routinely used both in biological research and in clinical diagnosis, either for the detailed study of nuclear and chromosomal structure, for counterstaining tissues and cells, or for studying cell cycle parameters¹. Although several DNA stains are available, the most widely used have been those excited by UV light and emitting in blue, which fit in the usual three-filter systems used in most conventional epifluorescence microscopes when combined with green and orange-red-emitting fluorophores, such as fluorescent proteins or small molecules attached to antibodies. Among these blue-emitting DNA stains, the most common are DAPI and Hoechst minor groove-binding agents^2,3. Nonetheless, the incorporation of a wide variety of laser emission lines and spectral detection in laser scanning microscopes, has allowed researchers to choose for the use of far-red-emitting nuclear stains such as propidium iodide (PI) or TO-PRO 3⁴. An advantage of these stains is that they overcome the problem of autofluorescence found in many cells and tissues, particularly in embryos⁵, but many of them have different problems such as having wide emission profiles or being very sensitive to photobleaching⁶.

The Swiss researcher Friedrich Miescher discovered DNA in 1869, extracting it from the nuclei of white blood cells found in pus. He called it nuclein, and showed a few years later that it formed precipitates with the relatively new stain methyl green. Methyl green is composed by three aniline rings, with different degrees of methylation, and has two positive charges that allow it to strongly bind to the major groove of DNA^7,8. DNA staining by methyl green was very early shown to be specific, leading to the development by Unna and Pappenheim of a combined stain with pyronin, which specifically labels RNA. Methyl green-pyronin has since then been extensively used in routine histological technique⁹.

Until recently, very little was known about the fluorescent properties of methyl green. Our previous work, however, has uncovered some of methyl green spectral advantages⁶ such as its excitation at 633 nm, a convenient Stokes shift, its emission on the near-infrared portion of the electromagnetic spectrum, higher photostability than commercially available DNA stains with similar spectral properties and at a very low cost. This is why we decided to test it for being used as a very high affinity and specific fluorescent label for DNA on embryonic tissues and in whole embryos. Furthermore, until now methyl green nuclear staining was performed at low pH, making it difficult to combine with antibody staining. The goal of the method detailed here is to have a protocol for fluorescent nuclear DNA staining which overcomes the aforementioned inconvenience by performing the staining procedure at physiological pH, thus making it a suitable counterstain for immunolabeling on sections and whole tissues.

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Protokoll

1. Reinigung des Dye

1. Bereiten Sie einen 4% igen wässrigen Lösung von Methylgrün durch Auflösen von 0,4 g Fleck Pulver in 10 ml destilliertem Wasser. Gründlich mischen, bis sie vollständig gelöst wird.
2. Unter einer Abzugshaube, mischen Sie es mit mindestens 2 Teilen Chloroform. Es ist wichtig, vorher zu prüfen, ob die Rohre sind Chloroform beständig.
3. Gründlich mischen und zentrifugieren für 1 min bei 2.000 xg um die Phasentrennung zu beschleunigen.
4. Nach dem Zentrifugieren eine obere wässrige Phase mit Methyl-grün und eine untere organische Phase mit Chloroform und die üblichen Schadstoffkristallviolett erhalten.
5. Wiederherstellen der oberen Phase, und wiederholen Sie diesen Schritt, bis untere Phase völlig frei von Kristallviolett wird angezeigt.
6. Am Ende wird die obere Phase abgetrennt und in Wasser auf eine Endkonzentration von 2% Methylgrün verdünnt. Diese Stammlösung ist auf der Werkbank über Monate stabil ist und nicht den Inhalt vor Licht geschützt werden müssen.

2. Fluorescent Kernfärbung von Whole Zebrafischembryonen mit Methylgrün

1. Fixieren die Embryonen über Nacht in 4% Formaldehyd (aus Paraformaldehyd) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
   HINWEIS: Das kann von ein paar Stunden, um über Nacht abhängig von der Dicke der Embryonen. In dem Beispiel fest wir 48 Stunden nach der Befruchtung (HPF) Zebrafischembryonen über Nacht.
2. Dreimal 5 min waschen die Embryonen in PBS-T (1% Triton X-100 in PBS). Die erhöhte Konzentration des Reinigungsmittels permeabel die Nagelhaut.
3. Bereiten Sie eine 1: 5,000-1: 10.000 Lösung von Methyl-grün (2% Stammlösung) in PBS-T. Die Gegenwart von Detergens während der Inkubation ist nützlich für dicke Proben, wie Zebrafischembryonen und Larven.
4. Die Embryonen in der Lösung für mindestens 6 h Inkubation bei 4ºC unter leichtem Schütteln. Auch die Dicke des Embryos ist die Kalibrierparameter für die Dauer der Inkubationszeit.
5. Waschen Sie die Embryonen 3 times mit PBS für 30 min, um die Reinigungsmittelüberschuß zu entfernen. Methyl grüne Fluoreszenz ist nur offensichtlich, wenn die DNA gebunden ist, zu vernachlässigen ist somit Hintergrund von dem ungebundenen Molekül.
6. Berg auf einem ausgegrabenen Dia oder einem hausgemachten Kammer mit Montagelösung (75% Glycerin, 0,1 M Tris-HCl pH 8).
   HINWEIS: Wenn die Kernfärbung ist es, nach Immunmarkierung durchgeführt werden, kann Methylgrün an der Montagelösung in der Arbeitskonzentration eingebracht werden, ohne die Notwendigkeit, es abzuwaschen.
7. Einer Lagerung oder starten Bildgebung sofort. Führen Bildgebung mit einem konfokalen Laserraster (oder andere Fluoreszenz) Mikroskop mit einer Anregung bei 633 nm und Emissionsfilter eingestellt, um bei 650 bis 750 nm unter Berücksichtigung, dass grüne Emission sein Maximum bei 677 nm erreicht Methyl registrieren.
   Anmerkung: Wir stellen die Messdaten des Methylgrün Emissionsprofil, in das Erfassungssoftware geladen werden, als Zusatzmaterial.

3. Fluorescent Nuclear Staining von Whole Hühnerembryonen mit Methylgrün

1. Befruchtete Hühnereier Inkubieren auf die Bühne von Interesse. Befestigen Sie die Embryonen über Nacht in 4% Formaldehyd (von Paraformaldehyd) in PBS bei 4 ° C. Waschen Embryonen 3 mal in PBS-T für 2 Std.
2. Bereiten Sie eine 1: 5,000-1: 10.000 Lösung von Methyl-grün (2% Stammlösung) in PBS-T. Die Embryonen in der Färbungslösung beimpft und über Nacht bei 4 ° C. 3 mal in PBS, jeweils 1 Stunde Waschen Sie die Embryonen. Berg in der Kammer mit 75% Glycerin, 0,1 M Tris, pH 8.

4. Imaging fluoreszierend markierten Zellkerne in Whole-montiert Embryos

1. Bereiten Sie eine Imaging-Kammer durch Kleben mehreren Lagen Isolierband über einen Objektträger und vorsichtig ein Loch in sie mit einem Skalpell, um die Embryonen im Rahmen zu platzieren. Dies wird Embryonen aus Brechen während der Bilderzeugung zu verhindern.
2. Die Embryonen vorsichtig in die Abbildungskammer und füllt die Kammer bis zum Rand mit 75% Glycerin, 0,1 M Tris-HCl, pH = 8, um eineLeere Blasenbildung.
3. Deckel mit einem # 0 Deck Vermeidung oder Beseitigung von überquellenden Medium. Verschließen Sie diese mit Nagellack.
4. Erwerben Bilder der Probe auf einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Anregungsfilter 633 bzw. Laserlinie ausgestattet.
   HINWEIS: Emissionsfilter sollten die 677 Emissionsmaximum von Methylgrün decken.

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Ergebnisse

Kernfärbung von dicken Proben. Das Protokoll beschrieben gestattet das Erreichen einer homogenen Färbung von tiefen Strukturen in ganzen Embryonen. Entwicklungslinsenkerne Form 48 HPF Zebrafischembryonen homogen markiert (Abbildung 1).

Methylgrün DNA-Färbung erlaubt die Unterscheidung von Zellzyklus-abhängigen morphologischen Unterschiede, wie beispielsweise die Identifizierung von Mitosen oder apoptotischen Kernen (2A). Subnuklearen Strukturen mit hohe...

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Diskussion

The progressive development of microscopy techniques in the last decades, with a particular focus in variations of fluorescent microscopy, have led to the possibility of exploring the dynamics and structure of intact tissue samples, including whole embryos^10,11. One major limitation has been, however, the availability of good quality fluorophores that can be used to directly and quickly stain subcellular structures.

The most frequently used fluorescent DNA stains, such as DAPI or H...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Methyl green	Dr. G. Grübler		Also tested Sigma-Aldrich 323829, which is crystal violet-free
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5	Leica Microsystems
Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma-Aldrich	P1951
chloroform	Sigma-Aldrich	372978
Centrifuge 5810 R	eppendorf	5811 000.010
microscope slides	Deltalab	D100004
cover slips	Esco optics	R525025