배아의 형광 라벨의 DNA 특정 얼룩 메틸 녹색의 응용 프로그램

요약

A method for fluorescent staining of fixed biological material with the specific DNA label methyl green is described. Methyl green is used in a diluted aqueous solution and is very resistant to photobleaching. Its far-red emission allows for deep specimen imaging, making it particularly adequate for whole embryos.

초록

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored until recently. In this article, we illustrate the method for preparing a methyl green aqueous stock solution, that when diluted can be used as a very convenient fluorescent nuclear label for fixed cells and tissues. Easy procedures to label whole zebrafish and chick embryos are detailed, and examples of images obtained shown. Methyl green is maximally excited by red light, at 633 nm, and emits with a relatively sharp spectrum that peaks at 677 nm. It is very inexpensive, non-toxic, highly stable in solution and very resistant to photobleaching when bound to DNA. Its red emission allows for unaltered high resolution scanning confocal imaging of nuclei in thick specimens. Finally, this methyl green staining protocol is compatible with other cell staining procedures, such as antibody labeling, or actin filaments labeling with fluorophore-conjugated phalloidin.

서문

Fluorescent staining of DNA is broadly and routinely used both in biological research and in clinical diagnosis, either for the detailed study of nuclear and chromosomal structure, for counterstaining tissues and cells, or for studying cell cycle parameters¹. Although several DNA stains are available, the most widely used have been those excited by UV light and emitting in blue, which fit in the usual three-filter systems used in most conventional epifluorescence microscopes when combined with green and orange-red-emitting fluorophores, such as fluorescent proteins or small molecules attached to antibodies. Among these blue-emitting DNA stains, the most common are DAPI and Hoechst minor groove-binding agents^2,3. Nonetheless, the incorporation of a wide variety of laser emission lines and spectral detection in laser scanning microscopes, has allowed researchers to choose for the use of far-red-emitting nuclear stains such as propidium iodide (PI) or TO-PRO 3⁴. An advantage of these stains is that they overcome the problem of autofluorescence found in many cells and tissues, particularly in embryos⁵, but many of them have different problems such as having wide emission profiles or being very sensitive to photobleaching⁶.

The Swiss researcher Friedrich Miescher discovered DNA in 1869, extracting it from the nuclei of white blood cells found in pus. He called it nuclein, and showed a few years later that it formed precipitates with the relatively new stain methyl green. Methyl green is composed by three aniline rings, with different degrees of methylation, and has two positive charges that allow it to strongly bind to the major groove of DNA^7,8. DNA staining by methyl green was very early shown to be specific, leading to the development by Unna and Pappenheim of a combined stain with pyronin, which specifically labels RNA. Methyl green-pyronin has since then been extensively used in routine histological technique⁹.

Until recently, very little was known about the fluorescent properties of methyl green. Our previous work, however, has uncovered some of methyl green spectral advantages⁶ such as its excitation at 633 nm, a convenient Stokes shift, its emission on the near-infrared portion of the electromagnetic spectrum, higher photostability than commercially available DNA stains with similar spectral properties and at a very low cost. This is why we decided to test it for being used as a very high affinity and specific fluorescent label for DNA on embryonic tissues and in whole embryos. Furthermore, until now methyl green nuclear staining was performed at low pH, making it difficult to combine with antibody staining. The goal of the method detailed here is to have a protocol for fluorescent nuclear DNA staining which overcomes the aforementioned inconvenience by performing the staining procedure at physiological pH, thus making it a suitable counterstain for immunolabeling on sections and whole tissues.

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프로토콜

염료 1. 정제

1. 증류수 10ml에 얼룩 분말 0.4 g을 용해시켜 메틸 녹색의 4 % 수용액을 준비합니다. 완전히 용해 될 때까지 잘 섞는다.
2. 흄 후드에서 클로로포름 중 적어도 2 부분으로 섞는다. 그것은 튜브 클로로포름 내성 여부를 사전에 확인하는 것이 중요합니다.
3. 철저하게 믹스와 상 분리를 가속화하기 위해 2,000 XG에서 1 분 동안 원심 분리.
4. 원심 분리 후, 메틸 녹색 상부 수 성상을 클로로포름으로 하부 유기상과 일반적인 오염물 크리스탈 바이올렛이 얻어진다.
5. 위의 위상을 복구하고 낮은 단계는 크리스탈 바이올렛의 완전히없는 나타날 때까지이 단계를 반복합니다.
6. 마지막에, 상부 상을 회수하고, 2 % 메틸 그린의 최종 농도로 물에 희석 하였다. 이 원액 개월 작업대에 안정하고 빛으로부터 보호 될 필요가 없다.

2. 전체 Zebrafish의 태아의 형광 핵 염색은 메틸 녹색을 사용하여

1. 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 (파라 포름 알데히드)에서 하룻밤에 4 % 포름 알데히드 배아를 수정.
   참고 :이 몇 시간 걸릴 수 있습니다 하룻밤 배아의 두께에 따라합니다. 예를 들어, 우리는 밤새 48 시간 후 수정 (HPF) 제브라 피쉬 배아를 고정.
2. 5 분 동안 PBS-T (PBS에 1 % 트리톤 X-100)에 배아를 세 번 씻으십시오. 세제의 상승 된 농도는 표피를 permeabilizes.
3. 5,000-1 : PBS-T (2 %의 원액)에서 메틸 녹색 10,000 용액 1을 준비합니다. 배양시 세제의 존재는 제브라 피쉬 배아 및 유충 두꺼운 시편에 유용합니다.
4. 부드럽게 흔들와, 4 ° C에서 적어도 6 시간 동안 용액에서 배아를 인큐베이션. 또, 배아의 두께는 배양 길이 교정 파라미터이다.
5. 배아 3 팀을 씻으십시오30 분 동안 PBS로 ES는 세제 초과를 제거합니다. DNA에 결합시 메틸 녹색 형광 만 명백하고, 결합되지 않은 분자로부터 따라서 백그라운드는 무시할 수있다.
6. 발굴 슬라이드 또는 설치 솔루션을 만든 실에 산 (75 % 글리세롤, 0.1 M 트리스 · 염산의 pH 8).
   참고 : 핵 염색이 immunolabeling 이후에 수행 될 경우, 메틸 녹색이 그것을 씻어 할 필요없이, 작업 농도 장착 솔루션에 통합 할 수 있습니다.
7. 스토어 냉장 또는 즉시 영상을 시작합니다. 650-750 nm의 녹색의 발광은 677 nm에서 최대가 상기 메틸 고려에 등록 설정 및 633 nm의 방출 필터와 함께 여기에 레이저 스캐닝 공 초점 (또는 다른 형광) 현미경으로 촬영을 수행한다.
   주 : 우리는 메틸 녹색 발광 프로파일의 측정 데이터, 보충 자료로서 수집 소프트웨어에로드 될을 제공한다.

3. 형광 핵 세인트메틸 녹색을 사용하여 항목의 병아리 태아의 aining

1. 관심의 단계로 수정 된 암탉이 알을 품어. 4 ℃에서 하룻밤 PBS에서 (파라 포름 알데히드)에서 4 % 포름 알데히드의 배아를 수정. 2 시간 동안 PBS-T에서 배아 3 회 반복한다.
2. 5,000-1 : PBS-T (2 %의 원액)에서 메틸 녹색 10,000 용액 1을 준비합니다. 밤새 4 ℃에서 염색 액에 배아를 품어. 배아에게 PBS 3 회, 1 시간 각을 씻으십시오. 75 % 글리세롤, 0.1 M 트리스, pH가 8 실의 산.

4. 이미지 찬란는 전체 마운트 배아에서 핵을 레이블

1. 조심스럽게 현미경 슬라이드를 통해 전기 테이프의 여러 층을 고집에 의해 영상 실 준비는 내 배아를 배치 메스로에 구멍을 잘라. 이 영상 중에 분쇄에서 배아를 방지 할 수 있습니다.
2. 조심스럽게 75 % 글리세롤, 0.1 M 트리스 -HCl, pH가 8 위로 챔버 촬상 챔버 배아를 전송하고 채우기무효 거품 형성.
3. # 0 커버 슬립은 피하거나 매체 넘치는 제거와 커버. 매니큐어와 인감.
4. 여기 필터 (633) 또는 레이저 라인을 구비 한 형광 현미경에서 시료의 이미지를 수집.
   참고 : 배출 필터는 메틸 녹색의 677 방출 최대를 포함해야한다.

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결과

두꺼운 시편의 핵 염색. 여기에 설명 된 프로토콜은 전체 배아 깊은 구조의 균일 한 염색의 달성을 허용한다. 개발 렌즈 핵 양식 (48) HPF 제브라 피쉬 배아 균일 (그림 1) 표시되어 있습니다.

메틸 녹색 DNA 염색은 유사 분열 또는 세포 사멸 핵 (그림 2A)의 식별로 세포주기에 의존 형태 학적 차이의 차별을 할 수 있습니다. 제브라 피쉬 배아 (그림 2B)...

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토론

The progressive development of microscopy techniques in the last decades, with a particular focus in variations of fluorescent microscopy, have led to the possibility of exploring the dynamics and structure of intact tissue samples, including whole embryos^10,11. One major limitation has been, however, the availability of good quality fluorophores that can be used to directly and quickly stain subcellular structures.

The most frequently used fluorescent DNA stains, such as DAPI or H...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Methyl green	Dr. G. Grübler		Also tested Sigma-Aldrich 323829, which is crystal violet-free
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5	Leica Microsystems
Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma-Aldrich	P1951
chloroform	Sigma-Aldrich	372978
Centrifuge 5810 R	eppendorf	5811 000.010
microscope slides	Deltalab	D100004
cover slips	Esco optics	R525025