Um sistema simplificado para a Avaliação celular Mechanosensing e Durotaxis<em&gt; In Vitro</em

Resumo

Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

Resumo

As propriedades mecânicas da composição e da matriz extracelular são altamente variáveis ​​entre tipos de tecidos. Este tecido conjuntivo diversidade estroma grandemente impactos comportamento celular para regular os processos normais e patológicos, incluindo a proliferação celular, diferenciação, migração e adesão de sinalização direccional. A este respeito, a capacidade inata de determinados tipos de células para migrar em direcção um substrato mais rígido, ou menos complacente matriz é referida como durotaxis. Este fenómeno desempenha um papel importante durante o desenvolvimento embrionário, cicatrização de feridas e a invasão de células do cancro. Aqui, nós descrevemos um ensaio simples para estudar durotaxis, in vitro, utilizando PDMS (polidimetilsiloxano) substratos. Preparação do descrito durotaxis câmaras cria uma interface entre a rigidez do gel PDMS relativamente macio e uma lamela de vidro rígida. No exemplo fornecido, temos usado estes durotaxis câmaras para demonstrar um papel para o cdc42 / Rac1 GTPase ativando proteem, cdGAP, em mechanosensing e durotaxis regulamentação em células U2OS osteossarcoma humano. Este ensaio é facilmente adaptável a outros tipos e / ou knockdown de outras proteínas de interesse celulares para explorar seus respectivos papéis na mechanosignaling e durotaxis.

Introdução

A matriz extracelular (ECM) é constituído por uma matriz complexa de proteínas estruturais e de reticulação, incluindo colagénio, fibronectina e laminina. Embora seja bem estabelecido que a ECM fornece um suporte estrutural importante para os tecidos celulares, há evidências crescentes de que indicam que as células respondem activamente a mudanças físicas no seu ambiente de ECM para regular processos celulares, incluindo diversas sobrevivência celular, diferenciação e migração da célula. Por exemplo, diferenças na rigidez do ECM podem conduzir as células estaminais mesenquimais para linhagens diferentes, com substratos macios (~ 1 kPa) a promoção de linhagens neurogénicos enquanto substratos rígidos (~ 25 kPa) promover a diferenciação osteogénica ^1. Da mesma forma, foi demonstrado um aumento na rigidez da matriz estromal para promover a tumorigénese célula epitelial mamaria e invasão do tecido circundante ^2,3.

Um aspecto particularmente interessante deste mechanosignaling resultados da actividade em um processo conhecido como durotaxis, em que as células migram preferencialmente para um substrato mais rígido ^4,5. Células sentir constantemente as características físicas do ambiente extracelular através da ligação do receptor de integrina ao ECM. Este, por sua vez, promove a acumulação de numerosas proteínas estruturais e de sinalização para os seus domínios citoplasmáticos para conduzir a formação de estruturas adesivas conhecidas como adesões focais ou contactos focais ^6,7. Dado que as integrinas não têm actividade enzimática inerente, os sinais são transmitidos a partir do ECM através destas proteínas acessórias para coordenar a resposta da célula ao seu ambiente em mudança ^8. Consequentemente, a identificação e caracterização das proteínas-chave envolvidas na regulação mechanosignaling durotaxis e é uma área importante de investigação.

Vários sistemas de modelos têm sido desenvolvidos para estudar durotaxis in vitro, mas a maioria têmutilizados substratos de poliacrilamida revestidos com colagénio ^4. No entanto, a preparação dos substratos de poliacrilamida pode ser tecnicamente exigente e o colagénio utilizado nestes ensaios devem ser quimicamente reticulado ao substrato ^9. Polidimetilsiloxano (PDMS) substratos têm mostrado exibir propriedades mecânicas comparáveis ​​aos substratos ^de poliacrilamida a 10. No entanto, os substratos PDMS são preparadas simplesmente misturando uma proporção de base para o agente de reticulação e esses substratos podem ser revestidos com proteínas de ECM sem a necessidade de reticulação química, tornando assim mais fácil PDMS uma ferramenta para estudar os efeitos de rigidez no comportamento de células. Aqui, nós descrevemos como preparar uma câmara durotaxis simples em que um substrato macio PDMS é integrado com uma lamela de vidro rígida.

O ensaio, conforme descrito abaixo, proporciona um método rápido e simples para estudar durotaxis. Para este estudo foram utilizadas células de osteossarcoma U2OS humanos, combinado com siRNA mediadaknockdown de cdGAP para estudar o papel desta proteína de adesão focal em durotaxis ^11. É importante ressaltar que este protocolo pode ser facilmente adaptado às necessidades individuais. Outros tipos celulares podem ser substituídos para as células U2OS e qualquer proteína pode ser batido ou sobre-expresso para determinar os efeitos sobre o comportamento das células durante durotaxis. Além disso, este protocolo pode ser adaptado para incorporar proteínas fluorescente etiquetado para analisar sua dinâmica e comportamento usando FRAP ou FRET abordagens.

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Protocolo

1. Preparação de Durotaxis Chambers

1. Para preparar uma placa de 6 poços de cultura de tecidos, tarar a balança com um tubo cónico de 50 ml. Pesar aproximadamente 10 g de solução de base de PDMS no tubo de 50 ml (a solução é bastante viscosa).
2. Para uma 90: 1 substrato (Conformidade de ~ 1 kPa), dividir o peso medido da solução de base de PDMS no tubo por 90 para determinar a quantidade correcta de agente reticulante solução necessário. Adicionar a quantidade calculada da solução de agente reticulante PDMS ao mesmo tubo.
   Exemplo: 10 g / 90 = 0,11 g. Adicionar 0,11 g da solução de agente de reticulação à solução PDMS base de PDMS.
   NOTA: A base e do agente reticulante soluções são ambos fornecidos no kit de PDMS.
3. Misturar vigorosamente a mistura de base / agente de reticulação de PDMS durante 5 min à temperatura ambiente usando uma pequena espátula. Nesta fase, a mistura conterá um grande número de bolhas de ar.
4. Centrifuga-se o substrato de PDMS numa centrífuga de bancada durante 5 minutos a 50 xg à temperatura ambiente para remover a bubbles. Se ainda houver bolhas após a 5 min, centrifugar novamente.
5. Pipete 1 mL de 90: 1 PDMS substrato em cada poço de cultura de tecidos de 6 cavidades tratadas placa. As bolhas de ar restantes presentes nos PDMS pode ser eliminado nesta fase por popping-los usando uma agulha 21 G. Permitir que o PDMS para espalhar durante 30 min no poço.
6. Ferva 12 milímetros de vidro # 1 lamelas em água destilada por 5 min. Repita duas vezes e armazenar as lamelas em água destilada.
7. Coloque um, secou-se a lamela em cada poço da placa de cultura de tecidos tocando suavemente um lado da lamela na solução, em seguida, deixar cair o PDMS lamela para o PDMS. À medida que a lamela se instala, o PDMS começará a invadir ao longo dos bordos da lamela, mas não se cobri-lo completamente. Isto vai gerar uma interface entre o PDMS e de vidro após a cura (ver Figura 1A, B).
8. Incubar a placa a 70 ° C num forno durante 16 horas para curar (Harden) do PDMS. Coloque o plate em uma capa de cultura de células e UV esterilizar durante 10 min.
   NOTA: É melhor fazer as placas dentro de alguns dias de uso. No entanto, as placas podem ser envoltos em parafilme sem qualquer tampão e armazenado a 4 ° C durante até 2 semanas, sem qualquer queda significativa na qualidade.

2. celular Galvanização

NOTA: Se se estudar o efeito do knockdown mediada por siRNA, executar o knockdown utilizando as instruções do fabricante ou o protocolo optimizado para o tipo de célula de escolha.

1. Revestimento durotaxis cada câmara com 1 ml de 10 ug / ml de fibronectina em PBS sem cálcio e magnésio durante 1 hora a 37 ° C. Alternativamente, a fibronectina pode ser aplicado no dia antes da análise por incubação das PDMS com 10 ug / ml de fibronectina em PBS durante 16 horas a 4 ° C. Certifique-se de toda a superfície é submersa na solução de fibronectina em PBS.
2. Prepare desnaturado termicamente 1% BSA. Pesar 0,5 g de BSA e dissolvê-lo em 50 ml de PBS.Filtro de esterilizar a solução através de um filtro de 0,22 um e de calor a 80 ° C durante 12 min.
   Nota: Preparar esta solução no dia antes da célula de galvanização e armazenar a 4 ° C.
3. Aspirar a solução de fibronectina e lavar 3 vezes com PBS. Adicionar 1 ml de BSA desnaturado por calor em PBS a cada poço e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
4. Trypsinize e contar as células de escolha, enquanto as câmaras durotaxis estão bloqueando com o calor desnaturado BSA.
5. Placa 1 x 10 ⁵ células em um volume de 2 ml em cada poço da câmara durotaxis, usando os meios necessários para o tipo particular de célula de escolha. Permitir que as células aderir e espalhada sobre o substrato durante 4 horas numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO _2.
   NOTA: As células U2OS são rotineiramente mantidas em DMEM com 10% de FBS, suplementado com 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, e 10 UI / ml de penicilina, 10 ug / ml de estreptomicina.
   NOTA: O número de células utilizado neste exemplo é optimizado paraU2OS células. Optimização para outros tipos de células pode não ser necessária. Esta densidade dá as células espaço suficiente para migrar sem interações significativas com outras células.

Imagem 3. Em células vivas

1. Execute imagens de células vivas em um microscópio invertido, usando contraste de fase com uma objetiva de 10X. O microscópio deve ser equipado com uma câmara humidificada ambiente fechado, permitindo o controlo de temperatura a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante o exame a longo prazo.
2. Depois que as células se espalharam por cerca de 3,5 horas, montar a placa na câmara de microscópio. Deixar a amostra (s) para equilibrar na câmara durante 30 min.
3. Configure automatizado, multi-ponto de visitação no microscópio, se disponível. Concentre-se na interface entre as 90: 1 PDMS ea lamela de vidro e escolher aponta para imagem em todo o interface com um média de 40 pontos por durotaxis câmara. Imagem das células a cada 10 minutos até 16 horas.
   NOTA: A região de interesse aparece como duas linhas, com a linha exterior, correspondente ao bordo da lamela e a linha interna correspondente à interface real entre o PDMS e a lamela. Ver Figura 1B.

Análise 4. Dados

1. Gerar uma planilha como na Tabela 1.
2. Contar o número de eventos de passagem a partir dos PDMS à superfície do vidro e vice-versa de cada filme gerado. Grave o número de eventos de passagem na coluna apropriada na planilha excel.
   NOTA: Um evento de cruzamento é definido como o núcleo da célula, passando através da fronteira entre o PDMS e de vidro em um ou outro sentido.
3. Para quantificar múltiplos cruzamentos, contar o número de vezes que a célula atravessada a interface. Este número deve ser gravado na coluna Excel correspondente ao substrato sobre o qual a célula foi localizado no final do filme. Repita a análise para cada célula que atravessa a interface em tfilme que ele. Excluir células que migram para fora do campo de visão durante o exame.
   NOTA: É também importante para verificar, por contagem de células no início da experiência, as células que são capazes de aderir igualmente aos PDMS revestido com fibronectina e superfícies de lamela de vidro.
4. Calcula-se a percentagem de células que migraram a partir de PDMS para a superfície do vidro (isto é, submetidos a durotaxis). Adicione o número de cruzar eventos de suave a difícil e os múltiplos eventos de passagem, que terminou no disco e dividir pelo número total de eventos de passagem.
5. Calcula-se a percentagem de passagens múltiplas através da divisão do número de passagens múltiplas pelo número total de cruzamentos.

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Resultados

Um esquema da câmara durotaxis é mostrado na Figura 1A. Substrato PDMS macio (uma 90: 1 mistura de base de PDMS de reticulador soluções) é espalhada em uma 6 bem prato e uma lamela de vidro é colocado no topo do PDMS, que, em seguida, cobre parcialmente a superfície superior da lamela, criando, assim, uma interface entre os dois substratos de conformidade diferente. A rigidez do substrato macio PDMS é ~ 1 kPa, o que é comparável ao cumprimento típica do tecido do cérebro, en...

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Discussão

Aqui nós descrevemos um ensaio simples para estudar durotaxis em células migrando. Uma grande força deste ensaio é a facilidade de preparação das câmaras durotaxis utilizando PDMS. A rigidez dos substratos pode ser facilmente manipulado por alteração da proporção de solução de base de PDMS de agente de reticulação para permitir o estudo de vários elementos de rigidez no ensaio. No entanto, uma limitação potencial do sistema é que apenas as células são expostas a uma única mudança na rigidez do sub...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	3097358-1004	Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit
#1 Cover glass 12 mm	Fisher Scientific	12-545-82
6-well plate	Celltreat	229106
DMEM	Cellgro	15-017-CM
L-Glutamine	Cellgro	25-005-CI
Sodium Pyruvate	Fisher Scientific	BP356-100
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-CI
Fibronectin	BD Biosciences	610077
PBS	Invitrogen	21600-044
Falcon tubes	Celltreat	229456
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
U2OS cells	ATCC	HTB-96