JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) تمثل مصدرا للأنسجة المريض محددة للتطبيقات السريرية والبحوث الأساسية. هنا، نقدم بروتوكول مفصلة لإعادة برمجة الخلايا البشرية الطرفية وحيدة النواة في الدم (PBMNCs) تم الحصول عليها من المعاطف الشهباء المجمدة في iPSCs مجانا الفيروسية باستخدام غير دمج-البلازميدات episomal.

Abstract

الخلايا الجسدية يمكن برمجتها إلى يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) عن طريق إجبار التعبير عن أربعة عوامل النسخ (أكتوبر-4، سوكس-2، KLF-4، ج. Myc على)، عن عادة عن طريق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) . نظرا لتشابهها مع hESCs، أصبحت iPSCs أداة هامة لالمحتملين الطب المريض محددة على التجدد، وتجنب القضايا الأخلاقية المرتبطة hESCs. من أجل الحصول على خلايا مناسبة لتطبيق السريرية، تحتاج iPSCs خالية من التحوير أن تتولد لتجنب تنشيط التحوير، تغير التعبير الجيني والتمايز المضلل. وعلاوة على ذلك، وهي طريقة ذات كفاءة عالية وغير مكلفة برمجة ضروري لاشتقاق iPSCs كافية لأغراض علاجية. ونظرا لهذه الحاجة، وهو نهج عدم دمج episomal البلازميد الكفاءة هو الخيار الأفضل لالتوجيهية الاشتقاق. حاليا نوع من الخلايا الأكثر شيوعا تستخدم لأغراض إعادة برمجة الخلايا الليفية و، وعزل الأمر الذي يتطلب أخذ عينة الأنسجة، وأناإجراء العمليات الجراحية nvasive للمريض. وبالتالي، يمثل الدم المحيطي البشري الأنسجة التي يمكن الوصول إليها والأقل الغازية لتوليد التوجيهية.

في هذه الدراسة، وتفيد التقارير بروتوكول مجانا الفيروسية فعالة من حيث التكلفة واستخدام غير دمج-البلازميدات episomal لتوليد iPSCs من خلايا الإنسان الطرفية وحيدة النواة في الدم (PBMNCs) تم الحصول عليها من المعاطف الشهباء المجمدة بعد الطرد المركزي كله دم وبدون كثافة الفصل الانحدار.

Introduction

في عام 2006، وشينيا ياماناكا مجموعة من 1 أثبتت لأول مرة أن الخلايا الجسدية من الفئران والبشر البالغين يمكن تحويلها إلى دولة المحفزة التي كتبها التعبير خارج الرحم من أربعة عوامل إعادة برمجة (أكتوبر-4، سوكس-2، KLF-4، و ج. Myc على)، وتوليد ما يسمى الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) 2. iPSCs المريض محددة تشبه الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) من حيث التشكل والانتشار والقدرة على التمايز إلى أنواع الخلايا الجرثومية الثلاث (الأديم المتوسط، الأديم والأديم الظاهر)، في حين تفتقر إلى المخاوف الأخلاقية المرتبطة باستخدام hESCs وتجاوز من الممكن الرفض المناعي 3. وبالتالي، iPSCs تبدو وكأنها واحدة من أهم مصادر خلايا المريض محددة للبحوث الأساسية، وفحص المخدرات، والنمذجة المرض، وتقييم سمية، وأغراض الطب التجديدي 4.

وقد استخدمت عدة طرق لتوليد التوجيهية: ناقلات دمج الفيروسية(الارتجاعي 5، الفيروسة البطيئة 6)، الفيروسي عدم دمج نواقل (اتش 7)، سينداي الفيروسات 8 والترانسبوزونات BAC 9 ناقلات episomal 10، 11 البروتينات أو تسليم RNA 12. على الرغم من أن استخدام وسائل بوساطة الفيروس يمكن أن يؤدي إلى ارتفاع كفاءة برمجة، ناقلات فيروسية على الاندماج في جينوم الخلية المصابة، وبالتالي المحتملة الطفرات إقحامي عشوائية، تغيير دائم في التعبير الجيني، وتنشيط الجينات المحورة إسكات خلال التمايز لا يمكن استبعاد 13.

لجعل iPSCs أكثر أمانا للطب التجديدي، بذلت جهود لاستخلاص iPSCs دون دمج الحمض النووي الخارجية في الجينوم الخلوي. على الرغم من النواقل والترانسبوزونات الفيروسية خاضع للضريبة وضعت، فإنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كان تسلسل ناقلات القصيرة، التي لا تزال حتما في الخلايا transduced بعد الختان، وtransposase التعبير، يمكن أن يفضي التغيير في الخليةجزيئية يعمل 13. على الرغم من ارتفاع كفاءة إعادة برمجة لها، ويمثل فيروس سينداي نهج مكلفة والوصول من خلال المخاوف الترخيص مع الشركة التي طورت هذا النظام لديها القدرة على الحد من تطبيقه في الدراسات متعدية. وعلاوة على ذلك، فإن الحاجة إلى إدخال المباشر من البروتينات والحمض النووي الريبي يتطلب تسليم متعددة من إعادة برمجة الجزيئات مع القيود التقنية المتأصلة هذا يدخل، وكفاءة إعادة برمجة الشاملة منخفضة جدا (14). من المذكرة، تم الإبلاغ عن أساليب الحرة الفيروسية وعدم دمج فعالة من حيث التكلفة على أساس استخدام البلازميدات episomal بنجاح لإعادة برمجة الخلايا الليفية الجلد 15. على وجه التحديد، في العمل الحالي قررنا استخدام التجارية المتاحة البلازميدات episomal خالية من التكامل، كما ذكرت سابقا 10،15.

حتى الآن، الخلايا الليفية الجلدية تمثل الأكثر شعبية نوع من الخلايا المانحة 5. ومع ذلك، فإن مصادر أخرى من الخلايا نجاح للبرمجتها sfully إلى iPSCs بما في ذلك الخلايا الكيراتينية 16، نخاع العظم الخلايا الجذعية الوسيطة 17، خلايا انسجة الدهنية 18، 19 بصيلات الشعر، وخلايا لب الأسنان 20. عزل هذه الخلايا تتطلب عمليات جراحية، وهناك حاجة لعدة أسابيع لفي المختبر توسيع الخلية من أجل تأسيس ثقافة الخلية الأولية.

في ضوء ذلك، واختيار لبدء نوع من الخلايا أمر بالغ الأهمية، وأنه من المهم أيضا أن تكون قادرة على إنتاج iPSCs من الأنسجة يمكن الوصول إليها بسهولة وأقل الغازية مثل الدم. كل من الخلايا وحيدة النواة دم الحبل السري (CBMNCs) 21،22 والطرفية وحيدة النواة خلايا الدم (PBMNCs) 14،22-24 تمثل المصادر المناسبة من الخلايا للاشتقاق iPSCs.

على الرغم من أن كفاءة الكبار PBMNC إعادة برمجة أقل 20-50 مرات من تلك التي من CBMNCs 22، إلا أنها تظل نوع من الخلايا الأكثر ملاءمة لغرض أخذ العينات. فيالواقع، PBMNC أخذ العينات لديها ميزة كونها الغازية الحد الأدنى، وبالإضافة إلى ذلك، وهذه الخلايا لا تتطلب توسيع نطاق واسع في المختبر قبل إعادة برمجة التجارب. حتى الآن، وأفادت البروتوكولات المختلفة التي PBMNCs بعد الانفصال كثافة التدرج يمكن تجميد وإذابة أيام إلى عدة أشهر بعد تجميد وتوسيع نطاقها لبضعة أيام قبل إعادة برمجة إلى iPSCs 22،23. ومع ذلك، بقدر ما نحن ندرك ووصف أي تقارير عن إعادة برمجة PBMNCs من المعاطف الشهباء المجمدة. الأهم من ذلك، المعاطف الشهباء المجمدة التي تم جمعها من دون فصل كثافة التدرج تمثل عينات الدم الأكثر شيوعا المخزنة في المصارف البيولوجية على نطاق واسع من الدراسات السكانية، مما يمثل حمام سباحة يمكن الوصول إليه بسهولة من المواد اللازمة لإنتاج التوجيهية أن يتجنب المزيد من جمع العينات.

هنا نقدم تقريرا للمرة الأولى توليد iPSCs مجانا الفيروسية من الإنسان المعاطف الشهباء المجمدة، استنادا إلى البروتوكول هو موضح سابقا (22). فيبالإضافة إلى ذلك، تم إنشاء iPSCs من PBMNCs المجمدة التي تم الحصول عليها بعد الانفصال كثافة التدرج، وبروتوكول التحكم في نتائج PBMNC غير الكثافة التدرج تنقيته.

Protocol

تم عزل الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMNCs) من الإنسان عينات الدم الطرفية من المتبرعين الأصحاء بعد أن وقعت الموافقة المستنيرة وموافقة اللجنة الأخلاقية لمقاطعة جنوب التيرول. وأجريت التجارب وفقا للمبادئ الواردة في إعلان هلسنكي. وجميع البيانات جمعها وتحليلها مجهولة.

1. عزل خلايا الدم المحيطي وحيدة النواة (PBMNCs)

  1. PBMNCs تم الحصول عليها من المعاطف الشهباء بعد الطرد المركزي الدم كله، من دون فصل التدرج الكثافة.
    1. جمع 8 مل من الدم المحيطي وريدي الى سيترات الصوديوم مخزنة أنبوب من البلاستيك، وتخزينها في RT (25 ° C). الدم العملية في غضون 12 ساعة بعد جمع.
    2. أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 2000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية في يتأرجح دلو الدوار، التبديل حالا الفرامل أجهزة الطرد المركزي.
    3. جمع معطف الشهباء غائم (الطبقة بين مرحلة البلازما العليا والسفلىالمرحلة التي تحتوي على أكثر من كريات الدم الحمراء)، الذي يحتوي على PBMNC جزء التخصيب (500 ميكرولتر) في أنبوب cryovial.
    4. و resuspend 500 ميكرولتر من معطف الشهباء مع 500 ميكرولتر من 2X تجميد المتوسطة التي تحتوي على 90٪ FBS و 20٪ DMSO، من أجل الحصول على الحجم الكلي لل1 مل مع 10٪ تركيز DMSO.
    5. تجميد القارورة في حاوية تجميد معدل الخاضعة للرقابة في -80 ° C. مخزن الخلايا في النيتروجين السائل لفترات أطول.
  2. PBMNCs التي تم الحصول عليها بعد الانفصال كثافة التدرج
    1. جمع 12 مل من الدم المحيطي وريدي الى سيترات الصوديوم مخزنة أنبوب بلاستيكي، وتخزينها في RT. الدم العملية في غضون 12 ساعة بعد جمع.
    2. تمييع الدم مع PBS العقيمة إلى الحجم النهائي من 35 مل.
    3. بعناية وببطء، طبقة 35 مل من الدم المخفف في 15 مل من محلول polysucrose (التي تستخدم لفصل كثافة التدرج) (ع = 1.077) في 50 مل أنبوب مخروطي (نسبة 3: 1).
    4. أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 800 x ج لمدة 30 دقيقة في RT فييتأرجح دلو الدوار، التبديل حالا الفرامل أجهزة الطرد المركزي.
    5. نضح العلوي، المرحلة الصفراء التي تحتوي البلازما وتخلص منه. بعناية، ونقل طبقة البيني بيضاء غير شفافة تحتوي على PBMNCs إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد.
    6. يصل إجمالي حجم إلى 30 مل مع برنامج تلفزيوني العقيمة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
    7. تجاهل طاف و resuspend الخلايا مع 30 مل من برنامج تلفزيوني. حساب عدد خلايا قابلة للحياة، على أساس التريبان الأزرق الاستبعاد 25.
    8. PBMNCs أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT، نضح طاف وتخلص منه.
    9. resuspend الكرية خلية في كمية مناسبة من تجميد المتوسطة التي تحتوي على 90٪ FBS و 10٪ DMSO، من أجل الحصول على تركيز 5 × 10 6 خلية / مل.
    10. قسامة 1 مل لكل قارورة (حوالي 5 × 10 6 خلية / مل)، وتجميد قارورة في مراقبة معدل تجميد الحاويات في - 80 ° C. مخزن الخلايا في النيتروجين السائل لفترات أطول.

    2. ذوبان وطلاء من PBMNCs (DAY 0)

    1. PBMNCs تم الحصول عليها من المعاطف الشهباء بعد الطرد المركزي الدم كله، من دون فصل التدرج الكثافة.
      1. لبدء البروتوكول باستخدام PBMNCs من المعاطف الشهباء المجمدة، وذوبان الجليد 1 قارورة من الخلايا في حمام مائي عند 37 درجة مئوية، وتمييع معطف الشهباء مع برنامج تلفزيوني العقيمة إلى الحجم النهائي من 2 مل.
      2. نقل معطف الشهباء المخفف إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل، إضافة 10 مل من أحمر العازلة تحلل الخلايا واحتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
      3. لإعداد 500 مل من أحمر العازلة تحلل الخلية، إضافة 0.5 غرام من بيكربونات البوتاسيوم، 4.145 غرام من كلوريد الأمونيوم، و 100 ميكرولتر من 0.5 M حل EDTA إلى 500 مل من الماء عالى النقاء، ودرجة الحموضة 7،2-7،4.
      4. يصل إجمالي حجم 50 مل مع برنامج تلفزيوني العقيمة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
      5. تجاهل طاف ويغسل بيليه مع 50 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة، الطرد المركزي معطف الشهباء في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
      6. resuspend الخلايا في1 مل من PBMNC المتوسطة، كما هو موضح سابقا 22، تتألف من: IMDM وهام في F-12 (نسبة 1: 1)، 1٪ من الانسولين ترانسفيرين-السيلينيوم ايثانول (ITS-X)، 1٪ من كيميائيا تعريف التركيز الدهون (سي دي)، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين، 0.005٪ من حمض L-الأسكوربيك، 0.5٪ من الأبقار مصل الزلال (BSA)، 1-Thioglycerol (نهائي تركيز 200 ميكرومتر)، الخلايا الجذعية عامل SCF (100 نانوغرام / مل)، انترلوكين -3 IL-3 (10 نانوغرام / مل)، إريثروبويتين EPO (2 U / مل)، الانسولين عامل النمو الذي يشبه IGF-1 (40 نانوغرام / مل)، ديكساميثازون (1 ميكرومتر) وهولو-ترانسفيرين (100 ميكروغرام / مل ).
      7. نقلها إلى جانب واحد من 12 لوحة جيدا مع معيار سطح تعامل زراعة الأنسجة، من دون طلاء، في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 6 خلية / مل. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب لمدة 48 ساعة، حتى الخطوة المتوسطة المتغيرة (انظر القسم 3).
    2. PBMNCs التي تم الحصول عليها بعد الانفصال كثافة التدرج
      1. لبدء البروتوكول باستخدام PBMNCs المجمدة بعدكثافة الفصل الانحدار، وذوبان الجليد 1 قارورة من الخلايا في حمام مائي عند 37 ° C، ونقل الخلايا في 5 مل من PBMNC المتوسطة. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
      2. resuspend الخلايا في 1 مل من PBMNC المتوسطة ونقلها إلى جانب واحد من لوحة ال 12 أيضا، في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 6 خلية / مل. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب لمدة 48 ساعة، حتى الخطوة المتوسطة المتغيرة (انظر القسم 3).

    3. الثقافة والتوسع في PBMNCs (DAY 2-13)

    1. جمع PBMNCs في الثقافة تعليق، باستخدام ماصة مع طرف 1 مل، 15 مل في أنبوب مخروطي الشكل والطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
    2. تجاهل طاف و resuspend الخلايا في 1 مل من المتوسط ​​PBMNC الطازجة.
    3. نقل الخلايا إلى 1 بشكل جيد من 12 لوحة جيدا مع معيار سطح تعامل زراعة الأنسجة، من دون طلاء، واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب.
    4. كرر هذه الخطوات كل يومين، وتقسيم الخلايا بنسبة 1: 2 عندما تصل إلى نقطة التقاء المناسب (حوالي 80٪).

    4. ترنسفكأيشن من PBMNCs مع Episomal البلازميدات (DAY 14)

    ملاحظة: إجراء عزل البلازميدات episomal خالية من intergation التجارية الأربعة، التي تحمل جينات تعدد القدرات باستخدام طقم التجارية لتنقية البلازميد وتقييم نوعية البلازميدات النقاء باستخدام التحليل agarose هلام، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

    1. جمع PBMNCs في 15 مل أنبوب مخروطي وحساب عدد خلايا قابلة للحياة (على أساس استبعاد التريبان الأزرق) 25.
    2. الطرد المركزي 2 × 10 6 الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
    3. و resuspend 2 × 10 6 خلايا في مزيج ترنسفكأيشن تحتوي على 100 ​​ميكرولتر من إعادة تعليق مؤقت T و 1 ميكروغرام لكل DNA البلازميد (البلازميد واحد يحمل OCT3 / 4 و shRNA ضد البروتين p53، البلازميد واحد يحمل SOX2 وKLF4، واحدالبلازميد تحمل L-MYC وLIN28، والبلازميد واحدة تحمل EGFP، للتحقق من كفاءة ترنسفكأيشن).
    4. نضح مزيج ترنسفكأيشن التي تحتوي على الخلايا في 100 ميكرولتر طرف وإدراج ماصة مع العينة عموديا داخل الأنبوب، مليئة 3 مل من العازلة كهربائيا E2، وضعت في محطة ماصة من جهاز Electroporation لل، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    5. خلايا electroporate كفاءة استخدام البرنامج التالي: 1650 V، و 10 مللي ثانية، 3 البقول.
    6. resuspend الخلايا electroporated (2 × 10 6 خلايا) في 2 مل من قبل تحسنت المتوسطة PBMNC، مضيفا 0.25 ملي الصوديوم الزبدات (NAB) وحساب عدد خلايا قابلة للحياة بعد بروتوكول Electroporation لل(على أساس استبعاد التريبان الأزرق) 25.
    7. نقل الخلايا إلى جانب واحد من لوحة 6 جيدا دون طلاء، صخرة بلطف لوحة واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب.
    8. اليوم بعد Electroporation لل، اشعرتي عدد الخلايا GFP إيجابية تحت المجهر مضان 8-10 المجالات عشوائية، من أجل تقييم كفاءة ترنسفكأيشن.
    9. الحفاظ على الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل دون تقسيم لمدة 3 أيام، حتى الطلاء لهم على MEFS (انظر القسم 6).
    10. استبدال 2 مل من PBMNCs الطازجة المتوسطة، بالإضافة إلى 0.25 ملي NAB كل يومين.

    5. إعداد أطباق مع الخلايا المغذية للالمشارك الثقافة (DAY 16)

    1. معطف الآبار من لوحة 6 جيدا مع 1 مل من الطابق السفلي مصفوفة الغشاء لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية و لوحة الماوس الجنينية الخلايا الليفية (MEFS) في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 5 خلايا / جيد مع 2 مل 10٪ الواردة FBS DMEM (MEF المتوسطة) قبل الركض PBMNCs electroporated على الخلايا المغذية MEF يوم واحد.

    6. PBMNCs تصفيح Transfected على MEFS (DAY 17-19)

    1. جمع PBMNCs في الثقافة تعليق، باستخدام ماصة مع 1 مل طرف، في أنبوب مخروطي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي transfected PBMNCs في 300 x ج لمدة 10 دقيقةفي RT.
    2. تجاهل طاف و resuspend بيليه في 2 مل من المتوسط ​​PBMNC الطازجة، بالإضافة إلى 0.25 ملي NAB.
    3. لوحة الخلايا على MEF المغلفة 6 جيدا لوحة واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب.
    4. بعد يومين، نضح في والمتوسطة واستبدالها 2 مل من IPSC متوسطة تتألف من خروج المغلوب DMEM (KO-DMEM)، و 20٪ استبدال KO-المصل (KOSR)، 1 ملم NEAAs، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين، 20 مم L- الجلوتامين، 0.1 ملم β المركابتويثانول، 10 نانوغرام / مل جمعية جيل المستقبل (bFGF الأساسي) و 0.25 ملي NAB.
    5. استبدال 2 مل من الطازجة المتوسطة التوجيهية كل يوم والتحقق من خلايا يوميا.
      ملاحظة: في حوالي 22-25 يوم، وينبغي أن المستعمرات الأولى من iPSCs تكون مرئية.

    7. انتقاء وتوسيع المستحثة الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) النسخ (DAY 30-35)

    ملاحظة: في حوالي 30-35 يوما بعد ترنسفكأيشن، ينبغي أن تكون مستعمرات التوجيهية جاهزة للقطف وreplating. وينبغي أن تكون كفاءة إعادة برمجة ESTIتزاوج كنسبة مئوية من عدد من المستعمرات التوجيهية / العدد الكلي للخلايا electroporated، كما ذكرت سابقا 26.

    1. قبل يوم واحد الركض المستعمرات التوجيهية، وإعداد وحدة التغذية MEF في لوحة 12-جيدا (1.25 × 10 5 خلايا / جيد).
    2. نضح في والمتوسطة MEF وتتغير مع 1 مل من IPSC المتوسطة مع 10 نانوغرام / مل bFGF و 10 ميكرومتر Y-27632. تشريح يدويا باستخدام إبرة واحدة مستعمرة في كل مرة تحت المجهر تشريح في قطف غطاء محرك السيارة من أجل الحصول على الشبكة، وجمع كتل أصغر من قبل pipetting ونقلها بشكل فردي كل في بئر واحدة من 12 لوحة جيدا المغلفة مع MEFS.
    3. مرور وتوسيع كل لوحة 12-جيدا لوحة 6 جيدا في نسبة 1: 2، ثم كل لوحة 6 جيدا في نسبة 1: 4 لمزيد من الانتشار. تشريح وتوسيع iPSCs يدويا لالممرات الأولى 2-3 (كما هو موضح تماما في الخطوة 7.2)، ثم استخدم إجراء انزيم تفارق (تبدأ من الخطوة 7.4).
    4. لوضع بروتوكول انزيم تفارق ونظيفة التوجيهية coloniوفاق بواسطة الشفط أجزاء متباينة، تحت المجهر تشريح في قطف غطاء محرك السيارة.
    5. احتضان iPSCs مع 1 مل من كولاجيناز الرابع (1 ملغ / مل) لمدة 10 دقيقة عند 37 ° C.
    6. نضح الحل الانزيم، وشطف الخلايا مع 1 مل من KO-DMEM وجمع المستعمرات في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 2 دقيقة في RT.
    7. نضح طاف، resuspend والمستعمرات في 2 مل من IPSC المتوسطة مع 10 نانوغرام / مل bFGF و 10 ميكرومتر Y-27632 لوحة ولهم على MEF المغلفة لوحة 6 جيدا (نسبة 1: 4).

    8. توصيف iPSCs (بين 5-15 مقاطع)

    1. الفوسفاتاز القلوية تلطيخ
      1. ثقافة المستعمرات التوجيهية لمدة 3-5 أيام في التوجيهية المتوسطة مع 10 نانوغرام / مل bFGF.
      2. لبدء بروتوكول الفوسفاتيز القلوية تلطيخ، وشطف iPSCs مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ومن ثم اصلاحها مع 1 مل من 4٪ PFA لمدة 20 دقيقة في RT.
      3. غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، لإزالة المتبقي PFA.
      4. خلايا وصمة عار الثابتة باستخداموالقلوية عدة الفوسفاتيز تلطيخ التجارية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    2. المناعي
      1. ثقافة المستعمرات التوجيهية لمدة 3-5 أيام في التوجيهية المتوسطة مع 10 نانوغرام / مل bFGF.
      2. لبدء الفحص المناعي، وغسل iPSCs مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ومن ثم اصلاحها مع 1 مل من 4٪ PFA لمدة 20 دقيقة في RT.
      3. غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، لإزالة المتبقي PFA.
      4. علاج iPSCs ثابتة مع 1 مل من permeabilization / عرقلة الحل تحتوي على 4٪ مصل الماعز، 0.1٪ BSA، 0.1٪ تريتون X-100 و 0.05٪ أزيد الصوديوم (نان 3) لمدة 1 ساعة على RT.
      5. نضح عرقلة الحل واحتضان خلايا ثابتة مع الأجسام المضادة الأولية في 3٪ BSA و 0.05٪ نان 3 حل O / N عند 4 ° C (راجع الجدول المادي لقائمة الأجسام المضادة الأولية واقترح الأجسام المضادة عامل التخفيف).
      6. في اليوم التالي، وغسل iPSCs ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، ثم احتضان الخلايا مع اليكسا فلور 488 الماعز المضادة للماوس واليكسا فلوريداuor 555 الماعز الأجسام المضادة المضادة للأرنب، المخفف 1: 1000 في 3٪ BSA و 0.05٪ نان 3 الحل، لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
      7. وصمة عار على النوى مع دابي (1μg / مل) لمدة 10 دقيقة في RT في الظلام، تليها ثلاث غسل الوقت مع برنامج تلفزيوني.
    3. تمايز iPSCs في الهيئات مضغي (EBS)
      1. ثقافة المستعمرات التوجيهية لمدة 5-6 أيام في التوجيهية المتوسطة مع 10 نانوغرام / مل bFGF.
      2. إزالة أجزاء متباينة من المستعمرات التوجيهية بواسطة الشفط، تحت المجهر تشريح في قطف غطاء محرك السيارة.
      3. احتضان iPSCs مع 1 مل من كولاجيناز الرابع (1 ملغ / مل) لمدة 10 دقيقة عند 37 ° C.
      4. نضح الحل الانزيم، وشطف الخلايا مع 1 مل من KO-DMEM وجمع المستعمرات في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 2 دقيقة في RT.
      5. نضح طاف و resuspend المستعمرات في 2 مل من EB متوسطة تتألف من KO-DMEM، 20٪ حددت مصل الجنين البقري (FBS)، 1 ملم NEAAs، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين، 20 مم L-الجلوتامين، 0.1 ملم46؛ -mercaptoethanol.
      6. لوحة المستعمرات التوجيهية في تعليق لمدة 6 أيام على مرفق منخفضة للغاية 6 لوحات جيدة، وذلك للسماح للتشكيل هيئات مضغي ثلاثية الأبعاد كروي (EBS). تغيير 2 مل من الطازجة المتوسطة EB كل يومين.
      7. في يوم 7، وجمع EBS وطبق لهم على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 6 لوحات جيدة في 2 مل من EB المتوسط ​​والحفاظ على EBS في التمايز لمدة 20 يوما.
      8. تغيير 2 مل من الطازجة المتوسطة EB كل يومين.
    4. QRT-PCR تحليل التعبير الجيني
      1. ثقافة المستعمرات التوجيهية لمدة 5-6 أيام في التوجيهية المتوسطة مع 10 نانوغرام / مل bFGF.
      2. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من PBMNCs، iPSCs أو EBS باستخدام 1 مل من كاشف التجاري وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      3. تقييم تركيز الحمض النووي الريبي ونقاء بالطرق المناسبة مثل استخدام الطيف (RNA جودة عالية مع A 260 / A 280 و A 260 / A 230 النسب> 1.8) 27.
      4. الاختيارسلامة الحمض النووي الريبي باستخدام طقم التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (جودة عالية RNA RQI> 9.5) 28.
      5. إجراء رد فعل عكس النسخ على 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام مجموعة الناسخ العكسي التجارية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      6. إعداد الخلائط QPCR تحتوي على 5 نانوغرام من قالب [كدنا]، 7.5 ميكرولتر SYBR الخضراء Supermix، 2 ميكرولتر من 5 ميكرومتر الاشعال (إلى الأمام: 1 ميكرولتر وعكس: 1 ميكرولتر) و 6 ميكرولتر من ريبونوكلياز / الدناز خالية من الماء لكل 29 رد فعل.
      7. أداء QRT-PCR باستخدام البرنامج التالي: خطوة تمسخ الأولي في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، تليها 40 دورة مقسمة إلى خطوة تمسخ في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية والتمهيدي الصلب والإرشاد خطوة عند 60 درجة مئوية لمدة 45 29 ثانية.
      8. تطبيع التعبير عن الجينات الأخرى التي تستخدم GAPDH كما الجينات التدبير المنزلي 28 (انظر الاشعال المدرجة في الجدول 1).
    5. QPCRلالتحوير الاستبعاد
      1. استخراج الحمض النووي من PBMNCs أو iPSCs باستخدام 1 مل من تحلل العازلة التي تحتوي على 50 ملي تريس، 100 ملي EDTA، 100 ملي كلوريد الصوديوم، 1٪ الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) و 20 ميكروغرام / مل بروتين K.
      2. إضافة حجم مساو (1 مل) من 100٪ الأيزوبروبانول، مزيج من قبل انقلاب ثلاث مرات من أجل السماح للترسيب الحمض النووي وأجهزة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
      3. تجاهل طاف، ويغسل بيليه الحمض النووي مع 1 مل من الايثانول 70٪ والطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 5 دقائق على RT. نضح وتجاهل طاف و resuspend في ريبونوكلياز / الدناز خالية من الماء.
      4. تقييم تركيز الحمض النووي والنقاء بالطرق المناسبة مثل استخدام الطيف (RNA جودة عالية مع A 260 / A 280 و A 260 / A 230 النسب> 1.8) 27.
      5. إعداد الخلائط QPCR تحتوي على 5 نانوغرام من الحمض النووي القالب، 7.5 ميكرولتر SYBR الخضراء Supermix، 2 ميكرولتر من 5 ميكرومتر الاشعال (إلى الأمام: 1 ميكرولتر وعكس: 1 ميكرولتر) و 6 &# 181؛ ل من ريبونوكلياز / الدناز خالية من الماء لكل 29 رد فعل.
      6. تطبيع التعبير البلازميد episomal محدد EBNA-1 الجينات باستخدام FBX-15 كما الجينات التدبير المنزلي 29 (انظر الاشعال المدرجة في الجدول 1).
    6. تحليل النمط النووي
      1. ثقافة المستعمرات التوجيهية لمدة 5-6 أيام على خالية من وحدة التغذية الطابق السفلي مصفوفة غشاء لوحة مغطاة تجارية محددة والمتوسطة صيانة مجانية المغذية للiPSCs، بعد تعليمات الشركة الصانعة.
      2. لبدء بروتوكول تحليل النمط النووي، فصل المستعمرات التوجيهية مع 1 مل من محلول مفرزة خلية لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية، حتى الحصول على تفكك خلية واحدة.
      3. جمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
      4. و resuspend iPSCs في 2 مل من متوسطة وضعت خصيصا لزراعة الخلايا لتقنيات التشخيص قبل الولادة. iPSCs لوحة وحيدة الخلية على الغشاء القاعدي مصفوفة المغلفة أطباق الزجاج واحتضان لهم في 37 ° C، 5٪ CO 2 </ دون> الحاضنة.
      5. بعد 2-4 أيام، إضافة 10 ميكرولتر / الكولشيسين مل مباشرة إلى الثقافات واحتضان لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب.
      6. نضح المتوسطة واحتضان iPSCs في 1 مل من محلول منخفض التوتر (0.6٪ سيترات الصوديوم و 0.13٪ كلوريد البوتاسيوم) لمدة 10 دقيقة في RT.
      7. شطف الخلايا مع 1 مل من 5٪ محلول حامض الخليك وإصلاح iPSCs مع الميثانول / حل حامض الخليك (نسبة 3: 1) في الجهاز مع درجة الحرارة للرقابة والرطوبة (28 ° C، و 42٪ RH).
      8. تزج وصمة عار الثابتة الخلايا مع حل كيناكرين لمدة 15-20 دقيقة في RT في الظلام (للحصول Q-النطاقات) 30.
      9. اكتساب طور متوسط ​​الخلية تحت المجهر مضان في التكبير 100X 29.

النتائج

في هذه الدراسة بروتوكول بسيطة وفعالة لتوليد iPSCs مجانا الفيروسية عن طريق إعادة برمجة PBMNCs معزولة عن المجمدة المعاطف الشهباء بعد الطرد المركزي الدم الكامل والمقارنة مع إعادة برمجة PBMNCs التي تم الحصول عليها بعد الإبلاغ عن فصل التدرج الكثافة. ويبين الشكل 1A تمثيل ...

Discussion

في الماضي، والطريقة الوحيدة للحصول على الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان يحمل طفرة جينية معينة كان لتجنيد الآباء تمر قبل الزرع التشخيص الوراثي وتوليد خلايا جذعية جنينية من الكيسات الأريمية على التخلص 31،32. باستخدام نهج برمجة، يمكن للباحثين الآن تولد iPSCs من المر?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The study was supported by the Ministry of Health and Department of Educational Assistance, University and Research of the Autonomous Province of Bolzano and the South Tyrolean Sparkasse Foundation.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic TubeTerumoVF-054SBCS07
Ammodium chlorideSigma-AldrichA9434
Potassium bicarbonateSigma-Aldrich60339
EDTA disodium powderSigma-AldrichE51340.5 M solution
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare Life Sciences17-5442-02Polysucrose solution for density gradient centrifugation
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) Gibco21056-023No phenol red
Ham's F-12Mediatech10-080-CV
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X)Gibco51500-056 1X (Stock: 100X)
Chemically Defined Lipid ConcentrateGibco119050311X (Stock: 100X)
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA9418
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrateSigma-AldrichA8960
1-ThioglycerolSigma-AldrichM6145Final Concentration at 200 µM
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF)PeproTech300-07100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) 
Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3)PeproTech200-0310 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1)PeproTech100-1140 ng/ml (Stock: 40 µg/ml)
Recombinant Human Erythropoietin (EPO)R&D Systems 287-TC-5002 U/ml (Stock: 50 U/ml)
Dexamethasone Sigma-AldrichD29151 μM (Stock: 1 mM)
Human Holo-TransferrinR&D Systems 2914-HT100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml)
Amniomax IIGibco11269016Medium for cytogenetic analysis
mTeSR1StemCell Technologies5850Medium for iPSC feeder-free culture
Knockout DMEMGibco10829-018
Knockout Serum ReplacementGibco10828-028
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140-122
L-Glutamine (200 mM)Gibco25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Gibco11140-050
2-Mercaptoethanol Gibco31350-0100.1 mM (Stock: 50 mM)
Sodium ButyrateSigma-AldrichB58870.25 mM (Stock: 0.5 M)
Recombinant Human FGF basic, 145 aa R&D Systems 4114-TC10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Y-27632 dihydrochlorideSigma-AldrichY0503 10 µM (Stock: 10 mM)
Fetal Defined Bovine SerumHycloneSH 30070.03
EmbryoMax 0.1% Gelatin SolutionMerck-MilliporeES-006-B
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor ReducedBD Biosciences354230
Collagenase, Type IVGibco17104-0191 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)
AccutasePAA Laboratories GmbHL11-007Cell detachment solution
Mouse Embryonic Fibroblast (CF1)Global StemGSC-6201G1*106 cells/6 well plate
Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-FAddgene 270771 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hSKAddgene 270781 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hULAddgene 270801 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-EGFPAddgene 270821 µg (Stock: 1 µg/µl)
Alkaline Phosphatase Staining KitStemgent00-0009
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) AntibodyMerck-MilliporeMAB43041/250
Anti-TRA-1-60 AntibodyMerck-MilliporeMAB43601/250
Anti-TRA-1-81 AntibodyMerck-MilliporeMAB43811/250
Anti-Oct-3/4 AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-90811/500
Anti-Nanog AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-337591/500
Anti-Troponin I AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-153681/500
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) AntibodySigma-AldrichA77321/250
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) AntibodyCovance Research Products Inc MMS-435P-1001/500
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) AntibodyCalbiochem6570121/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Molecular ProbesA-110291/1000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-RabbitMolecular ProbesA-214291/1000
Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plateCorning3471
Trizol ReagentAmbion15596-018 reagent for RNA extraction
SuperScript VILO cDNA Synthesis KitInvitrogen11754050Reverse transcriptase kit
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5124
CFX96 Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad185-5195
Experion Automated Electrophoresis SystemBio-Rad700-7000Instrument to check RNA integrity
Experion RNA Highsense Analysis kitBio-Rad7007105Reagent kit to check RNA integrity
Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 )Zeiss495007
NeonTransfection System 100 µl KitInvitrogenMPK10025Reagent kit for electroporation
Neon Transfection SystemInvitrogenMPK5000Instrument used for electroporation
NanoDrop UV/Vis SpectrophotometerThermo ScientificND-2000Instrument for DNA/RNA quantification
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362Plasmid purification kit

References

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  3. Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications. J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
  4. Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells). Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  8. Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
  9. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  10. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  11. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
  12. Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci. Rep. 2, 657 (2012).
  13. Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).
  14. Chou, B. K., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).
  15. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
  16. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  17. Streckfuss-Bomeke, K., et al. Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).
  18. Miyoshi, N., et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs. Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).
  19. Wang, Y., et al. Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells. Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).
  20. Beltrao-Braga, P. C., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells. Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).
  21. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  22. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).
  23. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  24. Geti, I., et al. A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).
  25. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).
  26. Hasegawa, K., et al. Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion. Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).
  27. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), 2565 (2010).
  28. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).
  29. Meraviglia, V., et al. Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties. Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).
  30. Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents. Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).
  31. Alikani, M., Munne, S. Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy. Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).
  32. Tropel, P., et al. High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).
  33. Hanna, J., et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).
  34. Li, H., et al. The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming. Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).
  35. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  36. Lindner, S. E., Sugden, B. The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells. Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

100 episomal

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved