Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da congelata Buffy cappotti con non-integrazione episomiale Plasmidi

Riepilogo

Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) rappresentano una fonte di tessuti paziente-specifici per le applicazioni cliniche e di ricerca di base. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per riprogrammare le cellule umane mononucleari di sangue periferico (PBMNCs) ottenute da buffy coats congelati in iPSCs-virali gratuito utilizzando non integrano plasmidi episomiale.

Abstract

Cellule somatiche possono essere riprogrammate in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) forzando l'espressione di quattro fattori di trascrizione (ottobre-4, Sox-2, KLF-4, e c-Myc), tipicamente espressa da cellule staminali embrionali umane (hESC) . A causa della loro somiglianza con hESC, iPSCs sono diventati uno strumento importante per il potenziale di medicina rigenerativa paziente-specifici, evitando questioni etiche connesse con hESC. Al fine di ottenere cellule adatte per l'applicazione clinica, iPSCs senza transgene devono essere generati per evitare transgene riattivazione, alterata espressione genica e differenziazione sbagliata. Inoltre, un metodo di riprogrammazione molto efficiente e conveniente è necessario ricavare iPSCs sufficienti a fini terapeutici. Tenuto conto di questa esigenza, un approccio efficiente non integrando episomiale plasmide è la scelta preferibile per IPSC derivazione. Attualmente il tipo di cella più comune utilizzato per scopi di riprogrammazione sono fibroblasti, l'isolamento dei quali richiede biopsia tissutale, un iprocedura chirurgica nvasive per il paziente. Pertanto, sangue periferico umano rappresenta il tessuto più accessibile e meno invasivo per la generazione IPSC.

In questo studio, un protocollo virale senza costo-efficacia e l'utilizzo non integrano plasmidi episomiale è segnalato per la generazione di iPSCs dal periferico cellule umane mononucleate del sangue (PBMNCs) ottenute da buffy coats congelati dopo centrifugazione del sangue intero e senza la densità di separazione gradiente.

Introduzione

Nel 2006, il gruppo di Shinya Yamanaka ¹ ha dimostrato per la prima volta che le cellule somatiche di topi adulti e gli esseri umani possono essere convertiti in uno stato pluripotente dall'espressione ectopica di quattro fattori di riprogrammazione (ottobre-4, Sox-2, KLF-4, e c-Myc), generando le cosiddette cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) ^2. IPSCs paziente-specifiche sono molto simili a cellule staminali embrionali umane (hESC) in termini di morfologia, la proliferazione e la capacità di differenziarsi in tipi di cellule germinali (tre mesoderma, endoderma ed ectoderma), mentre mancano le preoccupazioni etiche legate all'uso di hESC e bypass possibile rigetto immunitario ^3. Così, iPSCs appaiono come una delle più importanti fonti di cellule paziente-specifiche per la ricerca di base, lo screening di stupefacenti, modelli di malattia, la valutazione della tossicità, e fini di medicina rigenerativa ^4.

Diversi approcci sono stati utilizzati per la generazione iPSC: vettori virali integrazione(Retrovirus ^5, lentivirus ^6), virale non integrando vettori (adenovirus ^7), Sendai-virus ^8, BAC trasposoni ^9, vettori episomiale ^10, proteine ^​​11 o consegna RNA ^12. Sebbene l'uso di metodi di virus-mediata può portare ad alta efficienza riprogrammazione, vettori virali integrano nel genoma delle cellule ospiti e quindi potenziale casuale mutagenesi inserzionale, alterazione permanente di espressione genica, e la riattivazione di transgeni tacere durante la differenziazione non può essere esclusa ^13.

Per rendere più sicuro iPSCs per la medicina rigenerativa, sono stati compiuti sforzi per derivare iPSCs senza l'integrazione di DNA esogeno in genomi cellulari. Sebbene siano stati sviluppati vettori virali soggetti ad accisa e trasposoni, è ancora chiaro se sequenze vettore brevi, che inevitabilmente rimangono nelle cellule trasdotte dopo escissione e transposase espressione, potrebbero indurre alterazioni nella cellalare funzionano ^13. Nonostante la sua alta efficienza riprogrammazione, virus Sendai rappresenta un approccio costoso e raggiungere, attraverso problemi di licenza con la società che ha sviluppato questo sistema di avere il potenziale per limitarne l'applicazione negli studi traslazionali. Inoltre, la necessità di introduzione diretta di proteine ​​e RNA richiede consegna multiplo di riprogrammazione molecole con le limitazioni tecniche insite questo introduce, e l'efficienza complessiva riprogrammazione è molto bassa ^14. Di nota, metodi virali libere e non integrare convenienti basate sull'uso di plasmidi episomiale sono stati riportati con successo per la riprogrammazione dei fibroblasti cutanei ^15. In particolare, in questo lavoro abbiamo deciso di utilizzare commerciali plasmidi episomiale senza integrazione disponibili, come riportato in precedenza ^10,15.

Fino ad oggi, fibroblasti cutanei rappresentano il più popolare tipo di cellula donatrice ^5. Tuttavia, altre fonti di cellule sono stati successfully riprogrammato in iPSCs compresi cheratinociti ^16, del midollo osseo cellule staminali mesenchimali ^17, cellule stromali adipose ^18, follicoli piliferi ^19, e le cellule della polpa dentale ^20. L'isolamento di queste cellule richiede procedure chirurgiche, e diverse settimane sono necessari per l'espansione delle cellule in vitro allo scopo di stabilire una coltura cellulare primaria.

In questa luce, la selezione del tipo di cellula di partenza è critico ed è altrettanto importante essere in grado di produrre iPSCs dai tessuti facilmente accessibili e meno invasive come sangue. Entrambe le cellule mononucleate del sangue del cordone (CBMNCs) ^21,22 e cellule mononucleari di sangue periferico (PBMNCs) ^14,22-24 rappresentano idonee fonti di cellule per la derivazione di iPSCs.

Sebbene l'efficienza di adulti PBMNC riprogrammazione è 20-50 volte inferiore a quella del CBMNCs ^22, rimangono il tipo di cella più conveniente per scopo campionamento. InInfatti, campionamento PBMNC ha il vantaggio di essere minimamente invasiva, e in aggiunta, queste cellule non richiedono vasta espansione in vitro prima degli esperimenti di riprogrammazione. Fino ad oggi, i protocolli differenti hanno riferito che PBMNCs dopo la separazione gradiente di densità possono essere congelati e scongelati giorni a diversi mesi dopo il congelamento e ampliato per alcuni giorni prima della riprogrammazione in iPSCs ^22,23. Tuttavia, per quanto a nostra conoscenza segnalazioni hanno descritto una riprogrammazione della PBMNCs da buffy coats congelati. È importante sottolineare che, buffy coats congelati raccolti senza separazione gradiente di densità rappresentano i campioni di sangue più comuni memorizzati nella biobanche di grandi dimensioni provenienti da studi di popolazione, rappresentando così una piscina facilmente accessibile di materiale per la produzione di IPSC che evita ulteriormente la raccolta dei campioni.

Qui riportiamo per la prima volta la generazione di iPSCs-virali privi di buffy coats congelati umani, sulla base di un protocollo precedentemente descritto ^22. InInoltre, sono stati generati da iPSCs PBMNCs congelati ottenuti dopo la separazione gradiente di densità, come un protocollo di controllo per i risultati PBMNC gradiente di densità non depurati.

Protocollo

Cellule mononucleari del sangue periferico (PBMNCs) sono stati isolati da campioni di sangue periferico di donatori sani, dopo firmato il consenso informato e l'approvazione del Comitato Etico della Provincia di Bolzano. Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con i principi espressi nella Dichiarazione di Helsinki. Tutti i dati sono stati raccolti e analizzati in modo anonimo.

1. Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMNCs)

1. PBMNCs ottenuti da buffy coats dopo centrifugazione del sangue intero, senza separazione gradiente di densità.
   1. Raccogliere 8 mL di sangue periferico venoso in un citrato di sodio tamponata tubo di plastica, e conservare a RT (25 ° C). Sangue di processo entro 12 ore dal prelievo.
   2. Centrifugare la provetta a 2.000 xg per 15 min a 4 ° C in un rotore secchio oscillante, i freni centrifuga spegnimento.
   3. Raccogliere nuvoloso buffy coat (strato tra la fase di plasma superiore e quella inferioreFase contenente la maggior parte degli eritrociti), contenente la frazione PBMNC arricchito (500 microlitri) in una provetta esageratamente.
   4. Risospendere 500 ml di buffy coat con 500 pl di mezzo 2x congelamento contenente 90% FBS e 20% DMSO, in modo da ottenere un volume totale di 1 ml con concentrazione DMSO 10%.
   5. Blocca il flacone in un contenitore di congelamento a velocità controllata a -80 ° C. Cellule Conservare in azoto liquido per periodi più lunghi.
2. PBMNCs ottenuti dopo la separazione gradiente di densità
   1. Raccogliere 12 ml di sangue periferico venoso in citrato di sodio tamponata tubo di plastica, e conservare a temperatura ambiente. Sangue di processo entro 12 ore dal prelievo.
   2. Diluire il sangue con PBS sterile fino ad un volume finale di 35 ml.
   3. Cautela e lentamente, strato 35 ml di sangue diluito su 15 ml di soluzione di polysucrose (utilizzata per la separazione gradiente di densità) (p = 1.077) in una provetta conica da 50 ml (rapporto 3: 1).
   4. Centrifugare la provetta a 800 xg per 30 min a RTun rotore bucket oscillante, i freni centrifuga spegnimento.
   5. Aspirare la parte superiore, la fase gialla contenente plasma ed eliminarla. Cautela, trasferire lo strato interfase bianco opaco contenente PBMNCs in una nuova provetta conica da 50 ml.
   6. Portare il volume totale di 30 ml con PBS sterile e centrifugare a 300 xg per 10 min a RT.
   7. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule con 30 ml di PBS. Contare il numero di cellule vitali, sulla base di trypan esclusione blu ^25.
   8. PBMNCs centrifuga a 300 xg per 10 minuti a temperatura ambiente, aspirare il surnatante e gettarlo.
   9. Risospendere il pellet di cellule in una quantità appropriata di medie congelamento contenente 90% FBS e 10% DMSO, in modo da ottenere una concentrazione di 5 x 10 ⁶ cellule / ml.
   10. Aliquotare 1 ml per flacone (circa 5 x 10 ⁶ cellule / ml) e congelare la fiala in un tasso controllato congelamento contenitore a - 80 ° C. Cellule Conservare in azoto liquido per periodi più lunghi.

2. di scongelare e placcatura di PBMNCs (DAY 0)

1. PBMNCs ottenuti da buffy coats dopo centrifugazione del sangue intero, senza separazione gradiente di densità.
   1. Per avviare il protocollo utilizzando PBMNCs di buffy coat congelati, scongelare 1 fiala di cellule in un bagno d'acqua a 37 ° C e diluire il buffy coat con PBS sterile fino ad un volume finale di 2 ml.
   2. Trasferire il buffy coat diluito in una provetta da 50 ml, aggiungere 10 ml di tampone di lisi dei globuli rossi e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
   3. Per preparare 500 ml di tampone di lisi dei globuli rossi, aggiungere 0,5 g di bicarbonato di potassio, 4.145 g di cloruro di ammonio, 100 ml di soluzione 0,5 M EDTA a 500 ml di acqua ultrapura, pH 7,2-7,4.
   4. Portare il volume totale di 50 ml con PBS sterile e centrifugare a 300 xg per 10 min a RT.
   5. Eliminare il supernatante e lavare il pellet con 50 ml di PBS sterile, centrifugare il buffy coat a 300 xg per 10 min a RT.
   6. Risospendere le cellule in1 ml di PBMNC media, come precedentemente descritto ^22, composto da: IMDM e di Ham F-12 (rapporto 1: 1), 1% di insulino-transferrina-selenio-Etanolammina (ITS-X), l'1% di chimica definita Concentrato Lipid (CDL), 1% penicillina / streptomicina, 0,005% di acido L-ascorbico, lo 0,5% di albumina sierica bovina (BSA), 1-thioglycerol (concentrazione finale 200 micron), Stem Cell Factor SCF (100 ng / ml), interleuchina -3 IL-3 (10 ng / ml), eritropoietina EPO (2 U / ml), Insulin-like Growth Factor IGF-1 (40 ng / ml), desametasone (1 pM) e holo-transferrina (100 ug / ml ).
   7. Trasferirli in un pozzetto di una piastra 12 pozzetti con superficie trattata coltura tissutale standard senza rivestimento, ad una densità di 2 x 10 ⁶ cellule / ml. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO ₂ in un incubatore umidificato per 48 ore, fino a quando il cambiamento passo medio (vedere Sezione 3).
2. PBMNCs ottenuti dopo la separazione gradiente di densità
   1. Per avviare il protocollo utilizzando PBMNCs congelati dopoDensità separazione in gradiente, disgelo 1 fiala di cellule in un bagno d'acqua a 37 ° C, trasferire le cellule in 5 ml di PBMNC media. Centrifugare a 300 xg per 10 min a RT.
   2. Risospendere le cellule in 1 ml di PBMNC medio e trasferirli in un pozzetto di una piastra 12 pozzetti, ad una densità di 2 x 10 ⁶ cellule / ml. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO ₂ in un incubatore umidificato per 48 ore, fino a quando il cambiamento passo medio (vedere Sezione 3).

3. Cultura ed espansione di PBMNCs (DAY 2-13)

1. Raccogliere PBMNCs in coltura in sospensione, con una pipetta con una punta 1 ml, in un tubo da 15 ml e centrifugare a 300 xg per 10 min a RT.
2. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno PBMNC fresco.
3. Trasferire le cellule in 1 pozzetto della piastra 12 pozzetti con superficie trattata coltura tissutale standard senza rivestimento, e incubare a 37 ° C, 5% CO ₂ in un incubatore umidificato.
4. Ripetere la procedura ogni due giorni, e dividere le celle in un rapporto di 1: 2 quando raggiungono la confluenza appropriata (circa l'80%).

4. La trasfezione di PBMNCs con episomiale plasmidi (DAY 14)

Nota: Eseguire l'isolamento dei quattro plasmidi episomiale senza intergation commerciali, portando i geni pluripotenziali utilizzando un kit commerciale di purificazione plasmide e valutare la qualità dei plasmidi purificati utilizzando un'analisi gel di agarosio, secondo le istruzioni del produttore.

1. Raccogliere PBMNCs in tubo da 15 ml e contare il numero di cellule vitali (sulla base del trypan blue) ^25.
2. Centrifuga 2 x 10 ⁶ cellule a 300 xg per 10 min a RT.
3. Risospendere 2 x 10 ⁶ cellule in mix trasfezione contenente 100 ml di Resuspension Buffer T e 1 mg di ciascun DNA plasmide (una plasmide portando Oct3 / 4 e shRNA contro p53, un plasmide portando SOX2 e Klf4, unoplasmide portando L-MYC e LIN28, e un plasmide portando EGFP, per verificare l'efficienza di trasfezione).
4. Aspirare il mix trasfezione contenente le cellule in una punta microlitri 100 e inserire la pipetta con il campione verticalmente nel tubo, riempito con 3 ml di tampone elettrolitica E2, nella stazione pipetta di macchina elettroporazione, secondo le istruzioni del produttore.
5. Le cellule in modo efficiente l'elettroporazione utilizzando il seguente programma: 1.650 V, 10 msec, 3 impulsi.
6. Risospendere le cellule elettroporate (2 x 10 ⁶ cellule) in 2 ml di pre-riscaldato medio PBMNC, aggiungendo 0,25 mM sodio butirrato (NaB) e contare il numero di cellule vitali dopo protocollo elettroporazione (sulla base del trypan blue) ^25.
7. Trasferire le cellule in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti senza rivestimento, agitare delicatamente la piastra e incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO ₂ in un incubatore umidificato.
8. Il giorno dopo elettroporazione, Count il numero di cellule GFP-positive al microscopio a fluorescenza 8-10 campi casuali, al fine di valutare l'efficienza di trasfezione.
9. Mantenere le cellule transfettate senza suddivisione per 3 giorni, fino a quando li placcatura sul MEF (vedi Sezione 6).
10. Sostituire 2 ml di PBMNCs fresco medio, più 0,25 NAB mM ogni due giorni.

5. Preparare Piatti con Feeder cellule per la co-coltura (DAY 16)

1. Coat i pozzetti di una piastra da 6 pozzetti con 1 ml di matrice membrana basale per 15 min a 37 ° C e la piastra di fibroblasti embrionali di topo (MEF) ad una densità di 2 x 10 ⁵ cellule / pozzetto con 2 ml di 10% FBS conteneva DMEM (MEF medio) un giorno prima passaging le PBMNCs elettroporate sul feeder cellule MEF.

6. placcatura trasfezionati PBMNCs sul MEF (DAY 17-19)

1. Raccogliere PBMNCs in coltura in sospensione, con una pipetta con 1 ml punta, in tubo da 15 ml e centrifugare transfettate PBMNCs a 300 xg per 10 mina RT.
2. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 2 ml di terreno PBMNC fresco, più lo 0,25 NaB mm.
3. Piastra le cellule su MEF rivestite 6 pozzetti e incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO ₂ in un incubatore umidificato.
4. Dopo due giorni, aspirare il terreno e sostituirlo con 2 ml di IPSC medio composto da knockout DMEM (KO-DMEM), il 20% KO-siero sostituzione (KOSR), 1 NEAAs mm, 1% penicillina / streptomicina, 20 mm L- glutammina, 0,1 mm β-mercaptoetanolo, 10 ng FGF / ml (bFGF base) e 0,25 NaB mm.
5. Sostituire 2 ml di fresco medio iPSC ogni giorno e controllare le celle al giorno.
   Nota: A circa 22-25 giorni, le prime colonie di iPSCs dovrebbero essere visibili.

7. Raccolta e l'espansione delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) Clones (DAY 30-35)

Nota: A circa 30-35 giorni dopo la trasfezione, le colonie IPSC dovrebbero essere pronti per la raccolta e replating. L'efficienza riprogrammazione dovrebbe essere estiaccoppiato come la percentuale del numero di colonie IPSC / numero totale di cellule elettroporate, come riportato in precedenza ^26.

1. Il giorno prima passaging colonie IPSC, preparare l'alimentatore MEF in un 12-pozzetti (1,25 x 10 ⁵ cellule / pozzetto).
2. Aspirare il mezzo di MEF e cambiare con 1 ml di IPSC media con 10 ng / ml bFGF e 10 micron Y-27632. Sezionare manualmente con un ago una colonia in ogni volta sotto il microscopio da dissezione alla raccolta-cappa per ottenere una griglia, raccogliere piccoli grumi pipettando e trasferire singolarmente ciascuna in un pozzetto della piastra 12 pozzetti rivestiti con MEF.
3. Passaggio ed espandere ciascuna piastra 12 pozzetti ad una piastra da 6 pozzetti in un rapporto 1: 2, allora ogni 6 pozzetti in un rapporto 1: 4 per ulteriore moltiplicazione. Sezionare e ampliare iPSCs manualmente per i primi 2-3 passaggi (come ben descritto nella fase 7.2), quindi utilizzare una procedura enzimatica dissociazione (iniziare dal punto 7.4).
4. Per un protocollo enzima dissociazione, pulito iPSC colonies aspirando porzioni differenziati, al microscopio da dissezione alla raccolta cofano.
5. Incubare iPSCs con 1 ml di collagenasi IV (1 mg / ml) per 10 minuti a 37 ° C.
6. Aspirare la soluzione enzimatica, lavare le cellule con 1 ml di KO-DMEM e raccogliere le colonie in una provetta conica da 15 ml. Centrifugare a 100 xg per 2 minuti a temperatura ambiente.
7. Aspirare il surnatante, risospendere le colonie in 2 ml di COPSI media con 10 ng / ml bFGF e 10 pM Y-27632 e piatto su MEF rivestite 6 pozzetti (rapporto 1: 4).

8. Caratterizzazione di iPSCs (tra 5-15 Passages)

1. Fosfatasi alcalina Colorazione
   1. Cultura colonie IPSC per 3-5 giorni in IPSC medio con 10 ng / ml bFGF.
   2. Per iniziare un protocollo di fosfatasi alcalina di colorazione, sciacquare iPSCs una volta con PBS e poi fissarli con 1 ml di 4% PFA per 20 minuti a RT.
   3. Lavare le cellule tre volte con PBS per rimuovere residui di PFA.
   4. Macchia fisso celle usandoun kit commerciale alcalina fosfatasi colorazione in base alle istruzioni del produttore.
2. Immunofluorescenza
   1. Cultura colonie IPSC per 3-5 giorni in IPSC medio con 10 ng / ml bFGF.
   2. Per avviare un test di immunofluorescenza, lavare iPSCs una volta con PBS e poi fissarli con 1 ml di PFA 4% per 20 minuti a temperatura ambiente.
   3. Lavare le cellule tre volte con PBS per rimuovere residui di PFA.
   4. Trattare iPSCs fissate con 1 ml di permeabilizzazione / blocco soluzione contenente siero di capra 4%, 0,1% BSA, 0,1% Triton X-100 e 0,05% di sodio azide (NaN ₃₎ per 1 ora a RT.
   5. Aspirare la soluzione di saturazione e incubare le cellule fissate con anticorpi primari a 3% di BSA e 0.05% NaN ₃ soluzione O / N a 4 ° C (controllare la tabella materiale per la lista anticorpo primario e ha suggerito di anticorpi fattore di diluizione).
   6. Il giorno dopo, lavare iPSCs tre volte con PBS, poi incubare le cellule con Alexa Fluor 488 capra anti-topo e Alexa Flanticorpi anti-coniglio di capra UOR 555, diluito 1: 1000 in 3% BSA e 0,05% NaN soluzione _3, per 1 ora a 37 ° C.
   7. Macchiare i nuclei con DAPI (1 ug / ml) per 10 minuti a RT in scuro, seguito da tre lavaggi con PBS tempo.
3. Differenziazione dei iPSCs a corpi embrionali (EBS)
   1. Cultura colonie IPSC per 5-6 giorni in IPSC medio con 10 ng / ml bFGF.
   2. Rimuovere parti differenziate da colonie IPSC aspirando, sotto il microscopio da dissezione alla raccolta-cappuccio.
   3. Incubare iPSCs con 1 ml di collagenasi IV (1 mg / ml) per 10 minuti a 37 ° C.
   4. Aspirare la soluzione enzimatica, lavare le cellule con 1 ml di KO-DMEM e raccogliere le colonie in una provetta conica da 15 ml. Centrifugare a 100 xg per 2 minuti a temperatura ambiente.
   5. Aspirare il surnatante e risospendere le colonie in 2 ml di EB mezzo composto KO-DMEM, 20% definito di siero fetale bovino (FBS), 1 NEAAs mM, 1% di penicillina / streptomicina, 20 mM L-glutammina, 0,1 mM46; -mercaptoetanolo.
   6. Piatto colonie IPSC in sospensione per 6 giorni su fissaggio 6 pozzetti ultra-bassa, in modo da consentire la formazione di sferoidali corpi embrionali tridimensionali (EBS). Cambia 2 ml di fresco medio EB ogni due giorni.
   7. Il giorno 7, raccogliere EBs e piastra sul 0,1% di gelatina rivestito 6 pozzetti in 2 ml di EB medio e mantenere EBs nella differenziazione per 20 giorni.
   8. Cambia 2 ml di fresco medio EB ogni due giorni.
4. qRT-PCR per l'espressione genica di analisi
   1. Cultura colonie IPSC per 5-6 giorni in IPSC medio con 10 ng / ml bFGF.
   2. Estratto RNA totale da PBMNCs, iPSCs o EBs utilizzando 1 ml di reattivo commerciale in conformità con le istruzioni del produttore.
   3. Valutare la concentrazione di RNA e la purezza con metodi adatti come l'uso di uno spettrofotometro (RNA di alta qualità con A ₂₆₀ / A ₂₈₀ e A ₂₆₀ / A ₂₃₀ rapporti> 1.8) ^27.
   4. ControllareIntegrità dell'RNA utilizzando un kit commerciale secondo il protocollo del produttore (di alta qualità RNA RQI> 9.5) ^28.
   5. Eseguire una reazione di trascrizione inversa in 1 mg di RNA totale utilizzando un kit trascrittasi inversa commerciale secondo le istruzioni del produttore.
   6. Preparare le miscele contenenti qPCR 5 ng di cDNA, 7,5 ml SYBR GREEN Supermix, 2 ml di 5 micron primer (forward: 1 ml e reverse: 1 ml) e 6 ml di / acqua priva di DNasi RNasi per ogni reazione ^29.
   7. Eseguire la qRT-PCR utilizzando il seguente programma: una denaturazione iniziale a 95 ° C per 10 minuti, seguito da 40 cicli suddivisi in una fase di denaturazione a 95 ° C per 15 sec e di primer ricottura ed estensione fase a 60 ° C per 45 sec ^29.
   8. Normalizzare l'espressione di altri geni che utilizzano GAPDH come le pulizie gene ²⁸ (vedi i primer elencati nella tabella 1).
5. qPCRper Transgene Esclusione
   1. Estrarre il DNA da PBMNCs o iPSCs utilizzando 1 ml di buffer di lisi contenente 50 mM Tris, EDTA 100 mm, NaCl 100 mm, 1% sodio dodecilsolfato (SDS) e 20 mg / ml proteinasi K.
   2. Aggiungere un volume uguale (1 ml) di 100% isopropanolo, miscelare capovolgendolo tre volte al fine di consentire la precipitazione del DNA e centrifugare a 10.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
   3. Eliminare il supernatante, lavare il pellet di DNA con 1 ml di etanolo al 70% e centrifugare a 10.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare e scartare il surnatante e risospendere in / acqua priva di DNasi RNasi.
   4. Valutare la concentrazione del DNA e la purezza con metodi adatti come l'uso di uno spettrofotometro (RNA di alta qualità con A ₂₆₀ / A ₂₈₀ e A ₂₆₀ / A ₂₃₀ rapporti> 1.8) ^27.
   5. Preparare le miscele contenenti qPCR 5 ng di DNA stampo, 7,5 microlitri SYBR GREEN Supermix, 2 ml di 5 micron primer (forward: 1 ml e reverse: 1 ml) e 6 &# 181; l di / acqua priva di DNasi RNasi per ogni reazione ^29.
   6. Normalizzare l'espressione di specifici plasmide episomiale EBNA-1 gene utilizzando FBX-15 come le pulizie gene ²⁹ (vedere i primer elencati nella tabella 1).
6. Analisi del cariotipo
   1. Cultura colonie IPSC per 5-6 giorni sulla piastra rivestita seminterrato matrice membrana senza alimentatore con uno spot definito, terreno di mantenimento senza alimentatore per iPSCs, seguendo le istruzioni del produttore.
   2. Per avviare il protocollo di analisi cariotipo, staccare colonie IPSC con 1 ml di soluzione di distacco cellulare per 5 min a 37 ° C, fino ad ottenere la dissociazione singola cellula.
   3. Raccogliere cellule e centrifugare a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
   4. Risospendere iPSCs in 2 ml di un mezzo appositamente sviluppato per coltura di cellule per le tecniche di diagnosi prenatale. IPSCs Piatto monocellulari sulla membrana basale matrici rivestite piatti di vetro e incubare a 37 ° C, 5% CO _{2 <}/ Sub> incubatrice.
   5. Dopo 2-4 giorni, aggiungere 10 microlitri / ml colchicina direttamente alle culture e incubare per 3 ore a 37 ° C, 5% CO ₂ in un incubatore umidificato.
   6. Aspirare il mezzo e incubare iPSCs in 1 ml di una soluzione ipotonica (0,6% di citrato di sodio e cloruro di potassio 0,13%) per 10 minuti a RT.
   7. Risciacquare le cellule con 1 ml di soluzione di acido acetico al 5% e fissare con iPSCs / soluzione metanolica di acido acetico (rapporto 3: 1) in una macchina con temperatura controllata e umidità (28 ° C, 42% UR).
   8. Immergere e le cellule macchia fissa con la soluzione Quinacrine per 15-20 minuti a temperatura ambiente al buio (per ottenere Q-banding) ^30.
   9. Acquisire metafasi di cellule al microscopio a fluorescenza ad ingrandimento 100X ^29.

Risultati

In questo studio un protocollo semplice ed efficace per la generazione di iPSCs-virali libero da riprogrammazione della PBMNCs isolati da buffy coat congelati dopo centrifugazione del sangue intero e confronto con riprogrammazione della PBMNCs ottenute dopo la separazione gradiente di densità è riportato. La figura 1A mostra una rappresentazione schematica di il protocollo dettagliato. Dopo lo scongelamento, i PBMNCs isolato, mostrando una tipica forma arrotondata, vengono espanse in specifico terreno...

Discussione

In passato, l'unico modo per ottenere cellule staminali pluripotenti umane che trasportano una particolare mutazione genetica è stato quello di reclutare genitori sottoposti a diagnosi genetica pre-impianto e generare cellule staminali embrionali da loro blastocisti scartate ^31,32. Utilizzando un approccio riprogrammazione, i ricercatori possono ora generare iPSCs di pazienti portatori di praticamente qualsiasi genotipo. La possibilità di partire da una linea cellulare paziente-specifica ed una fonte fa...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube	Terumo	VF-054SBCS07
Ammodium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Potassium bicarbonate	Sigma-Aldrich	60339
EDTA disodium powder	Sigma-Aldrich	E5134	0.5 M solution
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare Life Sciences	17-5442-02	Polysucrose solution for density gradient centrifugation
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)	Gibco	21056-023	No phenol red
Ham's F-12	Mediatech	10-080-CV
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X)	Gibco	51500-056	1X (Stock: 100X)
Chemically Defined Lipid Concentrate	Gibco	11905031	1X (Stock: 100X)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A8960
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	Final Concentration at 200 µM
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF)	PeproTech	300-07	100 ng/ml (Stock:100 µg/ml)
Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3)	PeproTech	200-03	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1)	PeproTech	100-11	40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml)
Recombinant Human Erythropoietin (EPO)	R&D Systems	287-TC-500	2 U/ml (Stock: 50 U/ml)
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	1 μM (Stock: 1 mM)
Human Holo-Transferrin	R&D Systems	2914-HT	100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml)
Amniomax II	Gibco	11269016	Medium for cytogenetic analysis
mTeSR1	StemCell Technologies	5850	Medium for iPSC feeder-free culture
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828-028
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco	11140-050
2-Mercaptoethanol	Gibco	31350-010	0.1 mM (Stock: 50 mM)
Sodium Butyrate	Sigma-Aldrich	B5887	0.25 mM (Stock: 0.5 M)
Recombinant Human FGF basic, 145 aa	R&D Systems	4114-TC	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503	10 µM (Stock: 10 mM)
Fetal Defined Bovine Serum	Hyclone	SH 30070.03
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution	Merck-Millipore	ES-006-B
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced	BD Biosciences	354230
Collagenase, Type IV	Gibco	17104-019	1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)
Accutase	PAA Laboratories GmbH	L11-007	Cell detachment solution
Mouse Embryonic Fibroblast (CF1)	Global Stem	GSC-6201G	1*106 cells/6 well plate
Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hSK	Addgene	27078	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hUL	Addgene	27080	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-EGFP	Addgene	27082	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Alkaline Phosphatase Staining Kit	Stemgent	00-0009
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody	Merck-Millipore	MAB4304	1/250
Anti-TRA-1-60 Antibody	Merck-Millipore	MAB4360	1/250
Anti-TRA-1-81 Antibody	Merck-Millipore	MAB4381	1/250
Anti-Oct-3/4 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-9081	1/500
Anti-Nanog Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-33759	1/500
Anti-Troponin I Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-15368	1/500
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody	Sigma-Aldrich	A7732	1/250
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody	Covance Research Products Inc	MMS-435P-100	1/500
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody	Calbiochem	657012	1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse	Molecular Probes	A-11029	1/1000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit	Molecular Probes	A-21429	1/1000
Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate	Corning	3471
Trizol Reagent	Ambion	15596-018	reagent for RNA extraction
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Invitrogen	11754050	Reverse transcriptase kit
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5124
CFX96 Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	185-5195
Experion Automated Electrophoresis System	Bio-Rad	700-7000	Instrument to check RNA integrity
Experion RNA Highsense Analysis kit	Bio-Rad	7007105	Reagent kit to check RNA integrity
Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 )	Zeiss	495007
NeonTransfection System 100 µl Kit	Invitrogen	MPK10025	Reagent kit for electroporation
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK5000	Instrument used for electroporation
NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000	Instrument for DNA/RNA quantification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit