نظام مبسط لMechanosensing تقييم خلية وDurotaxis<em&gt; في المختبر</em

Summary

Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

Abstract

تكوين والميكانيكية خصائص المصفوفة خارج الخلية تختلف اختلافا كبيرا بين أنواع الأنسجة. هذا الضام سدى النسيج التنوع إلى حد كبير سلوك الخلية الآثار لتنظيم عمليات طبيعية ومرضية بما في ذلك تكاثر الخلايا، والتمايز، التصاق الإشارات والهجرة الاتجاه. في هذا الصدد، والقدرة الفطرية لبعض أنواع الخلايا إلى الهجرة نحو أشد، أو أقل المتوافقة ويشار إلى durotaxis الركيزة المصفوفة. هذه الظاهرة تلعب دورا مهما أثناء التطور الجنيني وإصلاح الجرح وغزو الخلايا السرطانية. هنا، نحن تصف فحص بسيط لدراسة durotaxis، في المختبر، وذلك باستخدام polydimethylsiloxane (PDMS) ركائز. إعداد وصف durotaxis غرف يخلق واجهة صلابة بين هلام PDMS لينة نسبيا وساترة الزجاج جامدة. في المثال المقدمة، وقد استخدمنا هذه durotaxis غرف لإثبات دور للcdc42 / RAC1 GTPase تفعيل المتواجدفي، cdGAP، في mechanosensing وdurotaxis التنظيم في خلايا عظمية U2OS الإنسان. هذا الاختبار هو قابلية للتكيف مع أنواع الخلايا الأخرى و / أو ضربة قاضية للبروتينات أخرى من المصالح لاستكشاف دور كل منهما في mechanosignaling وdurotaxis.

Introduction

وتتألف المصفوفة خارج الخلية (ECM) من مجموعة معقدة من البروتينات الهيكلية ويشابك بما في ذلك الكولاجين، فبرونيكتين و laminin. على الرغم من أنها راسخة بأن ECM يوفر الدعم الهيكلي المهم لأنسجة الخلوية، وهناك أدلة متزايدة تشير إلى أن الخلايا تستجيب بشكل فعال للتغيرات الفيزيائية في البيئة ECM لتنظيم العمليات الخلوية المتنوعة بما في ذلك بقاء الخلية، التمايز والهجرة الخلية. على سبيل المثال، يمكن أن الاختلافات في صلابة ECM تدفع الخلايا الجذعية الوسيطة نحو الأنساب مختلفة، مع ركائز لينة (~ 1 كيلو باسكال) تعزيز الأنساب العصبية بينما شديدة (~ 25 كيلو باسكال) ركائز تعزيز التمايز عظمي المنشأ ^1. وبالمثل، قد أظهرت زيادة في صلابة انسجة مصفوفة لتعزيز الثدي تكون الأورام الخلايا الظهارية والغزو إلى ^2،3 الأنسجة المحيطة بها.

مما يثير الاهتمام في هذا mechanosignنتائج النشاط aling في عملية تعرف باسم durotaxis، التي تهاجر الخلايا بشكل تفضيلي نحو الركيزة أكثر جمودا ^4،5. الخلايا تستشعر باستمرار الخصائص الفيزيائية للبيئتهم خارج الخلية من خلال إنتغرين مستقبلات ملزمة لECM. وهذا، بدوره، ويشجع على تراكم العديد من البروتينات الهيكلية ويشير إلى المجالات الخاصة بهم حشوية لدفع تشكيل هياكل لاصقة المعروفة باسم التصاقات تنسيق أو اتصالات التنسيق ^6،7. منذ integrins ليس لها النشاط الأنزيمي الأصيل، يتم ترحيل الإشارات من ECM من خلال هذه البروتينات التبعي لتنسيق استجابة الخلية لتغيير بيئتهم ^8. وفقا لذلك، وتحديد وتوصيف البروتينات الرئيسية المشاركة في تنظيم mechanosignaling وdurotaxis هو مجال هام من مجالات التحقيق.

وقد تم تطوير نظم نموذج مختلف لدراسة durotaxis في المختبر، ولكن معظم لديهاتستخدم المغلفة الكولاجين ركائز بولي أكريلاميد ^4. ومع ذلك، فإن إعداد ركائز بولي أكريلاميد يمكن أن يكون تحديا فنيا ويجب أن يكون الكولاجين المستخدمة في هذه المقايسات crosslinked كيميائيا لالركيزة ^9. وقد ثبت Polydimethylsiloxane (PDMS) ركائز لعرض خصائص ميكانيكية مشابهة لركائز بولي أكريلاميد ^10. ومع ذلك، يتم ببساطة عن طريق خلط نسبة من القاعدة إلى crosslinker إعداد ركائز PDMS ويمكن أن تطلى هذه ركائز مع بروتينات ECM دون الحاجة إلى يشابك الكيميائي، مما يجعل PDMS أداة أسهل لدراسة آثار صلابة على سلوك الخلية. هنا، نحن تصف كيفية إعداد غرفة durotaxis بسيطة التي تم دمج PDMS الركيزة لينة مع ساترة الزجاج جامدة.

الفحص، على النحو المبين أدناه، يوفر طريقة سريعة وبسيطة لدراسة durotaxis. لهذه الدراسة استخدمنا خلايا عظمية U2OS الإنسان جنبا إلى جنب مع سيرنا بوساطةضربة قاضية من cdGAP لدراسة دور هذا البروتين التصاق التنسيق في durotaxis ^11. الأهم من ذلك، هذا البروتوكول يمكن تكييفه بسهولة لتلبية الاحتياجات الفردية. قد تكون بديلا أنواع الخلايا الأخرى للخلايا U2OS ويمكن طرقت أي بروتين أسفل أو overexpressed لتحديد الآثار المترتبة على سلوك الخلية أثناء durotaxis. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لإدراج البروتينات الموسومة fluorescently لتحليل ديناميتها والسلوك باستخدام FRAP أو الحنق النهج.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد Durotaxis الدوائر

1. لإعداد احدة 6-جيدا لوحة زراعة الأنسجة، الفارغة التوازن مع أنبوب مخروطي 50 مل. تزن بها حوالي 10 غرام من الحل قاعدة PDMS في أنبوب 50 مل (الحل هو لزج جدا).
2. ل90: 1 الركيزة (الامتثال لل~ 1 كيلو باسكال)، تقسيم الوزن يقاس من الحل قاعدة PDMS في أنبوب 90 لتحديد المبلغ الصحيح من حل crosslinker الحاجة. إضافة كمية محسوبة من الحل crosslinker PDMS إلى نفس الأنبوب.
   مثال: 10 جم / 90 = 0.11 غرام. إضافة 0.11 غرام من حل crosslinker PDMS إلى حل قاعدة PDMS.
   كلاهما قدم قاعدة وcrosslinker الحلول في عدة PDMS: ملاحظة.
3. مزيج بقوة PDMS خليط قاعدة / crosslinker لمدة 5 دقائق على RT باستخدام ملعقة صغيرة. في هذه المرحلة سوف تحتوي على خليط عدد كبير من فقاعات الهواء.
4. أجهزة الطرد المركزي الركيزة PDMS في جهاز للطرد المركزي الفوق لمدة 5 دقائق في 50 x ج في RT لإزالة صغيريBLES. إذا لا يزال هناك فقاعات بعد 5 دقائق، الطرد المركزي مرة أخرى.
5. ماصة 1 مل 90: 1 PDMS الركيزة في كل بئر من زراعة الأنسجة المعالجة لوحة 6 جيدا. كل ما تبقى من فقاعات الهواء الموجودة في PDMS يمكن القضاء عليها في هذه المرحلة التي ظهرت عليها باستخدام إبرة 21 G. السماح للPDMS لنشر لمدة 30 دقيقة في البئر.
6. يغلي 12 ملم الزجاج # 1 coverslips في الماء المقطر لمدة 5 دقائق. كرر مرتين وتخزين لل coverslips في الماء المقطر.
7. مكان واحد، ساترة المجففة في كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة عن طريق لمس بلطف جانب واحد من ساترة في حل PDMS ثم إسقاط ساترة على PDMS. كما يستقر ساترة، وسوف تبدأ PDMS للانقضاض على حواف ساترة، ولكن لن تغطي بالكامل. وهذا يولد التفاعل بين PDMS والزجاج بعد المعالجة (انظر الشكل 1A، B).
8. احتضان لوحة عند 70 درجة مئوية في الفرن لمدة 16 ساعة لعلاج (تصلب) وPDMS. وضع بلاته في غطاء خلية ثقافة والأشعة فوق البنفسجية تعقيم لمدة 10 دقيقة.
   ملاحظة: فمن الأفضل أن تجعل من لوحات داخل بضعة أيام من الاستخدام. ومع ذلك، قد تكون ملفوفة لوحات في Parafilm دون أي العازلة وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع من دون أي انخفاض ملحوظ في الجودة.

2. خلية التصفيحات

ملاحظة: إذا كان دراسة تأثير بوساطة سيرنا ضربة قاضية، نفذ ضربة قاضية باستخدام إرشادات الشركة المصنعة أو بروتوكول الأمثل لنوع من الخلايا في الاختيار.

1. معطف كل durotaxis الغرفة مع 1 مل من 10 ميكروغرام / مل فبرونيكتين في برنامج تلفزيوني بدون الكالسيوم والمغنيسيوم لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. بدلا من ذلك، فبرونيكتين يمكن تطبيقها اليوم قبل التحليل التي يحتضنها PDMS مع 10 ميكروغرام / مل فبرونيكتين في برنامج تلفزيوني لمدة 16 ساعة في 4 درجات مئوية. تأكد من المغمورة كامل السطح في فبرونيكتين في حل PBS.
2. تحضير للحرارة التشويه والتحريف 1٪ BSA. تزن 0.5 غرام BSA وحله في 50 مل من برنامج تلفزيوني.فلتر تعقيم الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرون والحرارة على 80 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة.
   ملاحظة: يعد هذا الحل اليوم قبل الخلية الطلاء وتخزينها في 4 درجات مئوية.
3. نضح حل فبرونيكتين ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من التشويه والتحريف الحرارة BSA في برنامج تلفزيوني على كل بئر واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
4. ويعرض للتريبسين عدد الخلايا في الاختيار بينما الدوائر durotaxis يتم حظر مع الحرارة التشويه والتحريف BSA.
5. لوحة 1 × 10 ⁵ الخلايا في حجم 2 مل في كل بئر من غرفة durotaxis، وذلك باستخدام وسائل الإعلام المطلوبة لنوع خلية معينة في الاختيار. السماح للخلايا الالتزام وتنتشر على الركيزة لمدة 4 ساعة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2.
   تتم المحافظة على الخلايا U2OS بشكل روتيني في DMEM مع 10٪ FBS، على أن تستكمل مع 2 مم L-الجلوتامين، 1 ملي البيروفات الصوديوم، و 10 وحدة دولية / مل البنسلين، 10 ميكروغرام / مل الستربتومايسين: ملاحظة.
   ملاحظة: عدد الخلايا المستخدمة في هذا المثال هو الأمثل لخلايا U2OS. قد تكون هناك حاجة الأمثل لأنواع الخلايا الأخرى. هذه الكثافة يعطي الخلايا مساحة كافية للهجرة دون تفاعلات كبيرة مع الخلايا الأخرى.

التصوير 3. تعيش خلية

1. أداء تصوير الخلايا الحية على مجهر مقلوب، وذلك باستخدام النقيض من المرحلة مع الهدف 10X. ينبغي تركيب المجهر مع، غرفة ترطيب البيئة المغلقة، والسماح السيطرة على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية و CO ₂ 5٪ خلال التصوير على المدى الطويل.
2. بعد انتشار الخلايا لمدة ما يقرب من 3.5 ساعة، تجميع لوحة في غرفة المجهر. السماح للعينة (ق) للتوازن في الغرفة لمدة 30 دقيقة.
3. إعداد الآلية، متعددة نقطة الزائر على المجهر إن وجدت. التركيز على واجهة بين 90: 1 PDMS وساترة الزجاج واختيار نقاط لصورة في كل مكان واجهة بمتوسط ​​40 نقطة في durotaxis الغرفة. صورة الخلايا كل 10 دقيقة لمدة تصل إلى 16 ساعة.
   ملاحظة: إعادةسوف جيون من الفائدة تظهر كما سطرين، مع الخط الخارجي المقابل لحافة ساترة والخط الداخلي المقابلة إلى واجهة الفعلية بين PDMS وساترة. انظر الشكل 1B.

تحليل 4. البيانات

1. توليد جدول بيانات كما في الجدول 1.
2. عد عدد من الأحداث المعبر من PDMS على سطح الزجاج، والعكس بالعكس من كل فيلم ولدت. تسجيل عدد من الأحداث معبر في العمود المناسب في جداول اكسل.
   ملاحظة: يتم تعريف الحدث المعبر باعتباره نواة الخلية تمر عبر الحدود بين PDMS والزجاج في أي من الاتجاهين.
3. لتحديد المعابر متعددة، حساب عدد المرات الخلية عبرت الواجهة. يجب تسجيل هذا الرقم في العمود التفوق الموافق الركيزة التي كانت تقع الخلية في نهاية الفيلم. تكرار التحليل لكل خلية التي تعبر واجهة في تيانه الفيلم. استبعاد الخلايا التي تهاجر من مجال الرؤية أثناء التصوير.
   ملاحظة: من المهم أيضا للتحقق، من قبل خلية العد في بداية التجربة، أن الخلايا قادرة على الالتزام بالتساوي على PDMS المغلفة فبرونيكتين والواجهات الزجاجية ساترة.
4. حساب النسبة المئوية للخلايا التي هاجرت من PDMS على سطح الزجاج (أي خضع durotaxis). إضافة عدد من عبور الأحداث من الصعب على لينة وأحداث معبر المتعددة التي انتهت يوم بجد والقسمة على العدد الإجمالي للأحداث المعبر.
5. حساب النسبة المئوية للمعابر متعددة بقسمة عدد من المعابر متعددة من قبل عدد من المعابر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويرد التخطيطي للغرفة durotaxis في الشكل 1A. لينة PDMS الركيزة: ينتشر (90 خليط 1 من قاعدة PDMS إلى crosslinker الحلول) في صحن 6 جيدا ويوضع ساترة الزجاج على رأس PDMS، الذي ثم يغطي جزئيا السطح العلوي للساترة، وبالتالي خلق واجهة بين اثنين من ركائز الامتثال مختلفة. صلابة من PD...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هنا نحن تصف فحص بسيط لدراسة durotaxis في الخلايا المهاجرة. A القوة الرئيسية من هذا الاختبار هو سهولة إعداد غرف durotaxis باستخدام PDMS. صلابة من ركائز يمكن التلاعب بها بسهولة عن طريق تغيير نسبة PDMS حل قاعدة لcrosslinker للسماح للدراسة الجمود المختلفة في الفحص. ومع ذلك، واحدة الحد المحت...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	3097358-1004	Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit
#1 Cover glass 12 mm	Fisher Scientific	12-545-82
6-well plate	Celltreat	229106
DMEM	Cellgro	15-017-CM
L-Glutamine	Cellgro	25-005-CI
Sodium Pyruvate	Fisher Scientific	BP356-100
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-CI
Fibronectin	BD Biosciences	610077
PBS	Invitrogen	21600-044
Falcon tubes	Celltreat	229456
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
U2OS cells	ATCC	HTB-96